Способ лечения иммунной дисфункции, такой как реакция "трансплантат против хозяина" или "хозяин против трансплантата"

Способ лечения иммунной дисфункции, такой как реакция "трансплантат против хозяина" или "хозяин против трансплантата"

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки США номер 11/269 736, поданной 9 ноября 2005, которая является частичным продолжением заявки США номер 11/151 689, поданной 13 июня 2005, которая является частичным продолжением заявки США номер 10/963 444, поданной 11 октября 2004 (оставленной без движения), которая является частичным продолжением заявки США номер 10/048 757, поданной 1 февраля 2002, которая является перешедшей на национальную стадию заявкой США PCT/US00/21387, поданной 4 августа 2000 и опубликованной 15 февраля 2001 на английском языке как WO 01/11011, по которой испрашивается в соответствии с 35 U.S.С. §119(е) приоритет предварительных заявок США номера 60/147 324, поданной 5 августа 1999, и номера 60/164 650, поданной 10 ноября 1999, и частичным продолжением заявки США номер 10/467 963, поданной 11 августа 2003, которая является перешедшей на национальную стадию заявкой США PCT/US02/04652, поданной 14 февраля 2002 и опубликованной 22 августа 2002 на английском языке как WO 02/064748, по которой испрашивается в соответствии с 35 U.S.С. §119(е) приоритет предварительных заявок США номера 60/268 786, поданной 14 февраля 2001, номера 60/269 062, поданной 15 февраля 2001, номера 60/310 625, поданной 7 августа 2001, и номера 60/343 836, поданной 25 октября 2001, все эти заявки и публикации приведены в данный документ в качестве ссылки в полном объеме, и для настоящей заявки испрашивается полное преимущество их приоритета.

Область техники, к которой относится изобретение

Областью техники, к которой относится изобретение, является иммуномодуляция полипотентными зрелыми клетками-предшественниками («МАРС») и их применение для модулирования иммунного ответа в основных и дополнительных лечебных мероприятиях.

Уровень техники изобретения

Терапевтическое использование органных трансплантатов, включая трансплантаты костного мозга, неуклонно возрастало со времени их первого применения. Это стало важным способом выбора лечения большого числа заболеваний, включая, но ими не ограничиваясь, гематологические, иммунологические и онкологические заболевания.

К сожалению, терапевтическое использование трансплантации часто осложняется, оказывается неэффективным или прерывается отрицательным иммунным ответом, вызванным трансплантатом. К числу наиболее выраженных отрицательных реакций, с которыми приходится сталкиваться вследствие трансплантации, относятся (i) реакция «хозяин против трансплантата» («HVG») (отторжение трансплантата иммунокомпетентным хозяином) и (ii) заболевание «трансплантат против хозяина» («GVHD») (процессы, которые обнаруживаются в основном в иммунокомпрометированном хозяине, если он распознается иммунокомпетентными клетками трансплантата как чужеродный).

Конечно, отторжения трансплантата у хозяина можно было бы избежать полной совместимостью донора и хозяина. Однако, за исключением аутологичной ткани, лишь однояйцевых близнецов можно считать в самом деле сингенными. Полная совместимость конкретного донора и другого конкретного хозяина/реципиента практически невозможна. Таким образом, использование аутологичной ткани представляет собой единственный способ добиться полной совместимости. К сожалению, ткань хозяина, как правило, не пригодна или не была выделена до возникновения такой необходимости. Зачастую необходимость в трансплантации возникает, по существу, для замены поврежденной ткани хозяина. Поэтому сингенную ткань, несмотря на эффективное решение проблем отрицательного ответа хозяина на пересаженную ткань, как правило, использовать на практике невозможно.

При невозможности сингенной совместимости отрицательные иммунные эффекты, которые возникают при трансплантации, можно смягчить насколько это возможно совместимостью аллогенных донора и хозяина. Для повышения шансов на успех лечения используют типирование крови и/или ткани на совместимость доноров и хозяев. Но даже самая точная совместимость аллогенной ткани, тем не менее, не предотвращает тяжелой реакции HVG и, соответственно, трансплантация включает применение иммуносупрессии и иммуносупрессорных лекарственных препаратов, что обсуждается ниже.

