Пептиды

Пептиды

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к циклическому олигопептиду с конформационными ограничениями, к фармацевтической композиции, содержащей такой олигопептид, применению такого олигопептида и фармацевтической композиции в медицине и способу получения такого олигопептида.

Область техники

Известно, что белковые рецепторы обычно связывают свои лиганды при помощи эпитопов, т.е. комбинаций аминокислотных остатков, составляющих небольшую часть белковой молекулы.

При активации белковых рецепторов на поверхности клетки они продуцируют внутриклеточный сигнал вследствие связывания с другими белками, называемыми белковыми лигандами. Часть лиганда, взаимодействующая с рецептором, называется эпитопом и обычно состоит из комбинации небольшого числа аминокислотных остатков, находящихся в непосредственной близости друг от друга и удерживаемых в этом положении остовом белковой цепи. Примерами эпитопов могут служить структуры на поверхности белков, взаимодействующие с антителами или Т-клеточными рецепторами, но фактически любая структура на поверхности белка, специфически узнаваемая другим белком, подпадает под определение эпитопа. Поскольку связывание белкового рецептора с эпитопом может служить важным этапом в этиологии болезни или, напротив, в лечении патологического состояния, идентификация функциональных групп, образующих эпитопы, представляет собой потенциально эффективный способ разработки новых лекарственных средств, где лекарственное средство представляет собой агент, содержащий эпитоп, который связывается с рецептором.

Существуют две проблемы, затрудняющие этот подход к разработке новых лекарственных средств. Одна из них заключается в идентификации эпитопов, которые могут использоваться в качестве лекарственных молекул, связывающихся с подходящими рецепторами для лечения заболевания. Вторая проблема заключается в дизайне молекул, способных удерживать и презентировать комбинации аминокислотных остатков, образующих эпитоп, таким образом, что может достигаться сильное связывающее взаимодействие с клеточным рецептором.

Известны методы идентификации комбинации аминокислотных остатков, способной образовывать эпитопы. В традиционной комбинаторной химии идентификация наиболее подходящих последовательностей для связывания с конкретным рецептором должна происходить путем синтеза сотен возможных комбинаций различных групп, таких как аминокислоты, в различном порядке, и проверки эффективности каждой комбинации. Это трудоемкий и дорогостоящий процесс, ограниченный к тому же природой химических реакций, проводящихся для связывания вместе различных компонентов.

В заявке на международный патент WO 01/01140 описан усовершенствованный способ идентификации эпитопов. Описана композиция для взаимодействия с лигандом. Композиция содержит нековалентную ассоциацию множества различных конъюгатов, где каждый конъюгат содержит головную группу и хвостовую группу. Хвостовые группы конъюгатов образуют гидрофобный агрегат, и конъюгаты обладают свободой движения относительно друг друга в составе агрегата, так что в присутствии лиганда по крайней мере две головные группы располагаются надлежащим образом для формирования эпитопа, способного связываться с лигандом сильнее, чем каждая из групп по отдельности. Большое количество конъюгатов, обладающих желаемой биологической активностью, может быть идентифицировано путем подбора группы конъюгатов, содержащих совокупность головных групп, которые образуют нековалентные ассоциации, в которых хвостовые группы объединяются путем гидрофобных взаимодействий и в которых конъюгаты проявляют свободу движения относительно друг друга, а также анализа с целью выявления достаточного взаимодействия между нековалентной ассоциацией и лигандом. Этот процесс может быть повторен с использованием модифицированной совокупности головных групп для обнаружения достаточного взаимодействия между нековалентной ассоциацией и лигандом. Этот процесс позволяет идентифицировать наиболее подходящую последовательность для связывания с конкретным рецептором, полагаясь на близость головных групп для получения эпитопов-производных ассоциации без необходимости синтеза сотен возможных комбинаций различных групп, используя подход традиционной комбинаторной химии. Метод основывается на близости головных групп для получения эпитопов-производных ассоциации. После синтеза группы конъюгатов, дальнейшего химического синтеза не требуется, только смешивание конъюгатов для получения различных проб путем нековалентной ассоциации.

