Пептиды эпитопов mybl2 и содержащие их вакцины

Пептиды эпитопов mybl2 и содержащие их вакцины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

По настоящей заявке испрашивается приоритет Предварительной Заявки США № 61/060293 от 10 июня 2008, полное содержание которой включено в настоящей документ ссылкой.

Настоящее изобретение относится к области биологической науки, более конкретно, к области противораковой терапии. В частности, настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые исключительно эффективны в качестве противораковых вакцин и лекарственных средств для лечения и предотвращения опухолей.

Уровень техники

Было продемонстрировано, что CD8-положительные CTL распознают пептиды эпитопов, выделенные из опухолевых специфических антигенов (TAA), обнаруженных на молекулах главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I, и затем уничтожают опухолевые клетки. С момента открытия семейства антигенов меланомы (MAGE) в качестве первого примера TAA было открыто много других TAA, главным образом посредством иммунологических способов (Boon T, Int J Cancer 1993 May 8, 54(2): 177-80; Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1996 Mar 1, 183(3): 725-9). Некоторые из этих TAA в настоящее время подвергаются клиническим исследованиям в качестве иммунотерапевтических мишеней.

Идентификация новых TAA, способных индуцировать специфический противоопухолевый иммунный ответ, обеспечивает дальнейшее развитие и клиническое применение стратегий пептидной вакцинации для различных типов рака (Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; Butterfield LH et al., Cancer Res 1999 JuI 1, 59(13): 3134-42; Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9; van der Burg SH et al., J Immunol 1996 May 1, 156(9): 3308-14; Tanaka F et al., Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8; Fujie T et al., Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72; Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94). К настоящему моменту, существует несколько сообщений о клинических испытаниях с использованием пептидов, выделенных из опухолевых специфичных антигенов. К сожалению, до сих пор в испытаниях этих противораковых вакцин наблюдали низкий целевой показатель ответной реакции (Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80; Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42; Rosenberg SA et al., Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15).

TAA, который является необходимым для пролиферации и выживания раковых клеток, является вариантом в качестве мишени для иммунотерапии, так как использование таких TAA может минимизировать хорошо описанный риск ускользания раковых клеток от иммунного ответа, относимый на счет делеции, мутации или подавления (даун-регуляции) TAA как следствия проводимой терапевтической иммунной селекции.