Другим подходом для предотвращения осложнений HVG, возникающих при трансплантации, являлось повреждение иммунной системы реципиентного хозяина. Этого добивались, используя радиационную терапию и/или иммуносупрессорную химиотерапию и/или антитела. Полученная супрессия иммунного ответа хозяина часто довольно эффективно способствует приживлению трансплантата (такого как костный мозг) в хозяине. Однако иммуноабляция или супрессия повреждает иммунную защиту хозяина. Это приводит к тому, что хозяин становится крайне восприимчивым к инфекциям даже после незначительного воздействия инфекционных агентов. Присоединение инфекции является основной причиной заболеваемости и смертности среди пациентов, перенесших трансплантацию.

Повреждение иммунной системы хозяина также вызывает или отягощает другую серьезную проблему, с которой сталкиваются при трансплантации - заболевание «трансплантат против хозяина» («GVHD»). GVHD имеет место, если ткань донора содержит иммунокомпетентные клетки, которые распознают белки МНС реципиента как чужеродные. Это приводит к активации Т-клеток, и они секретируют цитокины, такие как IL-2 (интерлейкин 2), IFNγ (интерферон гамма) и TNFα (фактор некроза опухоли альфа). Эти сигналы запускают иммунную атаку на мишени реципиента, к которым относятся кожа, желудочно-кишечный тракт, печень и лимфоидные органы (Ferrara and Deeg, 1991). GVHD представляет собой особенно большую проблему в трансплантатах костного мозга, где, как было показано, оно должно опосредоваться в первую очередь Т-лимфоцитами (Grebe and Streilein, 1976). Фактически, у примерно 50% пациентов с трансплантированным костным мозгом развивается острое GVHD. Многие из этих пациентов умирают (от 15% до 45%).

Существуют также и другие дисфункции, расстройства и заболевания иммунной системы, которые возникают как первичные патологии и как вторичные эффекты других патологий и/или их лечения. К ним относятся новообразования, патологии костного мозга, патологии крови, аутоиммунные заболевания и некоторые воспалительные заболевания, как дополнительно обсуждается ниже. Основная и дополнительная терапия этих расстройств и заболеваний, подобно основной и дополнительной терапии HVG и GVHD, часто включает использование иммуносупрессорных лекарственных препаратов. Все применяемые в настоящее время способы лечения имеют недостатки и побочные эффекты.

Иммуносупрессирующие лекарственные препараты

Большие усилия были направлены на разработку лекарственных препаратов для лечения этих дисфункций иммунной системы, чтобы смягчить или устранить их негативные эффекты, не вызывая дополнительных отрицательных побочных эффектов. В стремлении к этой цели достигнут некоторый прогресс, и для профилактики и/или лечения этих дисфункций было разработано и используется большое число лекарственных препаратов. Введение более эффективных из этих лекарственных препаратов расценено как огромное достижение в практической трансплантологии, но не является идеальным. В действительности, ни одно из иммуносупрессорных лекарственных препаратов, на сегодняшний день доступных для клинического использования в трансплантации, не является абсолютно эффективным. Все лекарственные препараты имеют серьезные недостатки и отрицательные побочные эффекты, как вкратце обобщается ниже. Для обзора см. статью Farag (2004), «Хроническое заболевание трансплантат против хозяина: куда мы движемся?», Bone Marrow Transplantation 33: 569-577.

Кортикостероиды, которые используют в основном для лечения воспаления и воспалительных заболеваний, известны как иммуносупрессоры и многими считаются оптимальным основным лечением HVG и GVHD. Они, по крайней мере, частично ингибируют пролиферацию Т-клеток и иммунные реакции, зависящие от Т-клеток, ингибируя экспрессию определенных генов цитокинов, включенных в активацию Т-клеток и иммунный ответ, зависящий от Т-клеток.

Циклоспорин является одним из наиболее часто используемых лекарственных препаратов для иммунной супрессии и профилактики HVG и GVHD. В большинстве случаев он является сильным иммуносупрессором. Несмотря на то, что он может эффективно снижать отрицательные иммунные реакции у пациентов, перенесших трансплантацию, он также ослабляет иммунную систему настолько, что пациенты остаются легко восприимчивыми к инфекциям. Следовательно, пациентам гораздо легче заразиться при воздействии патогенов, и они имеют незначительную способность добиться эффективного иммунного ответа на инфекции. Даже условно-патогенные микроорганизмы впоследствии могут стать опасными для жизни. Циклоспорин также вызывает множество других нежелательных побочных эффектов.