В то время как эта новая композиция и метод позволяют успешно идентифицировать функциональные группы, образующие эпитоп и связывающиеся со своим лигандом, по-прежнему необходима разработка усовершенствованных композиций, способных к формированию желаемого эпитопа и более стабильному и специфичному взаимодействию со своим лигандом для генерации биологического ответа.

Попытки конструирования пептида, аналогичного эпитопу, только из аминокислот, входящих в состав сайта связывания, часто терпят неудачу, поскольку такие пептиды не обладают биологической активностью, аналогичной активности белкового рецептора.

При конструировании сайта связывания белка из олигопептидов, принадлежащих различным, дискретным участкам белковой цепи, попытки реконструкции сайта связывания путем смешивания отдельных олигопептидов в растворе не приводили к получению активного сайта связывания.

В соответствии с вышесказанным, настоящее изобретение направлено на получение усовершенствованных олигопептидов, способных к образованию желаемого эпитопа, способного к более стабильному и специфичному взаимодействию со своим лигандом для генерации биологического ответа.

Сущность изобретения

В настоящем изобретении представлен циклический олигопептид, содержащий цикл не менее чем из шести аминокислотных остатков для специфического связывания со своим лигандом, где кольцо включает несколько аминокислотных доменов, каждый из которых содержит не менее двух аминокислотных остатков, образующих эпитоп, и две или более ассоциирующих функциональных группы, расположенных таким образом, что они формируют одну или более ассоциации внутри цикла; где циклический олигопептид ограничен до единственной конформации таким образом, что аминокислотные остатки, образующие эпитоп, образуют эпитоп в каждом домене, при этом каждый эпитоп способен специфически связываться с лигандом.

Из уровня техники известно, что циклические пептиды имеют более ограниченную конформацию, чем линейные олигопептиды. Свобода движений концов пептида в циклическом пептиде ограничена, поскольку они химически связаны друг с другом. Тем не менее, циклические пептиды все же обладают значительной степенью гибкости, что делает их непригодными для участия в стабильном связывающем взаимодействии с лигандом.

Путем конструирования циклических олигопептидов, содержащих две или более ассоциирующих функциональных группы, расположенные таким образом, что они образуют одну или более ассоциаций внутри цикла, циклический олигопептид оказывается ограниченным до единственной конформации. Это позволяет аминокислотным остаткам, образующим эпитоп в каждом домене, специфически связываться с лигандом более стабильно и специфично, чем было доступно до настоящего времени. Аминокислотные остатки, образующие эпитоп, могут образовывать стабильный эпитоп для взаимодействия с лигандом, приводящего к биологическому ответу. Поскольку формируется стабильный эпитоп, взаимодействие с лигандом улучшается.

В заявке на патент США US 2005/0107289 раскрываются антимикробные агенты и композиции, включающие циклические пептиды, содержащие последовательность чередующихся D- и L- α-аминокислотных остатков или β-аминокислотных остатков. В этом документе далее раскрывается, что, по-видимому, циклические пептиды самостоятельно сворачиваются в надмолекулярные структуры внутри микробных мембран или будучи ассоциированными с ними. Такие надмолекулярные структуры могут, например, представлять собой нанотрубки. В центре каждой нанотрубки имеется пора, окруженная остовами полипептидных цепей расположенных друг над другом циклических пептидов. Через поры нанотрубок могут проходить ионы и мелкие молекулы.

В заявке на патент США US 2005/0107289 не раскрывается, что циклические пептиды содержат аминокислотные остатки, образующие эпитоп, которые образуют эпитоп, способный специфически связываться с лигандом. В заявке на патент США US 2005/0107289 также не раскрывается, что циклические пептиды ограничены ассоциациями внутри цикла, что обеспечивает формирование таких эпитопов.

В работе G. Abbenante et al. "Conformational Control by Thiazole and Oxazoline Rings in Cyclic Octapeptides of Marine Origin. Novel Macrocyclic Chair and Boat Conformations; J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10384-10388 раскрывается использование строительных блоков аминокислот (Thr, Cys) в качестве ограничителей конформации цикла (оксазолин, тиазол) для регуляции трехмерной структуры и реактивности морских макроциклов. Циклический октапептид 1, c[Ile-Thr-D-Val-Cys-Ile-Thr-D-Val-Cyc-], обладает высокой гибкостью и может образовывать многие структуры, обладающие низкой энергией. Этот циклический октапептид не имеет ассоциаций внутри цикла и не ограничен до единственной конформации для образования различных эпитопов.