С помощью скрининга кДНК-библиотек с зондами протоокогена c-myb (Nomura N et al., Nucleic Acids Res. 1988 Dec 9, 16(23): 11075-11089), MYBL2 (Регистрационный номер GenBank No: NM_002466, SEQ ID NO:21, кодирующая генный продукт SEQ ID NO:22), был идентифицирован гомолог миелобластозного вирусного онкогена v-myb, (птичий)-типа 2, в качестве члена семейства генов транскрипционного фактора MYB. Перед этой идентификацией, MYBL2 был известен в качестве молекулы, вовлеченной в регуляцию прогрессии клеточного цикла, а также в регуляцию запускаемого циклином фосфорилирования с помощью комплексов CDK2-циклин A и CDK2-циклин E (Robinson C et al., Oncogene 1996 May 2; 12(9): 1855-64, Lane et al., Oncogene 1997 May 22; 14(20):2445-53, SaIa et al., Proc Natl Acad Sci 1997 Jan 21; 94(2): 532-536, Johnson K et al., J Biol Chem 1999 Dec 17; 274(51): 36741-9). В недавнем сообщении было продемонстрировано, что Mip/LIN-9 регулируют экспрессию MYBL2, и оба белка играют ключевые роли в стимулировании развития клеточного цикла посредством контроля циклинами S и M фазы (Pilkinton M et al., J Biol Chem 2007 Jan 5; 282(1): 168-75). Кроме того, посредством анализа профиля экспрессии с использованием полногеномной микропанели кДНК, содержащей 23040 генов, MYBL2 также был идентифицирован в качестве новой молекулы, активированной (с ап-регуляцией) при некоторых раковых заболеваниях. Фактически было продемонстрировано, что MYBL2 активируется в некоторых раковых клетках, включающих, например, клетки тестикулярной опухоли (WO2004/031410), рака поджелудочной железы (WO2004/031412), рака мочевого пузыря (WO2006/085684), немелкоклеточного рака легкого (WO2004/031413), мелкоклеточного рака легкого (WO2007/013665) и рака пищевода (WO2004/031410), причем содержания этих описаний включено в настоящий документ ссылкой. Соответственно, в том MYBL2, который, как предполагается, является новым онкоантигеном, пептиды эпитопов, выделенные из MYB L2, могут быть применимы в качестве противораковых иммунотерапевтических средств для лечения широкого спектра раковых заболеваний.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение частично основано на открытии подходящих эпитопов пептидов, которые могут служить в качестве мишеней иммунотерапии. Так как TAA, как правило, воспринимаются иммунной системой как "свои" и, таким образом, часто не обладают присущей иммуногенностью, открытие подходящих мишеней представляет собой исключительную важность. Понимая, что MYBL2 был идентифицирован по активации в раковых клетках при раковых заболеваниях, таких как тестикулярная опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода, дальнейший анализ в настоящем изобретении нацелен на MYBL2 (SEQ ID NO: 22, кодируемая геном с Регистрационным номером базы GenBank No. NM_002466 (SEQ ID NO: 21)). Конкретно, выбирали продукты гена MYBL2, содержащие пептиды эпитопов, которые индуцируют CTL, специфичные для соответствующих молекул. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные от здорового донора, стимулировали с использованием пептидов-кандидатов на связывание с HLA-A*2402, выделенных из MYB L2. Создавали CTL, которые специфично распознают HLA-A24-положительные клетки-мишени активированные с помощью соответствующих пептидов-кандидатов, и идентифицировали пептиды эпитопов, рестриктированных по HLA-A24, которые могут индуцировать убедительные и специфичные иммунные ответы против MYBL2. Эти результаты демонстрируют, что MYBL2 является в высокой степени иммуногенным, и его эпитопы являются эффективными мишенями для противоопухолевой иммунотерапии.

Соответственно, целью настоящего изобретения является предложение пептидов, обладающих способностью к индуцированию CTL, а также аминокислотных последовательностей, выбранных из числа, состоящего из SEQ ID NO: 1, 2 и 13. В настоящем изобретении предлагаются модифицированные пептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 2 или 13, где одна, две или более аминокислот заменены, вставлены, делетированы или добавлены при условии, что модифицированные пептиды сохраняют исходную способность к индуцированию CTL.

При введении субъекту настоящие пептиды презентируются на поверхности антиген-презентирующих клеток или экзосом и затем индуцируют CTL, нацеленные на соответствующие пептиды. Таким образом, целью настоящего изобретения является предложение антиген-презентирующих клеток и экзосом, презентирующих любые из настоящих пептидов, а также предложение способов индукции антиген-презентирующих клеток.

Противоопухолевый иммунный ответ индуцируется путем введения настоящих полипептидов MYBL2 или полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, а также экзосом и антиген-презентирующих клеток, которые презентируют полипептиды MYBL2. Таким образом, целью настоящего изобретения является предложение фармацевтических средств, содержащих полипептиды по настоящему изобретению или полинуклеотиды, кодирующие их, а также содержащих экзосомы и антиген-презентирующие клетки в качестве их активных ингредиентов. Фармацевтические средства по настоящему изобретению находят практическое применение в качестве вакцин.

Следующей целью настоящего изобретения является предложение способов лечения и/или профилактики (т.e. предотвращения) раковых заболеваний (опухолей), и/или предотвращения их послеоперационных рецидивов, а также способов индукции CTL, способов индукции иммунного ответа против опухолеспецифичного эндотелия, а также способов индукции противоопухолевого иммунитета, причем способы включают стадию введения полипептидов MYBL2, полинуклеотидов, кодирующих полипептиды MYBL2, экзосом или антиген-презентирующих клеток, презентирующих полипептиды MYBL2, или фармацевтических средств по изобретению. Кроме того, CTL по изобретению также находят применение в качестве противораковых вакцин. Примеры предполагаемых раковых заболеваний включают, в частности, тестикулярную опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода.