Метотрексат также широко используется для профилактики и лечения HVG и GVHD самостоятельно или в сочетании с другими лекарственными препаратами. Исследованиями было показано, что если он и эффективен, то, по-видимому, менее эффективен, чем циклоспорин. Как и циклоспорин, метотрексат вызывает множество побочных эффектов, некоторые из них могут оказаться пагубными для здоровья пациентов.

FK-506 представляет собой макролид-подобное соединение. Как и циклоспорин, его получают из грибов. Иммуносупрессорные эффекты циклоспорина и FK-506 схожи. Образуя гетеродимерный комплекс с соответствующими им цитоплазматическими рецепторными белками (т.е. с циклофилином и FK-связывающим белком), они блокируют начальные процессы Т-клеточной активации. Это впоследствии приводит к ингибированию фосфатазной активности кальцийнейрина, посредством чего, в конечном счете, ингибируя экспрессию ядерных регуляторных белков и генов, отвечающих за Т-клеточную активацию.

К другим лекарственным препаратам, используемым для иммуносупрессии, относятся антитимоцитарный глобулин, азатиоприн и циклофосфамид. Их преимущества не были подтверждены. Для блокирования иммунного ответа, активированного Т-клетками, также использовали рапамицин, другое макролид-подобное соединение, которое влияет на ответ Т-клеток на IL-2. У экспериментальных животных для ингибирования отторжения аллотрансплантата было найдено производное микофеноловой кислоты RS-61443. Мизорибин, имидазольный нуклеозид, блокирует биосинтез пурина и ингибирует пролиферацию стимулированных митогеном Т- и В-клеток способом, подобным азатиоприну и RS-61443. На доклинических моделях трансплантации у дезоксиспергуалина, синтетического аналога спергуалина, обнаружили способность проявлять иммуносупрессорные свойства. Антиметаболит бреквинар натрия является ингибитором дигидрооротатдегидрогеназы и посредством ингибирования синтеза пиримидина блокирует образование нуклеотидов уридина и цитидина. Берберин и его фармакологически приемлемые соли использовали в качестве иммуносупрессора для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как ревматизм, для лечения аллергии и для профилактики отторжения трансплантата. Было сообщено, что берберин ингибирует продукцию антител В-клетками и, как правило, подавляет гуморальный иммунный ответ, но не влияет на пролиферацию Т-клеток. См. патент Японии 07-316051 и патент США № 6 245 781.

Ни один из этих иммуносупрессорных лекарственных препаратов, используют ли его самостоятельно или в сочетании с другими средствами, не является абсолютно эффективным. Все они, как правило, все же оставляют пациентов восприимчивыми к HVG и GVHD и снижают их способность защищаться против инфекции. Это делает их гораздо более чувствительными к инфекции и гораздо менее способными победить инфекции при заражении. Более того, все эти лекарственные препараты вызывают тяжелые побочные эффекты, включая в числе прочих, например, желудочно-кишечную токсичность, нефротоксичность, гипертонию, миелосупрессию, гепатотоксичность и гипертрофию десен. Ни один из них не подтвердил, что лечение этим препаратом полностью приемлемо или эффективно. В целом, учитывая эти недостатки, в настоящее время не существует полностью удовлетворяющего фармацевтически приемлемого лечения отрицательной дисфункции иммунной системы и/или реакций, таких как HVG и GVHD.

Долгое время полагали, что можно было бы разработать более специфичный тип иммунной супрессии, лишенный этих недостатков. Например, средство, которое бы супрессировало или устраняло конкретно аллореактивные Т-клетки, должно быть эффективно против HVG и GVHD (по меньшей мере, для аллогенных трансплантатов) без отрицательных побочных эффектов, возникающих при использовании средств, которые в целом разрушают и повреждают иммунную систему. Однако до сих пор такого(их) средства(в) не разработано.