В работе G. Abbenante et al. "Conformational Control by Thiazole and Oxazoline Rings in Cyclic Octapeptides of Marine Origin. Novel Macrocyclic Chair and Boat Conformations; J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10384-10388 также раскрывается циклический пептид 2, c[Ile-Thr-D-(Val)Thz-Ile-Thr-D-(Val)ThZ-], у которого в растворе обнаруживалась единственная конформация псевдокресла. Также был синтезирован циклический пептид 7, c[(Ile)Oxn-D-(Val)-Thz-(Ile)Oxn-D-(Val)Tnz-], дающий высокоограниченный макроцикл с конформацией псевдокресла или седла. Циклический октапептид 8, полученный путем кислого гидролиза 7, принимал конформацию лодки, обладающую большей гибкостью. Эти циклические октапептиды являются до некоторой степени ограниченными благодаря присутствию оксазолинов и/или тиазолов, но они не формируют различных эпитопов.

В работе R. M. Cusack et al, Conformations of cyclic octapeptides and the influence of heterocyclic ring constraints upon calcium binding; J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2, 2000, 323-331 раскрываются четыре циклических октапептида, различающихся по количеству гетероциклических тиазольных и оксазолиновых колец-ограничителей. Пептиды 1, 2 и 3 в растворе принимали различные конформации. Эти циклические октапептиды являются до некоторой степени ограниченными благодаря присутствию оксазолинов и/или тиазолов, но они не формируют различных эпитопов.

В работе R. M. Cusack et al, Conformations of cyclic octapeptides and the influence of heterocyclic ring constraints upon calcium binding; J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2, 2000, 323-331 раскрывается также пептид 4, не содержащий оксазолиновых и тиазольных колец, и молекулярное моделирование показало, что такие циклические пептиды, не содержащие никаких ограничений помимо водородных связей, оказываются очень гибкими и потенциально могут принимать большое число конформаций в растворе. Пептид 4 не содержит ассоциаций внутри цикла и не ограничен до единственной конформации для формирования различных эпитопов.

Ниже циклический олигопептид согласно настоящему изобретению будет описан более детально.

Циклический олигопептид состоит из цикла, содержащего, по меньшей мере, шесть аминокислотных остатков, где цикл содержит несколько аминокислотных доменов, где каждый домен содержит, по крайней мере, два аминокислотных остатка, образующих эпитоп, и две или более ассоциирующих функциональных группы.

В одном воплощении, циклический олигопептид состоит из цикла из шести аминокислотных остатков, где цикл состоит из двух аминокислотных доменов, и каждый домен состоит из двух аминокислотных остатков, образующих эпитоп, и двух ассоциирующих функциональных групп. В предпочтительном воплощении циклический олигопептид состоит из цикла из восьми аминокислотных остатков, где цикл состоит из двух аминокислотных доменов, каждый домен состоит из трех аминокислотных остатков, образующих эпитоп, и двух ассоциирующих функциональных групп.

В альтернативном воплощении циклический олигопептид состоит из цикла из более чем восьми аминокислотных остатков. В этом воплощении, предпочтительно цикл содержит три ассоциирующих функциональных группы, образующие ассоциации внутри цикла, приводящие к образованию трех аминокислотных доменов, каждый из которых содержит три аминокислотных остатка, образующих эпитоп.

Аминокислотные остатки, входящие в состав циклического олигопептида, могут представлять собой любые натуральные аминокислоты, их производные, содержащие замены, аналоги и их D-формы.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения используются три аминокислотных остатка, образующих эпитоп, с чередующимися стереохимическими конфигурациями, т.е. L-D-L или D-L-D. Это чередование является особенно благоприятным, поскольку позволяет боковым цепям аминокислотных остатков, образующих эпитоп, ориентироваться в плоской конфигурации и разворачиваться в одну и ту же сторону. Это дает возможность аминокислотным остаткам, образующим эпитоп, оказаться в непосредственной близости друг от друга для образования эпитопа.

