Гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение

Гибридный инсектицидный белок, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая такой белок, трансгенные растения и их семена, содержащие такой белок, способ получения белка и его применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к отраслям белковой инженерии, молекулярной биологии растений и борьбы с вредителями. Более конкретно, изобретение относится к новым сконструированным гибридным белкам, обладающим инсектицидной активностью, к нуклеиновым кислотам, результатом экспрессии которых являются эти инсектицидные белки, а также к способам получения и способам применения этих инсектицидных белков и соответствующих нуклеиновых кислот в борьбе с насекомыми.

Насекомые-вредители являются главной причиной потерь урожая. Только в США ежегодные потери, вызванные инвазией различных видов насекомых, составляют миллиарды долларов. Кроме того, что насекомые-вредители приводят к потерям урожая полевых культур, они также причиняют неприятности производителям овощей и фруктов, досаждают садоводам и домовладельцам.

Самыми вредоносными кукурузными вредителями считаются разные виды кукурузного корневого жука. Наиболее значительными его видами в США являются Diabrotica virgifera virgifera, западный кукурузный корневой жук, D.longicornis barberi, северный кукурузный корневой жук и D.undecimpunctata howardi, южный кукурузный корневой жук. Основными кукурузными вредителями в Кукурузном поясе США считаются только западный и северный кукурузные корневые жуки. Важным видом кукурузного корневого вредителя в южной части США является мексиканский кукурузный корневой жук, Diabrotica virgifera zeae. Наиболее существенный вред растению наносят личинки кукурузного корневого жука, поскольку они питаются исключительно корнями кукурузы. Этот вред выражается в увеличении полегания растений, снижении урожая зерна и растительной массы, а также в изменении содержания питательных веществ в зерне. Осуществление питания личинками оказывает также косвенное воздействие на кукурузу тем, что в его результате в корнях открываются ходы для инвазии бактерий и грибков, что приводит к болезням, выражающимся в гниении корня и стебля. Взрослые особи кукурузного корневого жука проявляют свою активность на кукурузных полях поздним летом, когда они питаются початками, «шелком», а также пыльцой, что препятствует нормальному опылению.

Борьбу с кукурузными корневыми жуками ведут главным образом путем интенсивного применения химических пестицидов, активность которых проявляется через препятствование росту насекомых, предотвращение их питания или размножения или же гибель насекомых. Таким путем может быть достигнут хороший результат в борьбе против кукурузного корневого жука, однако иногда эти химикаты могут воздействовать и на другие, полезные организмы. Другой проблемой, проявляющейся в результате широкого применения химических пестицидов, является появление видов насекомых, устойчивых к ним. Еще одна проблема вызвана тем, что личинки кукурузного корневого жука питаются под землей, что затрудняет их контакт с вносимыми инсектицидами. Поэтому в большинстве случаев применение инсектицидов осуществляется профилактически, во время посева. Результатом этой практики является большой вред для окружающей среды. Частично этот вред удалось снизить за счет применения различных способов ведения фермерского хозяйства, однако потребность в альтернативных механизмах борьбы с вредителями постоянно растет.

Биологические агенты борьбы с вредителями, такие как штаммы Bacillus thuringiensis (Bt), экспрессирующие пестицидные токсины, такие как δ-эндотоксины (дельта-эндотоксины, которые также называются кристаллическими токсинами или Cry-белками), также применялись для хлебных злаков и показали удовлетворительные результаты главным образом в борьбе с чешуекрылыми насекомыми-вредителями. Эти δ-эндотоксины представляют собой белки, заключенные в кристаллическую матрицу, известные своей инсектицидной активностью, проявляющейся при проглатывании их определенными видами насекомых. Классификация различных δ-эндотоксинов была выполнена на основе их спектра активности и гомологии последовательностей. До 1990 г. основные классы определялись по их спектру активности, причем белки Cry1 обладают активностью против чешуекрылых (молей и бабочек), белки Сry2 обладают активностью как против чешуекрылых, так и против двукрылых (мух и комаров), белки Сry3 обладают активностью против жесткокрылых (жуков), а белки Сry4 обладают активностью в борьбе против двукрылых (Hofte и Whitely, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255). В1998 г. была разработана новая номенклатура, которая дала систематическую классификацию Cry-белков на основе гомологии последовательности аминокислот, а не на активности по отношению к определенным видам насекомых (Crickmore и др. 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:807-813).

Спектр инсектицидной активности отдельного δ-эндотоксина из Bt является довольно узким, то есть данный δ-эндотоксин проявляет активность только против небольшого числа видов в данном отряде насекомых. Например, известно, что токсин Сry3А обладает очень высокой токсичностью по отношению к колорадскому картофельному жуку, Leptinotarsa decemlineata, однако обладает очень слабой или нулевой токсичностью по отношению к родственным жукам из рода Diabrotica (Johnson и др., 1993, J. Econ. Entomol. 86:330-333). Согласно работе Slaney и др. (1992, Insect Biochem. Molec. Biol. 22:9-18) токсичность токсина Сry3А, по меньшей мере, в 2000 раз слабее по отношению к личинкам южного кукурузного корневого жука, чем по отношению к колорадскому картофельному жуку. Известно также, что токсичность Сry3А по отношению к западному кукурузному корневому жуку или к северному кукурузному корневому жуку очень слабая или совсем отсутствует.