Использование в трансплантации стволовых клеток

с ограниченными потенциями

Недавно вызвало интерес использование стволовых клеток вместо или вместе с иммуносупрессорными средствами. В этой области получены некоторые обнадеживающие результаты. За последние несколько лет выделили и охарактеризовали большое число стволовых клеток. Они варьируют от клеток с сильно ограниченным потенциалом дифференциации и ограниченной способностью культурального роста до клеток, по-видимому, с неограниченным потенциалом дифференциации и неограниченной способностью культурального роста. Как правило, первые проще извлечь и можно получить из большого числа тканей взрослого индивида. Последние можно было бы получить из герминативных клеток и эмбрионов, их называют эмбриональными стволовыми («ES») клетками, эмбриональными герминативными («EG») клетками и герминативными клетками. Эмбриональные стволовые («ES») клетки обладают неограниченной способностью самоподдержания и могут дифференцироваться во все типы клеток. ES клетки получают из внутренней клеточной массы бластоцисты. Эмбриональные герминативные («EG») клетки получают из примордиальных герминативных клеток постимплантационного эмбриона. Значение стволовых клеток, полученных из ткани взрослого индивида, оказалось ограниченным, поскольку они являются иммуногенными, обладают ограниченным потенциалом дифференциации и ограниченной способностью размножения в культуре. ES, EG и герминативные клетки лишены этих недостатков, но у них наблюдается заметная предрасположенность к образованию тератом у аллогенных хозяев, чаще реализуемая из-за важности их использования в лечении. Поэтому существует пессимистичная точка зрения относительно их ценности для практического применения, несмотря на их преимущественно обширный потенциал дифференциации. Стволовые клетки, полученные из эмбрионов, также являются предметом этических разногласий, что может препятствовать их использованию в лечении заболеваний.

Определенные усилия по поиску альтернативы ES, EG и герминативным клеткам сосредоточены на клетках, полученных из ткани взрослого индивида. Между тем как стволовые клетки взрослого индивида были идентифицированы в большинстве тканей млекопитающих, их потенциал дифференциации ограничен и намного уже, чем у ES, EG и герминативных клеток. В самом деле, многие такие клетки могут давать рост лишь одному или нескольким типам дифференцированных клеток, а многие другие ограничиваются одной эмбриональной линией дифференцировки.

Например, гематопоэтические стволовые клетки могут дифференцировать лишь с образованием клеток гематопоэтической линии, нервные стволовые клетки дифференцируются лишь в клетки нейроэктодермального происхождения, а мезенхимные стволовые клетки («MSC») ограничиваются клетками мезенхимного происхождения. Вследствие приведенного выше рассмотрения ограничений, рисков и противоречий и отношения к ES, EG и герминативным клеткам, в основной части работы по использованию стволовых клеток в трансплантации применяли MSC. Результаты, полученные за последние несколько лет, наглядно показывают, что аллотрансплантаты MSC не вызывают иммунную реакцию HVG, которая является ответом, всегда наблюдаемым в случае трансплантации между аллогенными индивидами иной ткани. Более того, результаты указывают на то, что MSC, по крайней мере, при определенных условиях ослабляют иммунный ответ лимфоцитов.

Вместе с тем, эти результаты непосредственно указывают на то, что MSC могли бы использоваться для уменьшения HVG и/или GVHD, которые обычно должны совровождать аллогенную трансплантацию, поскольку наблюдаемые иммуносупрессорные эффекты MSC оказались в большой степени дозозависимыми, и для проявления иммуносупрессорного эффекта требовались относительно высокие дозы. Фактически, снижение пролиферации лимфоцитов в анализах смешанной культуры лимфоцитов in vitro «замечали» лишь при соотношении MSC к лимфоцитам 1:10 или выше. Более того, наблюдаемый эффект ингибирования снижался и становился неощутимым как при снижении дозы MSC, так и при соотношениях наличия клеток MSC, фактически представленных для стимуляции пролиферации Т-клеток, ниже 1:100. Подобные дозозависимые эффекты также наблюдали в анализах стимулированной митогеном пролиферации лимфоцитов. См. для анализа статьи Ryan et al. (2005) «Мезенхимные стволовые клетки предотвращают аллогенное отторжение», J. Inflammation 2: 8; Le Blanc (2003) «Иммуномодулирующие эффекты мезенхимных стволовых клеток эмбриона и взрослого индивида», Cytotherapy 5(6): 485-489, и Jorgensen et al. (2003) «Инженерия мезенхимных стволовых клеток для иммунотерапии», Gene Therapy 10: 928-931. Дополнительные результаты суммируются ниже.