Дополнительно к вышеизложенному другие цели и признаки изобретения будут более очевидны при ознакомлении с следующим подробным описанием в сочетании с сопровождающими его чертежами и примерами. Однако следует понимать, что и вышеизложенная сущность изобретения и следующее подробное описание состоят из приведенных в качестве примера вариантов осуществлений, которые не ограничивают изобретение или другие альтернативные варианты осуществления изобретения. Конкретно, в то время как изобретение описано в настоящем документе со ссылкой на ряд конкретных вариантов осуществления, понятно, что описание является иллюстрацией изобретения и оно не построено в виде ограничения изобретения. Специалисты в данной области могут осуществлять различные модификации и применения, не выходя за рамки и сущность изобретения, описанные в приложенной формуле изобретения. Аналогично, другие цели, признаки, эффекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны исходя из сущности изобретения и конкретных воплощений, описанных ниже, и будут совершенно очевидны специалисту в данной области. Такие цели, признаки, эффекты и преимущества будут очевидны из вышеизложенного в сочетании с сопровождающимися примерами, данными, чертежами и всеми обоснованными выводами, сделанными на их основании, индивидуально или при рассмотрении ссылок, включенных в настоящий документ.

Краткое описание чертежей

Различные аспекты и применения настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области при рассмотрении краткого описания чертежей и подробного описания настоящего изобретения и его предпочтительных вариантов осуществления, представленных ниже.

Фигура 1 состоит из серии фотографий, (a)-(d), изображающих результаты анализа ELISPOT для IFN-гамма на CTL, которые были индуцированы пептидами, выделенными из MYBL2. CTL в лунке номер #5, стимулированные с помощью MYBL2-A24-9-100 (SEQ ID NO: 1) (a), #4 с помощью MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO: 2) (b) и #1 с помощью MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13) (c), продемонстрировали убедительное продуцирование IFN-гамма по сравнению с контролем, соответственно. Напротив, не детектировали специфичного продуцирования IFN-гамма в CTL, стимулированных с помощью MYBL2-A24-10-48 (SEQ ID NO: 12) против клеток-мишеней, активированных пептидом (d). Клетки в лунках, обозначенных прямоугольным блоком, выращивали для создания линий CTL. На чертежах "+" обозначает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных соответствующим пептидом, и "-" обозначает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не активированных никакими пептидами. Фигура 2 состоит из серий диаграмм в виде ломаной a-d, представляющих результат анализа ELISA для IFN-гамма на линиях CTL, созданных с помощью MYBL2-A24-9-100 (SEQ ID NO: 1) (a), MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO: 2) (b) и MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13) (c) в вышеописанном анализе ELISA для IFN-гамма. Результаты демонстрируют, что линии CTL, созданные путем стимулирования с помощью каждого пептида, продемонстрировали убедительное продуцирование IFN-гамма по сравнению с контролем. Напротив, не наблюдали никакого специфичного продуцирования IFN-гамма в линии CTL, созданной с помощью MYBL2-A24-10-48 (SEQ ID NO: 12), против клеток-мишеней, активированных пептидом (d). На фигурах "+" обозначает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, активированных с помощью соответствующего пептида, и "-" обозначает продуцирование IFN-гамма против клеток-мишеней, не активированных с помощью каких-либо пептидов.

Описание вариантов осуществления

Хотя при практическом осуществлении или при тестировании воплощений настоящего изобретения могут использоваться любые методы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, сейчас будут описаны предпочтительные методы, устройства и материалы. Однако перед описанием настоящих материалов и методов, следует понять, что настоящее изобретение не ограничено конкретными размерами, формами, направлениями, методиками, протоколами и т.д., описанными в настоящем документе, поскольку они могут варьировать согласно обычному проведению эксперимента и оптимизации. Также следует понимать, что терминология, используемая в описании, предназначена исключительно для целей описания конкретных вариантов или воплощений, и не подразумевает ограничения рамок настоящего изобретения, которое ограничивается только приложенной формулой изобретения.

Раскрытие каждой публикации, патента или патентной заявки, упомянутой в настоящем описании изобретения, специфически включено в настоящий документ в полном объеме с помощью ссылки. Однако ничто в настоящем документе не должно быть истолковано как признание того, что изобретение не правомочно противопоставлять такое раскрытие более раннему приоритету посредством предшествующего изобретения.