В альтернативном воплощении циклический олигопептид состоит из цикла из десяти аминокислотных остатков, где цикл состоит из двух аминокислотных доменов, а каждый домен состоит из четырех аминокислотных остатков, образующих эпитоп, и двух ассоциирующих функциональных групп. Аминокислотные остатки, образующие эпитоп, могут иметь одну и ту же или чередующиеся стереохимические конфигурации, т.е. L-L-L-L, D-D-D-D, L-D-L-L, L-L-D-L, L-L-L-D, D-L-L-L, L-L-D-D, D-D-L-L, L-D-L-D, D-L-D-L, L-D-D-L, D-L-L-D, D-L-D-D, D-D-L-D, D-D-D-L или L-D-D-D.

Ассоциирующие функциональные группы расположены в циклическом олигопептиде таким образом, что они образуют одну или несколько ассоциаций внутри цикла, посредством которых циклический олигопептид оказывается ограниченным до единственной конформации таким образом, что аминокислотные остатки, образующие эпитоп, образуют эпитоп в каждом домене. Образование единственной конформации циклическим олигопептидом может быть измерено с помощью различных методов, известных из уровня техники. Для определения конформации циклического олигопептида могут использоваться стандартные спектроскопические методы такие как ¹Н ЯМР-спектроскопия, круговой дихроизм, вращательная дисперсия или рентгеновская кристаллография.

Аминокислотные остатки, образующие эпитоп, образуют эпитоп в каждом домене, поскольку циклический олигопептид ограничен до единственной конформации одной или более ассоциациями внутри цикла. Образованные эпитопы способны специфически связываться с лигандом. Специфические структуры эпитопа и лиганда не ограничены в настоящем изобретении. Целью настоящего изобретения является получение олигопептидного каркаса, презентирующего различные эпитопы, состоящие из любой подходящей комбинации двух или более аминокислотных остатков, образующих эпитоп, их аналогов или производных, таким образом, что эти аминокислотные остатки, образующие эпитоп, удерживаются в стабильной конфигурации, обладающей жесткостью, достаточной для прочного связывания эпитопа со специфическим лигандом, таким, как рецептор. Специалисту в уровне техники известна последовательность аминокислотных остатков, образующих эпитоп, или способ получения эпитопа, взаимодействующего с лигандом, такой как способ, раскрытый в заявке на международный патент WO 01/01140. Специалист в уровне техники не нуждается в подробных химических структурах всех возможных эпитопов, поскольку подбор подходящих аминокислотных остатков для формирования эпитопов не представляет для него трудности. Любая последовательность аминокислотных остатков, образующих эпитоп, может оказаться подходящей в той или иной ситуации, и это зависит от конкретного лиганда. Далее, порядок аминокислотных остатков в каждом домене может определять активность образованного эпитопа и также зависит от конкретного лиганда. Необязательно знать точную химическую структуру лиганда при условии, что известна биологическая активность лиганда. Аминокислотные остатки, образующие эпитоп, могут быть включены в циклический олигопептид согласно настоящему изобретению без необходимости знания точной химической структуры лиганда, поскольку возможно измерить биологическую функцию, ассоциированную с лигандом, чтобы определить, имело ли место взаимодействие эпитопа с лигандом. Для специалиста в уровне техники не представляет трудности на основании экспериментальных данных, полученных на подходящей экспериментальной модели, выбор аминокислот для включения в циклический олигопептид в качестве аминокислотных остатков, образующих эпитоп, и определение порядка аминокислотных остатков в каждом домене, обеспечивающего наилучшую биологическую активность, путем анализа желаемой активности.

Примеры тестов на обнаружение взаимодействия между циклическим олигопептидом и лигандом могут включать методы связывания, например, использующие принцип иммуноферментного анализа для обнаружения взаимодействия между антителом и антигеном. Другие подходящие методы in vitro включают изменение флуоресценции чувствительных к окружению мембраносвязанных флуоресцентных проб, реакции преципитации, стимуляцию или ингибирование энзиматической активности и т.д. Также применимы методы, основывающиеся на способности материалов изменять поведение клеток, культивируемых in vitro, такие как анализ гибели клеток, пролиферации клеток, апоптоза, ингибирования или стимуляции межклеточных контактов, секреции цитокинов и других растворимых белков, синтеза специфических мРНК, внутриклеточного везикулярного транспорта, изменения процессов передачи сигналов в клетке и т.д. Также могут использоваться методы in vivo на интактных животных или людях, например, включение радиоактивной метки в циклический олигопептид и последующее изучение его распределения после введения в организм различными путями.