Например, Bartholomew с соавторами обнаружили, что MSC павиана не стимулировали аллогенные лимфоциты к пролиферации in vitro и что MSC уменьшали пролиферацию митогенстимулированных лимфоцитов более чем на 50% в анализах смешанной культуры лимфоцитов in vitro. Они дополнительно показали, что введение MSC in vitro увеличивает жизнеспособность трансплантата кожи (по сравнению с контролями). Как для результатов, полученных in vitro, так и для результатов, полученных in vivo, требовались высокие дозы MSC: для результатов, полученных in vitro, соотношение с лимфоцитами 1:1. Количество MSC, которое должно потребоваться при таком подходе к соотношению in vivo у людей может оказаться слишком высоким с практической точки зрения. Это может ограничить ценность MSC. См. Bartholomew et al. (2002): «Мезенхимные стволовые клетки подавляют пролиферацию лимфоцитов in vitro и продляют срок жизни трансплантата кожи in vivo», Experimental Hematology 30: 42-48.

Maitra с соавторами изучили эффекты MSC человека на приживление аллогенных клеток пуповинной крови человека после совместной инфузии в облученных сублетальными дозами мышей NOD-SCID. Они обнаружили, что MSC человека способствуют приживлению и не активируют аллогенные Т-клетки в in vitro исследованиях пролиферации. Они также обнаружили, что MSC человека подавляют in vitro активацию аллогенных Т-клеток человека митогеном. Эти эффекты оказались дозозависимыми и для супрессии требовались относительно высокие соотношения. (Maitra et al. (2004) Bone Marrow Transplantation 33: 597-604.)

Недавно Le Blanc с соавторами сообщили об успехе лечения одного пациента с острым GVHD IV степени, которая, как правило, является фатальной, введением «HLA-гаплоидентичных» MSC. Пациентом был 9-летний мальчик с острым лимфобластным лейкозом, который находился в своей третьей ремиссии. Вначале пациент получал радиотерапию и циклофосфамид, после чего вводили клетки крови, которые были идентичны его собственным клеткам по локусам HLA-A, HLA-B и HLA-DRбета1. Их получили от донора, женщины, которая не была ему родственницей. Несмотря на интенсивную терапию, включающую введение большого количества иммуносупрессантов, на 70 день после трансплантации у пациента развилось острое GVHD IV степени. Его многократно поразили инвазивные бактериальные, вирусные и грибковые инфекции.

В этой критической ситуации была сделана попытка трансплантировать другие стволовые клетки крови. От матери пациента выделяли гаплоидентичные MSC и выращивали in vitro в течение трех недель. Клетки собирали и вводили пациенту внутривенно в количестве 2×10⁶ клеток на килограмм. Ни признаков токсичности, ассоциированной с MSC, ни существенных побочных эффектов выявлено не было. Многие симптомы исчезли в течение нескольких дней после трансплантации; но остаточные явления болезни были заметны. После нескольких дополнительных внутривенных инъекций MSC теми же способами симптомы и GVHD пациента полностью исчезли. После выписки пациент находился в ремиссии еще один год. Согласно авторам, в их эксперименте этот пациент уникален в смысле выживаемости при GVHD такой степени тяжести. Результаты, сообщенные Le Blanc et al, являются как многообещающими, так и вдохновляющими и должны стать стимулом для разработки эффективных способов лечения, в которых использовались бы стволовые клетки. Le Blanc et al. (2004) «Лечение тяжелой формы острого заболевания «трансплантат против хозяина» HLA-гаплоидентичными мезенхимными стволовыми клетками», Lancet 363: 1439-41.

И все-таки эти результаты, включая и результаты Le Blanc с соавторами, выявляют возможные недостатки MSC. Клетки необходимо вводить стандартными иммуносупрессорными способами, которые впоследствии продолжат вызывать негативные иммунные реакции. Очевидно, чтобы достичь эффекта, понадобится очень высокая дозировка MSC, что повлечет увеличение стоимости, большую трудоемкость введения, больший риск развития токсичности и других опасных побочных эффектов и другие недостатки.

В свете этих ограничений для используемой в настоящее время стволовой клетки, основанной на способах лечения, связанных с трансплантацией, явно существует крайняя необходимость в клетках-предшественниках, которые можно было бы использовать всем - или хотя бы большинству - реципиентов без необходимости совместимости гаплотипов хозяин-реципиент. Кроме того, существует необходимость в клетках с большей «специфической активностью», поскольку они являются терапевтически эффективными при меньших дозах, и их введение не ставит проблем, связанных со схемами лечения большими дозами, требуемыми для получения положительных результатов при использовании MSC. Кроме того, существует необходимость в клетках, которые имели бы по существу неограниченный потенциал дифференциации для образования клеток, которые появились бы в организме, нуждающемся в этом.