I. Определения

До тех пор пока не определено по-другому, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, будут иметь такое же значение, какое обычно подразумевается специалистом в данной области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Однако в случае противоречия настоящее описание изобретения, включающее определения, будет уточнено.

Формы единственного числа при использовании в настоящем документе, обозначают "по меньшей мере, один" до тех пор, пока не будет определенно указано другое.

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков. Термины применяются к аминокислотным полимерам, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются модифицированными остатками или синтетическими остатками, такими как искусственный химический миметик соответствующей природной аминокислоты, а также термины применяются к природным аминокислотным полимерам.

Термин "аминокислота", при использовании в настоящем документе, обозначает природные и синтетические аминокислоты, а также аминокислотные аналоги и аминокислотные миметики, которые обладают функцией, аналогичной функции природных аминокислот. Природные аминокислоты представляют собой аминокислоты, которые кодируются с помощью генетического кода, а также аминокислоты, модифицированные после трансляции в клетках (например, гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и O-фосфосерин). Фраза "аминокислотный аналог" обозначает соединения, которые имеют одинаковую общую химическую структуру (альфа-углеродный атом, связанный с водородом, карбокси-группой, аминогруппой и R-группой) с природной аминокислотой, но содержат модифицированную R-группу или модифицированный остов (например, гомосерин, норлейцин, метионин, сульфоксид, метионин метилсульфоний). Фраза "аминокислотный миметик" обозначает химические соединения, которые имеют различные структуры, но одинаковые функции с основными аминокислотами.

Аминокислоты могут обозначаться в настоящем документе с помощью их общепринятых трехбуквенных символов или их однобуквенных символов, рекомендованных Комиссией по Биохимической Номенклатуре IUPAC-IUB.

Термины "ген", "полинуклеотиды", "нуклеотиды" и "нуклеиновые кислоты" используются в настоящем документе взаимозаменяемо и, до тех пор, пока определенно не указано другое, обозначаются их общепринятыми однобуквенными кодами.

До тех пор пока не определено по-другому, термин "рак" обозначает раковые заболевания, при которых сверхэкспрессируется ген MYBL2, включающие, например, тестикулярную опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода.

II. Пептиды

Для демонстрации того, что пептиды, выделенные из MYBL2, функционируют в качестве антигенов, распознаваемых цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), пептиды, выделенные из MYBL2 (SEQ ID NO: 22), анализировали для определения того, являются ли они эпитопами антигенов, рестриктированными по HLA-A24, которые представляют собой широко распространенные аллели HLA (Date Y et al., Tissue Antigens 47: 93-101, 1996; Kondo A et al., J Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT et al., J Immunol 152: 3913-24, 1994). Кандидаты пептидов, связывающихся с HLA-A24, выделенных из MYBL2, идентифицировали на основе их аффинностей связывания с HLA-A24. После in vitro-стимулирования T-клеток с помощью дендритных клеток (DC), несущих эти пептиды, CTL были успешно созданы с использованием каждого из следующих пептидов;

MYBL2- A24-9-100 (SEQ ID NO: 1),

MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO: 2), и

MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13).

Эти созданные CTL демонстрируют убедительную специфичную активность CTL против клеток-мишеней, активированных с помощью соответствующих пептидов. Эти результаты, представленные в настоящем документе, демонстрируют, что MYBL2 представляет собой антиген, распознаваемый с помощью CTL, и что пептиды могут представлять собой пептиды эпитопов MYBL2, рестриктированных по HLA-A24.

Так как ген MYBL2 сверхэкспрессируется в большинстве опухолевых тканей, включающих, например, тестикулярную опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода, то он представляет собой удобную мишень для иммунотерапии. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются нонапептиды (пептиды, состоящие из девяти аминокислотных остатков) и декапептиды (пептиды, состоящие из десяти аминокислотных остатков), соответствующие эпитопам MYBL2, распознаваемым CTL. Особенно предпочтительные примеры нонапептидов и декапептидов по настоящему изобретению включают такие пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, выбранной из числа SEQ ID NOs: 1, 2 и 13.