Эпитоп образуется в каждом домене. Таким образом, в циклическом олигопептиде образуется не менее двух эпитопов, предпочтительно два или три. Эпитопы в циклическом олигопептиде могут быть одинаковыми или различными. В случае различных эпитопов в циклическом олигопептиде каждый домен может содержать другие аминокислотные остатки или те же аминокислотные остатки в другом порядке. Примером такого эпитопа может служить эпитоп, образуемый комбинацией аминокислотных остатков серина (S), фенилаланина (F) и аргинина (R), связывающийся с рецептором на поверхности макрофагов. Связывание эпитопа с рецептором на поверхности клетки подавляет секрецию TNF.

Ассоциации внутри цикла

Одна или более ассоциаций внутри цикла служат для ограничения циклического олигопептида до единственной конформации с различными аминокислотными доменами. Аминокислотные остатки, образующие эпитоп, сильно ограничены и обладают очень небольшой свободой движения. Это обеспечивает формирование в каждом домене стабильного эпитопа, способного более стабильно и специфично взаимодействовать с лигандом для генерации биологического ответа.

Количество ассоциирующих функциональных групп в каждом циклическом олигопептиде и тип выбранных ассоциирующих функциональных групп зависит от аминокислотных остатков, образующих эпитоп, и лиганда. Количество и тип ассоциирующих функциональных групп могут влиять на биологическую активность олигопептида. Для специалиста в уровне техники не представляет трудности выбор для использования наиболее эффективного типа ассоциирующих функциональных групп с помощью анализа желаемой активности.

Одну или более ассоциаций внутри цикла образуют две или более ассоциирующих функциональных групп, расположенных соответствующим образом. Как минимум одна ассоциирующая функциональная группа предпочтительно расположена между аминокислотными доменами.

Одна или более ассоциаций внутри цикла могут быть ковалентными или нековалентными. Ассоциирующие функциональные группы в циклическом олигопептиде могут быть одинаковыми или различными.

Ассоциирующие функциональные группы могут присоединяться к ассоциирующим аминокислотным остаткам. В одном воплощении ассоциирующие функциональные группы представляют собой боковые цепи ассоциирующих аминокислотных остатков или модифицированные боковые цепи ассоциирующих аминокислотных остатков или группы, присоединенные к боковым цепям ассоциирующих аминокислотных остатков. Структура I, приведенная ниже, иллюстрирует пример этого воплощения.

В качестве альтернативы, ассоциирующие функциональные группы могут присоединяться к атомам азота в пептидных связях в кольце циклического олигопептида путем замещения водорода, связанного с азотом. Структура II, приведенная ниже, иллюстрирует пример этого воплощения.

Еще в одном альтернативном воплощении, ассоциирующие функциональные группы могут присоединяться к другим подходящим для этого группам, расположенным внутри олигопептидного цикла, отличным от аминокислотных остатков. Примером такой группы может служить альфагидроксикарбоксикислота, где гидроксильная группа участвует в образовании сложноэфирной связи вместо пептидной связи.

Термин «две или более ассоциирующие функциональные группы» включает следующие воплощения:

- при нековалентной ассоциации внутри цикла:

ассоциирующие функциональные группы представляют собой две группы в боковом обрамлении олигопептидного цикла, присоединенные к ассоциирующим аминокислотным остаткам в составе цикла, ассоциирующие с образованием нековалентной ассоциации;

ассоциирующие функциональные группы представляют собой две группы в боковом обрамлении олигопептидного цикла, присоединенные к атомам азота в пептидных связях в составе цикла, ассоциирующие с образованием нековалентной ассоциации;