Соответственно, существовала потребность в клетках, которые имели бы способность ES, EG и герминативных клеток к самоподдержанию и дифференциации, но не были бы иммуногенными; не формировали бы тератом при аллотрансплантации или ксенотрансплантации хозяину; не вызывали бы других проблем, связанных с безопасным использованием, возникающих при применении ES, EG и герминативных клеток; без труда выделялись бы из легко доступных источников, таких как плацента, пуповина, пуповинная кровь, кровь и костный мозг; могли бы надежно храниться в течение длительного периода; могли быть получены легко и без риска для добровольцев, доноров или пациентов и других людей, давших согласие на это; и не вызывали бы технических и материальных трудностей, сопровождающих получение и работу с ES, EG и герминативными клетками.

Недавно выделили и охарактеризовали тип клеток, названных в данном документе полипотентными зрелыми клетками-предшественниками («МАРС») (см., например, патент США № 7015037, который приведен в качестве ссылки в полном объеме). («МАРС» также может обозначаться как «MASC».) Эти клетки обладают многими преимуществами ES, EG и герминативных клеток, не имея многих их недостатков. Например, МАРС способны неограниченно долго культивироваться без потери своего потенциала дифференциации. В мышах NOD-SCID у них наблюдается эффективное долгосрочное приживление и самостоятельные многочисленные направления дифференцировки, и все это без данных о формировании тератомы (часто наблюдаемой с ES, EG и герминативными клетками) (Reyes, M. and C.M. Verfaillie (2001) Ann N Y Acad Sci. 938: 231-5).

Сущность изобретения

В некоторых своих вариантах осуществления, поэтому, изобретение относится к клеткам, которые: (i) не являются ни эмбриональными стволовыми клетками, ни эмбриональными герминативными клетками, ни герминативными клетками; (ii) могут дифференцироваться по меньшей мере в один тип клеток любого по меньшей мере из двух из эмбриональных линий - эндодермальной, эктодермальной и мезодермальной; (iii) при введении несингенному индивиду не провоцируют отрицательный иммунный ответ; и (iv) при введении индивиду могут модулировать иммунный ответ. В этом отношении в определенных вариантах осуществления изобретение относится к клеткам, которые, в дополнение к вышеуказанному, являются иммуносупрессорными. Более того, в соответствии с вышеуказанным, различные варианты осуществления изобретения относятся к клеткам, которые обладают иммуномодулирующими свойствами, что можно использовать в лечении, таком как предотвращение, профилактика, улучшение, снижение, уменьшение, минимизация, устранение и/или излечение негативных иммунных реакций и/или процессов в хозяине. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки используют в этой связи самостоятельно или совместно с другими терапевтическими средствами и способами воздействия, такими как основные терапевтические способы воздействия. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки используют в дополнительном терапевтическом способе воздействия, в котором их можно использовать либо в качестве единственного терапевтического средства, либо совместно с другими терапевтическими средствами. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки используют, самостоятельно или с другими терапевтическими средствами или способами воздействия, как в одном или нескольких основных терапевтических способах воздействия, так и в одном или нескольких дополнительных терапевтических способах воздействия.

Согласно изобретению, в данном документе клетки описываются более подробно и, как правило, в данном документе называются «полипотентными зрелыми клетками-предшественниками», сокращенно «МАРС». Нужно отдать должное тому, что эти клетки не являются ни ES, ни EG, ни герминативными клетками, и что они способны дифференцироваться в типы клеток, по меньшей мере, двух из трех линий первичных зародышевых слоев (эктодермы, мезодермы и эндодермы), т.е. в клетки всех трех первичных линий.

Например, МАРС могут образовывать среди многих других следующие клетки и другие клетки их линий дифференцировки: внутренние клетки мезодермы, мышечные клетки, клетки костной ткани, клетки хрящевой ткани, эндокринные клетки, экзокринные клетки, эндотелиальные клетки, клетки, образующие волосы, клетки, формирующие зубы, висцеральные клетки мезодермы, гематопоэтические клетки, стромальные клетки, стромальные клетки костного мозга, нейрональные клетки, нейроэктодермальные клетки, эпителиальные клетки, клетки глаза, клетки поджелудочной железы и гепатоцит-подобные клетки. В числе клеток, образуемых МАРС, среди многих других присутствуют остеобласты, хондробласты, адипоциты, клетки скелетных мышц, скелетные миоциты, клетки билиарного эпителия, ацинозные клетки поджелудочной железы, мезангиальные клетки, гладкомышечные клетки, клетки сердечной мышцы, кардиомиоциты, остеоциты, клетки, образующие сосуды, олигодендроциты, нейроны, включая серототинэргические, GABAэргические, допаминэргические нейроны, клетки глии, клетки микроглии, эпителиальные клетки поджелудочной железы, клетки эпителия кишечника, эпителиальные клетки печени, клетки эпителия кожи, эпителиальные клетки почки, клетки почечного эпителия, клетки панкреатического островка, фибробласты, гепатоциты и другие клетки тех же линий, что и вышеуказанные.