Как правило, программы пакета программного обеспечения, доступного в настоящий момент из Интернета, такие как описанные у Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75, могут использоваться для расчета аффинностей связывания между различными пептидами и антигенами HLA in silico. Аффинность связывания с антигенами HLA может быть измерена так, как описано, например, у Parker KC et al., J Immunol 1994 Jan 1, 152(1): 163-75; и Kuzushima K et al., Blood 2001, 98(6): 1872-81. Методы определения аффинности связывания описаны, например, в публикациях Journal of Immunological Methods, 1995, 185: 181-190 и Protein Science, 2000, 9: 1838-1846. Таким образом, настоящее изобретение охватывает пептиды MYBL2, которые связываются с антигенами HLA, идентифицированные с использованием таких известных программ.

Нонапептиды и декапептиды по настоящему изобретению могут фланкироваться дополнительными аминокислотными остатками при условии, что полученный в результате пептид сохраняет свою способность к индуцированию CTL. Такие пептиды, обладающие способностью к индуцированию CTL, как правило, содержат менее чем примерно 40 аминокислот, часто менее чем примерно 20 аминокислот, обычно менее чем примерно 15 аминокислот. Конкретные аминокислотные последовательности, фланкирующие нонапептиды и декапептиды по настоящему изобретению (например, пептиды, состоящие из аминокислотной пследовательности, выбранной из числа SEQ ID NO: 1, 2 и 13), не ограничены и могут состоять из любого типа аминокислот при условии, что это не ослабляет способность исходного пептида к индуцированию CTL. Таким образом, в настоящем изобретении также предлагаются пептиды, обладающие способностью к индуцированию CTL и имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из числа SEQ ID NO: 1, 2 и 13.

Как правило, модификация одной, двух или более аминокислот в белке не повлияет на функцию белка и, в некоторых случаях, даже усилит целевую функцию исходного белка. Фактически, известно, что модифицированные пептиды (т.e. пептиды, состоящие из аминокислотной последовательности, в которой были модифицированы одна, две или несколько аминокислотных остатков (т.e. заменены, добавлены, делетированы или вставлены) по сравнению с исходной эталонной последовательностью), сохраняют биологическую активность исходного пептида (Mark et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13). Таким образом, в одном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению могут обладать и способностью к индуцированию CTL, и аминокислотной последовательностью, выбранной из числа SEQ ID NO: 1, 2 и 13, где одна, две или несколько аминокислот вставлены, добавлены, делетированы и/или заменены.

Специалистам в данной области понятно, что индивидуальные добавления или замены в аминокислотной последовательности, которые изменяют единственную аминокислоту или небольшой процент аминокислот, имеют тенденцию приводить в результате к сохранению свойств исходной аминокислотной боковой цепи. Как таковые, они часто обозначаются как "консервативные замены" или "консервативные модификации", где изменение белка приводит в результате к получению модифицированного белка, обладающего функцией, аналогичной функции исходного белка. Таблицы консервативных замен, представляющих функционально подобные аминокислоты, хорошо известны из уровня техники. Примеры характеристик аминокислотных боковых цепей, которые подходят для консервативных замен, включают, например, гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), и боковые цепи, содержащие следующие функциональные группы или общие характеристики: алифатические боковые цепи (G, A, V, L, I, P); боковые цепи, содержащие гидроксильную группу (S, T, Y); боковые цепи, содержащие атом серы (C, M); боковые цепи, содержащие карбоновую кислоту и амид (D, N, E, Q); боковые цепи, содержащие основание (R, K, H); и боковые цепи, содержащие ароматический компонент (H, F, Y, W). Кроме того, каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые признаны в области техники как консервативные замены друг для друга:

1) Аланин (A), Глицин (G);

2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (E);

3) Аспарагин (N), Глутамин (Q);

4) Аргинин (R), Лизин (K);

5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (M), Валин (V);

6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), Триптофан (W);

7) Серин (S), Треонин (T); и

8) Цистеин (C), Метионин (M) (см., например, Creighton, Proteins 1984).