ассоциирующие функциональные группы представляют собой две группы в боковом обрамлении олигопептидного цикла, присоединенные к другим подходящим группам, расположенным внутри цикла, ассоциирующие с образованием нековалентной ассоциации; или

- при ковалентной ассоциации внутри цикла:

ассоциирующие функциональные группы представляют собой две группы, присоединенные к ассоциирующим аминокислотным остаткам в составе цикла, связанные между собой с образованием ковалентной ассоциации напрямую либо посредством линкера, такого как бифункциональная группа;

ассоциирующие функциональные группы представляют собой две группы, присоединенные к атомам азота в пептидных связях в составе цикла, связанные между собой с образованием ковалентной ассоциации напрямую либо посредством линкера, такого как бифункциональная группа;

ассоциирующие функциональные группы представляют собой две группы, присоединенные к другим подходящим группам, расположенным внутри цикла, связанные между собой с образованием ковалентной ассоциации напрямую либо посредством линкера, такого как бифункциональная группа.

Термин «присоединена» означает, что ассоциирующие группы связаны напрямую или посредством линкера с ассоциирующими аминокислотными остатками, атомами азота или другими подходящими группами.

В предпочтительном воплощении одна или более ассоциаций внутри цикла между ассоциирующими функциональными группами являются нековалентными. Нековалентные ассоциации внутри цикла особенно предпочтительны в настоящем изобретении, так как они придают циклическому олигопептиду оптимальный баланс между жесткостью и гибкостью. Циклический олигопептид обладает достаточной жесткостью для поддержания единственной конформации пептидного остова и обеспечения достаточной близости и правильного расположения аминокислотных остатков, образующих эпитоп, для правильного формирования эпитопа, способного специфически связываться с лигандом. Также циклический олигопептид обладает достаточной гибкостью, обеспечивающей достаточную подвижность боковых цепей аминокислотных остатков, образующих эпитоп, что позволяет им адаптироваться к точной структуре лиганда, с которым они могут связываться. Таким образом, циклические олигопептиды согласно настоящему изобретению, содержащие нековалентные ассоциации внутри цикла, могут взаимодействовать со своим лигандом более стабильно и специфично для генерации биологического ответа.

Ассоциации внутри цикла предпочтительно являются гидрофобными. В особенно предпочтительном воплощении присутствуют два аминокислотных домена и две липофильные ассоциирующие функциональные группы.

Использование нековалентных ассоциаций внутри цикла, в особенности путем гидрофобных взаимодействий, обладает преимуществом, поскольку при этом ассоциации внутри цикла могут образовываться посредством взаимодействий между тремя или более ассоциирующими функциональными группами. Это дает возможность формирования трех или более аминокислотных доменов, что является затруднительным при использовании ковалентных ассоциаций внутри цикла. Соответственно, в других предпочтительных воплощениях настоящего изобретения циклический олигопептид может содержать три или более ассоциирующих функциональных группы, формирующие ассоциации внутри цикла, для образования трех или более аминокислотных доменов. Использование липофильных ассоциирующих функциональных групп для образования нековалентных ассоциаций внутри цикла путем гидрофобных взаимодействий обладает особым преимуществом при больших размерах циклического олигопептида.

Ассоциирующие функциональные группы, расположенные подходящим образом для образования одной или более нековалентных ассоциаций внутри цикла, могут представлять собой любую молекулу, присоединенную к подходящей группе, обладающей соответствующей стереохимией, которая образует часть цикла циклического олигопептида. Ассоциирующие функциональные группы предпочтительно присоединены к ассоциирующим аминокислотным остаткам или их аналогам, примеры которых приведены ниже, однако могут использоваться и другие группы, пригодные к введению в циклический олигопептид. В общем случае предпочтительно, чтобы группы, к которым присоединяются ассоциирующие функциональные группы, были связаны в кольце пептидными связями. В альтернативном воплощении, одна или более пептидных связей могут заменяться другими типами связей. Примеры таких связей включают сложноэфирные связи, эфирные связи, сложные тиоэфирные связи и простые тиоэфирные связи. В некоторых случаях это может быть желательно для предотвращения расщепления протеазами в биологических жидкостях.

Ассоциирующие аминокислотные остатки могут включать остатки натуральных аминокислот с присоединенными ассоциированными функциональными группами.