МАРС обладают теломеразной активностью, необходимой для самосохранения, и, как полагают, необходимой для поддержания в недифференцированном состоянии. Как правило, они также экспрессируют oct-3/4. Oct-3/4 (oct-3A у людей) в остальных случаях специфичен для ES, EG и герминативных клеток. Его рассматривают как маркер недифференцированных клеток, которые обладают способностью к обширной дифференциации. В основном полагают также, что oct-3/4 имеет значение в поддержании клетки в недифференцированном состоянии. Oct-4 (oct-3 у людей) представляет собой фактор транскрипции, экспрессируемый в эмбрионе на стадии предгаструлы, в эмбрионе на ранней стадии дробления, в клетках внутренней клеточной массы бластоцисты и в клетках эмбриональной карциномы («ЕС») (Nichols, J. et al. (1998) Cell 95: 379-91), и подавляется, когда клетки индуцируются к дифференциации. Ген oct-4 (oct-3 у людей) у людей транскрибируется по меньшей мере в двух вариантах сплайсинга, oct-3А и oct-3В. Вариант сплайсинга oct-3В обнаруживают во многих дифференцированных клетках, тогда как сообщается, что вариант сплайсинга oct-3А (также ранее названный oct-3/4) специфичен для недифференцированных стволовых клеток эмбриона. См. статью Shimozaki et al. (2003) Development 130: 2505-12. Экспрессия oct-3/4 играет важную роль в определении ранних этапов эмбриогенеза и дифференциации. Oct-3/4 в сочетании с rox-1 вызывает активацию транскрипции белка rex-1, содержащего «цинковые пальцы», который также требуется для поддержания клеток ES в недифференцированном состоянии (Rosfjord, E. and Rizzino, A. (1997) Biochem Biophys Res Commun 203: 1795-802; Ben-Shushan, E. et al. (1998) Mol Cell Biol 18: 1866-78).

Как правило, МАРС также экспрессируют другие маркеры, считающиеся специфичными для первичных стволовых клеток. К ним относятся rex-1, rox-1 и sox-2. Rex-1 находится под контролем oct-3/4, который активирует экспрессию расположенного ниже rex-1. Rox-1 и sox-2 экспрессируются в клетках, отличных от ES.

Различные варианты осуществления изобретения относятся к способам использования МАРС для предотвращения, профилактики, лечения, улучшения, снижения, уменьшения, минимизации, устранения и/или излечения заболевания и/или отрицательного иммунного ответа и/или процессов у индивида. Определенные варианты осуществления изобретения относятся к способам использования самих клеток в качестве основного терапевтического способа воздействия. В некоторых вариантах осуществления изобретения в качестве основного терапевтического способа воздействия используют клетки вместе с одним или несколькими другими средствами и/или терапевтическими способами воздействия. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки используют в качестве дополнительного терапевтического способа воздействия, то есть в качестве дополнительного к другому, основному терапевтическому способу воздействия. В некоторых вариантах осуществления клетки используют в качестве единственного действующего вещества дополнительного терапевтического способа воздействия. В других клетки используют в качестве дополнительного терапевтического способа воздействия вместе с одним или несколькими другими средствами или способами терапевтического воздействия. В некоторых вариантах осуществления клетки используют как в качестве основных, так и в качестве дополнительного терапевтических средств и/или способов воздействия. В обоих случаях клетки можно использовать самостоятельно и в основном и/или в дополнительном способе воздействия. Их также можно использовать вместе с другими терапевтическими средствами или способами воздействия в основном или в дополнительном способе воздействия или в обоих способах.