Также предполагается, что такие консервативно модифицированные пептиды являются пептидами по настоящему изобретению. Однако пептиды по настоящему изобретению не ограничены этим и могут включать неконсервативные модификации при условии, что модифицированный пептид сохраняет способность исходного пептида к индуцированию CTL. Кроме того, модифицированные пептиды не должны исключать пептидов, способных к индуцированию CTL, представляющих собой полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели MYBL2.

Для сохранения необходимой способности к индуцированию CTL можно модифицировать (вставить, добавить, делетировать и/или заменить) небольшое количество (например, одну две или несколько) или небольшой процент аминокислот. В настоящем документе термин "несколько" обозначает 5 или менее аминокислот, например 4 или 3 или менее. Процент аминокислот, которые следует модифицировать, предпочтительно составляет 20% или менее, более предпочтительно, 15% или менее, еще более предпочтительно, 10% или менее или 1-5%.

Анализ гомологии предпочтительных пептидов по настоящему изобретению, MYBL2-A24-9-100 (SEQ ID NO:1), MYBL2-A24-9-370 (SEQ ID NO:2),and MYBL2-A24-10-197 (SEQ ID NO: 13), подтвердил, что эти пептиды не обладают значительной гомологией с пептидами, выделенными из любых других известных генных продуктов. Таким образом, возможность того, что эти пептиды будут генерировать неизвестный или нежелательный иммунный ответ при использовании в иммунотерапии, значительно снижается. Соответственно, эти пептиды, как ожидается, будут весьма приемлемы для вызова иммунного ответа против MYBL2 в раковых клетках пациентов с опухолями при таких заболеваниях, как тестикулярная опухоль, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легкого, мелкоклеточный рак легкого и рак пищевода.

При использовании в контексте иммунотерапии, пептиды по настоящему изобретению должны презентироваться на поверхности клетки или экзосомы, предпочтительно, в виде комплекса с антигеном HLA. Таким образом, предпочтительно выбирать пептиды, которые не только индуцируют CTL, но также обладают высокой аффинностью к антигену HLA. С этой целью пептиды могут быть модифицированы путем замены, вставки, делеции и/или добавления аминокислотных остатков с получением модифицированного пептида, обладающего повышенной аффинностью связывания. Так как закономерность последовательностей пептидов, выявленная путем связывания с антигенами HLA, уже известна (J Immunol 1994, 152: 3913; Immunogenetics 1995, 41: 178; J Immunol 1994, 155: 4307), то на основе такой закономерности дополнительно к пептидам, которые выявлены в природе, в иммуногенные пептиды по изобретению могут быть введены модификации. Например, может быть желательной замена второй аминокислоты от N-конца на фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан и/или аминокислоты с C-конца на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин с целью повышения аффинности связывания с HLA-A24. Таким образом, настоящим изобретением охвачены пептиды, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 13, где вторая аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 13 заменена на фенилаланин, тирозин, метионин или триптофан, и/или где C-конец аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 13 заменен на фенилаланин, лейцин, изолейцин, триптофан или метионин. Замены могут вводиться не только в концевые аминокислоты, но также в положения пептидов, соответствующие потенциальным сайтам распознавания TCR. Несколько исследований продемонстрировали, что аминокислотные замены в пептиде могут быть равноценны или могут быть лучше, чем исходные, например CAP1, p53_(264-272),Her-2/neu_(369-377) или gp100_(209-217) (Zaremba et al. Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et al. J Immunol. (2002) Feb 1; 168(3): 1338-47., S. O. Dionne et al. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 и S. O. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53, 307-314).

В настоящем изобретении также предполагается добавление одной-двух аминокислот к N- и/или C-концу описанных пептидов. Такие модифицированные пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с антигеном HLA и сохраняющие способность к индуцированию CTL, также включены в настоящее изобретение.

Однако когда последовательность пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, обладающего отличной функцией, то могут индуцироваться побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения и/или аллергические симптомы против определенных веществ. Таким образом, предпочтительно сначала провести поиск гомологии с использованием доступных баз данных во избежание ситуаций, в которых последовательность пептида совпадает с аминокислотной последовательностью другого белка. Когда после поиска гомологии становится ясно, что не существует пептида даже с 1 или 2 аминокислотными отличиями по сравнению с целевым пептидом, то целевой пептид может быть модифицирован с целью повышения аффинности связывания с антигенами HLA и/или повышения его способности к индуцированию CTL без какой-либо опасности таких побочных эффектов.