Предпочтительные ассоциирующие аминокислотные остатки представляют собой липидные аналоги аминокислот. Например, ассоциирующие аминокислотные остатки могут быть получены на основе остатков цистеина, глицина, лизина, аспартата или глутамата. В случае цистеина, ассоциирующая функциональная группа может представлять собой алифатическую группу, присоединенную к боковой цепи цистеина через сульфгидрильную группу. Таким же образом можно использовать лизин, аспартат и глутамат, добавляя ассоциирующую функциональную группу к боковой цепи. В качестве альтернативы, ассоциирующий аминокислотный остаток может представлять собой аминокислотный остаток, в котором остаток боковой цепи представляет собой единственную алифатическую группу, составляющую ассоциирующую функциональную группу. Например, в случае если ассоциирующий аминокислотный остаток основывается на глицине, водородный атом в альфа-положении глицина может заменяться на алифатическую группу, которая и составляет ассоциирующую функциональную группу.

Алифатическая группа, упомянутая выше, которая может образовывать ассоциирующую функциональную группу, предпочтительно представляет собой алифатическую углеводородную цепь, которая предпочтительно содержит от 8 до 20 углеродных атомов, более предпочтительно содержит от 10 до 16 углеродных атомов, наиболее предпочительно 10 или 12 углеродных атомов и может быть насыщенной или ненасыщенной, линейной или разветвленной, и незамещенной или замещенной полностью или частично, например, атомами галогенов. В качестве альтернативы, алифатическая цепь может быть построена из силановых компонентов.

В типичной структуре I, приведенной ниже, ассоциирующая аминокислота представляет собой глицин, в котором водородный атом в альфа-положении заменен на углеводородную цепь С₁₀.

В одном воплощении, где ассоциирующие функциональные группы присоединены к атомам азота в пептидных связях в кольце, нековалентные ассоциации внутри цикла, такие как гидрофобные ассоциации, могут осуществляться путем замены атомов водорода на азоте в пептидных связях на ассоциирующие функциональные группы, такие как, например, алифатическую группу, определенную выше.

Замена атома водорода на атоме азота в пептидной связи в циклическом олигопептиде согласно настоящему изобретению на ассоциирующую функциональную группу может быть осуществлена путем замены атома водорода на метиленовую группу, несущую подходящую функциональную группу, такую как, например, -SH, -OH или -NH₂, с последующей дериватизацией ассоциирующей функциональной группой, такой как алифатической группой, определенной выше.

В одном аспекте настоящего изобретения, где атом азота принадлежит пептидной связи, связывающей аминокислотные остатки, образующие эпитоп, из различных аминокислотных доменов, циклический олигопептид согласно настоящему изобретению может иметь следующую структуру II:

где A, B, C, X, Y и Z обозначают аминокислотные остатки, образующие эпитоп, N обозначает азот, принадлежащий пептидным связям между B и Z и между C и Y, и Ф обозначает ассоциирующие функциональные группы, определенные выше, присоединенные к атомам азота.

Еще одно преимущество использования нековалентных, в особенности гидрофобных, ассоциирующих функциональных групп, состоит в том, что это дает возможность образовываться димерам или олигомерам, содержащим множественные повторяющиеся эпитопы, ориентированные в разных направлениях, с помощью межмолекулярных взаимодействий, где гидрофобные ассоциирующие группы разных циклических олигопептидов ассоциируют друг с другом. Насколько такие взаимодействия окажутся возможными, зависит от структуры последовательности циклического олигопептида, определяющей относительную гидрофильность аминокислотных доменов. Это можно далее регулировать путем тщательного подбора ассоциирующих функциональных групп, у которых можно варьировать хиральность и размер боковой цепи с целью точного регулирования площади открытой гидрофобной поверхности олигопептида. Это может обладать определенными преимуществами при регулировании межмолекулярных взаимодействий с другими циклическими олигопептидами с конформационными ограничениями, или взаимодействий с другими молекулами, такими как белки или циклодекстрины. Это может обладать определенными преимуществами при получении небольших мультимерных структур, состоящих из двух или более циклических олигопептидов согласно настоящему изобретению, способных одновременно связываться с двумя или более рецепторами на клеточной поверхности, так что рецепторы образуют поперечную связь, в результате чего клетка получает сильный сигнал активации и запускает сигнальный каскад.