Как обсуждалось выше, основное лечение представляет собой терапевтическое средство, терапию и/или терапевтический способ воздействия, мишени (то есть то, на что хотят воздействовать) представляют собой основную дисфункцию, такую как заболевание, то есть то, что нужно лечить. Дополнительное лечение, такое как терапия и/или терапевтический способ воздействия, можно применять в сочетании с основным лечением, таким как терапевтическое средство, терапия и/или терапевтический способ воздействия, для воздействия на основную дисфункцию, такую как заболевание, и для дополнения эффекта основного лечения, тем самым, увеличивая эффективность всего лечебного режима. Дополнительное лечение, такое как средство, терапия и/или терапевтический способ воздействия, также можно применять для воздействия на осложнения и/или побочные эффекты, вызванные основной дисфункцией, такой как заболевание, и/или вызванные лечением, таким как терапевтическое средство, терапия и/или терапевтический способ воздействия. В отношении любых из этих применений, один, два, три или более основных способов лечения можно использовать совместно с одним, двумя, тремя или более дополнительными способами лечения.

В некоторых вариантах осуществления МАРС вводят индивиду до появления дисфункции, такой как заболевание, побочный эффект и/или отрицательный иммунный ответ. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят при развитии дисфункции. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят после стабилизации дисфункции. Клетки можно вводить на любом этапе в процессе развития, персистирования и/или распространения дисфункции или после ее снижения.

Как рассмотрено выше, варианты осуществления изобретения относятся к клеткам и способам основной или дополнительной терапии. В определенных вариантах осуществления изобретения клетки вводят аллогенному индивиду. В некоторых вариантах осуществления они аутологичны индивиду. В некоторых вариантах осуществления они сингенны индивиду. В некоторых вариантах осуществления клетки являются ксеногенными для индивида. В различных вариантах осуществления изобретения МАРС, будь они аллогенными, аутологичными, сингенными или ксеногенными, являются слабо иммуногенными или неиммуногенными для индивида. В некоторых вариантах осуществления МАРС обладают достаточно низкой иммуногенностью или являются неиммуногенными и, как правило, не вызывающими отрицательный иммунный ответ, так что при введении аллогенным индивидам их можно использовать в качестве «универсальных» донорных клеток без типирования тканей и анализа на совместимость. В соответствии с различными вариантами осуществления изобретения МАРС также можно хранить и поддерживать в банках клеток и, таким образом, иметь в распоряжении для использования в случае необходимости.

Во всех этих и других смыслах, варианты осуществления изобретения относятся к клеткам МАРС млекопитающих, включая людей в одном из вариантов осуществления, а в других вариантах осуществления обезьян, крыс и мышей, собак, свиней, коз, овец, лошадей и коров. МАРС, полученные от млекопитающих, как описано выше, могут быть использованы во всех способах и других аспектах описанного в данном документе изобретения.

В соответствии с различными вариантами осуществления изобретения МАРС можно выделить из множества отделов тела и тканей таких млекопитающих, включая, но ими не ограничиваясь, костный мозг, кровь, селезенку, печень, мышцы, мозг и другие, обсуждаемые ниже. В некоторых вариантах осуществления МАРС перед использованием культивируют.

В некоторых вариантах осуществления МАРС создают генно-инженерными способами, например, для улучшения их иммуномодулирующих свойств. В некоторых вариантах осуществления генно-инженерные МАРС получают культивированием in vitro. В некоторых вариантах осуществления генно-инженерные МАРС получают из трансгенного организма.

В различных вариантах осуществления МАРС вводят индивиду любым способом для эффективной доставки средств клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят инъекционно, включая местное и/или системное введение. В определенных вариантах осуществления клетки вводят внутрь и/или поблизости от участка дисфункции, на который им предназначено воздействовать. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят инъекционно в область, расположенную на расстоянии от участка дисфункции. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят системно, например, внутривенной инъекцией.

В некоторых вариантах осуществления МАРС вводят однократно, двукратно, трехкратно или более, чем три раза до достижения желаемого терапевтического эффекта или пока не станет ясно, что продолжение введения не принесет пользы индивиду. В некоторых вариантах осуществления МАРС вводят непрерывно в течение некоторого времени, например, внутривенно капельно. Можно вводить МАРС в течение короткого отрезка времени, в течение нескольких дней, недель, месяцев, лет или в течение более продолжительного отрезка времени.

В следующих пронумерованных параграфах описывается несколько наглядных вариантов осуществления изобретения, которые поясняют некоторые из его аспектов и особенност