Хотя пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с антигенами HLA, описанные выше, как ожидается, являются высоко эффективными, пептиды-кандидаты, которые выбраны согласно наличию высокой аффинности связывания в качестве индикатора, дополнительно исследуют на предмет присутствия способности к индуцированию CTL. В настоящем документе фраза "способность к индуцированию CTL" указывает на способность пептида индуцировать цитотоксические лимфоциты (CTL) при их презентации на антиген-презентирующих клетках. Далее, "способность к индуцированию CTL" включает способность пептида индуцировать активацию CTL, пролиферацию CTL, стимулировать лизис клеток-мишеней с помощью CTL, и способность увеличивать продуцирование IFN-гамма клетками CTL.

Подтверждение способности к индуцированию CTL осуществляется путем индукции антиген-презентирующих клеток, несущих человеческие MHC-антигены (например, B-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток (DC)), или, более конкретно, клеток DC, выделенных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови, после стимулирования с помощью пептидов, смешивания с CD8-положительными клетками, и затем путем измерения IFN-гамма, продуцированного и высвобожденного клетками CTL против клеток-мишеней. В качестве реакционной системы, могут использоваться трансгенные животные, которые были получены для экспрессии человеческого антигена HLA (например, такие, как описано у BenMohamed L, Krishnan R, Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DRl transgenic mice: dependence on HLA class II restricted T(H) response). Например, клетки-мишени могут быть радиоактивно помечены с помощью ⁵¹Cr и подобных меток, и цитотоксическая активность может быть рассчитана исходя из радиоактивности, высвобожденной из клеток-мишеней. Альтернативно, способность к индуцированию CTL может оцениваться путем измерения IFN-гамма, продуцированного и высвобожденного с помощью CTL в присутствии антиген-презентирующих клеток (APC), которые несут иммобилизованные пептиды, и путем визуализации области ингибирования на среде с использованием моноклональных антител к IFN-гамма.

В результате определения способности пептидов к индуцированию CTL, как описано выше, было открыто, что те пептиды, которые обладают высокой аффинностью связывания с антигеном HLA, необязательно обладают высокой способностью к индуцированию CTL. Однако те пептиды, что были идентифицированы и оценены, нонапептиды или декапептиды, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 13, как было обнаружено, демонстрируют особенно высокую способность к индуцированию CTL, а также высокую аффинность связывания с антигеном HLA. Таким образом, эти пептиды приведены в качестве примера как предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения.

Дополнительно к вышеописанным модификациям пептиды по настоящему изобретению также могут быть связаны с другими веществами при условии, что полученный в результате пептид сохраняет требуемую способность к индуцированию CTL, характерную для исходного пептида. Примеры подходящих веществ включают, например: пептиды, липиды, сахар и сахарные цепи, ацетильные группы, природные и синтетические полимеры и т.д. Пептиды могут содержать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковых цепей или фосфорилирование и т.д., при условии, что модификации не нарушают биологической активности, характерной для исходного пептида. Эти типы модификаций могут осуществляться для придания дополнительных функций (например, функции нацеливания, и функции доставки) или для стабилизации полипептида.

Из уровня техники известно, что, например, для повышения in vivo-стабильности полипептида, вводят D-аминокислоты, аминокислотные миметики или синтетические аминокислоты; этот принцип также может быть адаптирован к настоящим полипептидам. Стабильность полипептида может оцениваться рядом способов. Например, для тестирования стабильности могут использоваться пептидазы и различные биологические среды, такие как плазма и сыворотка (см., например, Verhoef et al., Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986, 11: 291-302).