Взаимодействия циклических олигопептидов согласно настоящему изобретению с другими неидентичными циклическими олигопептидами согласно настоящему изобретению могут обладать преимуществами при получении мультимерных структур, обладающих множественной функциональностью благодаря различным эпитопам, привнесенным в структуру различными олигопептидами. Таким образом, например, один олигопептид может содержать один или два эпитопа, связывающиеся с рецепторами, что приводит к интернализации мультимерной структуры, в то время как второй олигопептид в составе мультимерной структуры может содержать один или более эпитопов, способных взаимодействовать с компонентами сигнального каскада внутри клетки после интернализации.

Связывание циклодекстринов с циклическими олигопептидами согласно настоящему изобретению может помочь снизить уровень взаимодействий между гидрофобными частями различных олигопептидов и таким образом предотвратить образование крупных агрегатов, вероятно, обладающих пониженной активностью по сравнению с мономерами или олигомерами из-за стерических ограничений, накладываемых на эпитопы в таких крупных агрегатах.

В растворах белков, таких как альбумин или желатин, один или более циклических олигопептидов согласно настоящему изобретению могут связываться с поверхностью белка в результате ассоциаций липофильных компонентов гидрофобных ассоциирующих функциональных групп в пептиде с областями белка, обладающими сродством к алкильным или ацильным углеводородным цепям. Такое связывание одного или более циклических олигопептидов согласно настоящему изобретению с поверхностью крупного белка является одним из способов презентации множественных эпитопов на циклических олигопептидах таким образом, что максимально усиливается активация сигнальных взаимодействий в клетке.

В дальнейшем воплощении, одна или более ассоциаций внутри цикла между ассоциирующими функциональными группами являются ковалентными. В этом воплощении, ассоциирующие функциональные группы также могут присоединяться к ассоциирующим аминокислотам. Например, ассоциирующие функциональные группы могут представлять собой боковые цепи цистеинов (ассоциирующих аминокислотных остатков), и ассоциация образуется с помощью внутрикольцевой дисульфидной связи между этими боковыми цепями. В качестве альтернативы, ассоциирующие аминокислотные остатки могут представлять собой лизин и глутамат, способные ассоциировать ковалентно путем образования пептидной связи посредством терминальных групп своих боковых цепей (ассоциирующие функциональные группы), или глутамат и серин, способные реагировать с образованием сложноэфирной связи. Также могут использоваться аналоги этих аминокислот, несущие те же функциональные группы.

В одном воплощении ковалентная ассоциация внутри цикла достигается за счет замещения водородов, связанных с атомами азота в пептидных связях цикла на ассоциирующие функциональные группы, образующие ковалентные ассоциации. Ассоциирующие функциональные группы могут представлять собой тиолы или другие цепи, несущие на своих концах функциональные группы, которые могут образовывать ковалентную ассоциацию. Замена атома водорода на азоте пептидной связи в циклическом олигопептиде согласно настоящему изобретению ассоциирующей функциональной группой может производиться путем замены атома водорода метиленовой группой, несущей подходящую функциональную группу, такую как, например, -SH, -OH или -NH₂, с последующим связыванием функциональной группы с бифункциональным реагентом. Ковалентная ассоциация образуется путем замены второго атома водорода (на азоте пептидной связи, расположенной подходящим образом на циклическом олигопептиде) со второй метиленовой группой, несущей подходящую функциональную группу, и вышеупомянутый бифункциональный реагент дополнительно связывается с функциональной группой этой второй метиленовой группы с образованием ковалентной связи между двумя атомами азота пептидных связей в циклическом олигопептиде. В зависимости от природы ассоциирующих функциональных групп, включенных в циклические олигопептиды, для этого подходят бифункциональные реагенты, содержащие короткую цепь, в которой в каждом терминальном положении находится функциональная группа, выбранная, но не ограниченная следующим списком: карбоксильные, амино-, гидроксильные, сульфгидрильные, бромо-, йодо-, циано-, азо-, и боронокислые груп