Пептиды по настоящему изобретению презентируются на поверхности клетки (например, антиген-презентирующей клетки) или экзосомы в виде комплексов в комбинации с антигенами HLA, и затем индуцируют CTL. Таким образом, пептиды по настоящему изобретению включают пептиды, презентированные на поверхности клетки или экзосомы. Такие экзосомы могут быть получены, например, с использованием методов, подробно описанных в Публикациях Японской Патентной Заявки Kohyo No. Hei 11-510507 и WO99/03499, и могут быть получены с использованием APC, полученных от пациентов, которые являются субъектом для лечения и/или предотвращения заболевания. Экзосомы или клетки, презентирующие пептиды по настоящему изобретению, могут быть инокулированы в качестве вакцин.

Тип антигенов HLA, содержащихся в вышеописанных комплексах, должен совпадать с типом антигенов субъекта, которому требуется лечение и/или предотвращение заболевания. Например, в японской популяции превалирует HLA-A24, конкретно HLA-A2402, и, таким образом, он будет подходящим для японского пациента. Использование типа A24, который высоко экспрессируется у японцев и европейцев, является благоприятным для получения эффективных результатов, и также находят свое применение субтипы, такие как A2402. Обычно в клинике тип антигена HLA пациента, которому требуется лечение, исследуется заранее, что дает возможность подходящего выбора пептидов, обладающих высоким уровнем аффинности связывания с конкретным антигеном или обладающих способностью к индуцированию CTL путем презентации антигенов.

При использовании A24-типа антигена HLA для экзосомы или клетки, предпочтительно используются пептиды, содержащие последовательности SEQ ID NO: 1, 2 или 13.

В настоящем документе, пептиды по настоящему изобретению также могут быть описаны как "MYBL2-пептид(ы)" или "MYBL2-полипептид(ы)".

III. Получение MYBL2-пептидов

Пептиды по изобретению могут быть получены с использованием хорошо известных методов. Например, пептиды могут быть получены синтетически с использованием технологии рекомбинантной ДНК или химического синтеза. Пептиды по изобретению могут быть синтезированы индивидуально или в виде более длинных полипептидов, состоящих из двух или более пептидов. Затем пептиды могут быть изолированы, т.е. очищены так, чтобы быть по существу свободными от других природных белков клетки-хозяина и их фрагментов или от любых других химических веществ.

Пептид по настоящему изобретению может быть получен посредством химического синтеза на основе выбранной аминокислотной последовательности. Примеры подходящих методов пептидного синтеза, которые могут быть адаптированы для синтеза, включают:

(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;

(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;

(iii) Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1975;

(iv) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (in Japanese), Maruzen Co., 1985;

(v) Development of Pharmaceuticals (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa, 1991;

(vi) WO99/67288; и

(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, "Solid Phase Peptide Synthesis", Academic Press, New York, 1980, 100-118.

Альтернативно, настоящие пептиды могут быть получены путем адаптации любого известного метода генетической инженерии для получения пептидов (например, Morrison J, J Bacteriology 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62). Например, сначала получают подходящий вектор, несущий полинуклеотид, кодирующий целевой пептид в экспрессируемой форме (например, полинуклеотид, расположенный ниже регуляторной последовательности, соответствующей промоторной последовательности) и трансформируют в подходящую клетку-хозяин. Клетку-хозяин затем культивируют для продуцирования пептида, представляющего интерес. Пептид также может быть получен in vitro, заимствуя in vitro-систему трансляции.

IV. Полинуклеотиды

В настоящем изобретении также предлагается полинуклеотид, который кодирует любые из вышеупомянутых пептидов по настоящему изобретению. Они включают полинуклеотиды, выделенные из природного гена MYBL2 (Регистрационный номер GenBank No. NM_002466 (SEQ ID NO: 21)), а также полинуклеотиды, содержащие их консервативно модифицированную нуклеотидную последовательность. В настоящем документе, фраза "консервативно модифицированная нуклеотидная последовательность" обозначает последовательности, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности. В связи с вырожденностью генетического кода, большое количество функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой данный белок. Например, все кодоны GCA, GCC, GCG и GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин определяется с помощью кодона, кодон может быть изменен на любой из соответствующих описанных кодонов без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой "молчащие вариации", которые представляют собой тип консервативно модифицированных вариаций. Каждая последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует пептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту в данной области понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно представляет собой единственный кодон для метионина, и TGG, которы