Специфичность δ-эндотоксинов является результатом эффективности различных шагов, предпринятых в процессе производства активного токсичного белка, и его последующего взаимодействия с эпителиальными клетками в средней кишке насекомого. Для того чтобы обладать инсектицидными свойствами, большинство из известных δ-эндотоксинов должны попасть в организм насекомого путем проглатывания и протеолитически активироваться для образования активного токсина. Активация инсектицидных кристаллических (Cry) белков представляет собой многоэтапный процесс. После проглатывания насекомым кристаллы должны в первую очередь раствориться в пищеварительном канале насекомого. После растворения δ-эндотоксины активируются путем специфичного протеолитического расщепления. Протеазы в пищеварительном канале насекомого могут играть важную роль в специфичности путем определения места, где перерабатывается δ-эндотоксин. После того как δ-эндотоксин растворился и переработался, он привязывается к определенным рецепторам на поверхности эпителия средней кишки насекомого, а впоследствии интегрируется в липидный бислой мембраны щеточной каемки. Затем формируются ионные каналы, нарушающие нормальное функционирование средней кишки, в конечном итоге приводя к гибели насекомого.

У чешуекрылых, уровень pH в пищеварительных каналах которых является щелочным, протеазы кишечника перерабатывают δ-эндотоксины, например, Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1B и Cry1F, из протоксинов размером 130-140 кДа в токсичные белки размером приблизительно 60-70 кДа. Процесс переработки протоксина в токсин, согласно опубликованным данным, осуществляется путем перемещения как N-концевых, так и С-концевых аминокислот, а точное местоположение процесса переработки зависит от конкретного δ-эндотоксина, и участие в нем принимают специфичные текучие вещества пищеварительного канала насекомого (Ogiwara и др., 1992, J. Invert. Pathol. 60:121-126). Таким образом, процесс активации требует отщепления всего С-концевого хвостового участка протоксина. Эта протеолитическая активация δ-эндотоксина может играть значительную роль в определении его специфичности.

Жесткокрылые насекомые имеют пищеварительные каналы с уровнем кислотности от более нейтрального до кислотного, и δ-эндотоксины, специфичные для жесткокрылых, подобны по своему размеру активированным токсинам, специфичным для чешуекрылых. Поэтому прежде считалось, что переработка δ-эндотоксинов, специфичных для жесткокрылых, не является необходимой для их токсичности. Однако, исходя из полученных данных, можно предположить, что δ-эндотоксины, активные против жесткокрылых, растворяются и протеолитически перерабатываются в токсичные полипептиды меньшего размера. Белковый δ-эндотоксин Сry3А размером 73 кДа, вырабатываемый бактериями В.thuringiensis var. tenebrionis, легко поддается переработке в бактерии на N-конце, теряя 49-57 остатков в процессе формирования кристалла или после него, образуя в итоге обычную изолированную форму размером 67 кДа (Carroll и др., 1989, Biochem. J. 261:99-105). В своей работе McPherson и др. (1988, Biotechnology 6:61-66) также продемонстрировали, что нативная кодирующая последовательность сry3А содержит два функциональных кодона, инициирующих трансляцию, в одной и той же рамке считывания, один - для кодирования белка размером 73 кДа, а другой - для кодирования белка размером 67 кДа, начиная соответственно с Met-1 и Met-48 расшифрованной последовательности аминокислот. Поэтому оба белка могут считаться полноразмерными белками Сry3А природного происхождения.

По мере расширения знаний о том, как функционируют δ-эндотоксины, увеличилось число попыток разработать δ-эндотоксины, обладающие новыми видами активности. Разработка δ-эндотоксинов стала более возможна в результате определения трехмерной структуры Сry3А в 1991 г. (Li и др., 1991, Nature 353:815-821). Li и др. определили, что белок Сry3А имеет три структурных домена: N-концевой домен I, из остатков 58-290, состоящий из семи α-спиралей, домен II, из остатков 291-500, состоящий из трех β-листов в упаковке так называемым греческим ключом, а также С-концевой домен III, из остатков 501-644, представляющий собой β-сэндвич в так называемой упаковке рулетом. Также была определена трехмерная структура активного против чешуекрылых токсина Cry1Aa (Grochulski и др., 1995, J. Mol. Biol. 254:447-464). Токсин Cry1Aa имеет три домена: N-концевой домен I, из остатков 33-253, домен II из остатков 265-461, а также домен III из остатков 463-609 с дополнительной внешней цепочкой в одном из β-листов из остатков 254-264. Если структуры Сry3А и Cry1Aa спроектировать на другие последовательности Cry1, то к домену I относятся аминокислотные остатки от 28 до 260, к домену II - приблизительно от 260 до 460, а к домену III - приблизительно от 460 до 600. См. работы Nakamura и др., Agric. Biol. Chem. 54(3): 715-724 (1990); Li и др., Nature 353: 815-821 (1991); Ge и др., J. Biol. Chem. 266(27): 17954-17958 (1991); и Honee и др., Mol. Microbiol. 5(11):2799-2806 (1991); каждая из которых включена в настоящую заявку путем ссылки. Таким образом, в настоящее время известно, что на основе гомологии последовательности аминокислот известные Bt δ-эндотоксины имеют подобную трехмерную структуру, состоящую из трех доменов.

Токсинная часть Bt Cry-белков также характеризуется наличием пяти консервативных блоков по их последовательности аминокислот, имеющих номера от СВ1 до СВ5, расположенных в таком порядке на протяжении от N-конца до С-конца (Hofte и Whiteley, см. выше). Консервативный блок 1 (СВ1) содержит приблизительно 29 аминокислот, консервативный блок 2 (СВ2) содержит приблизительно 67 аминокислот, консервативный блок 3 (СВ3) содержит приблизительно 48 аминокислот, консервативный блок 4 (СВ4) содержит приблизительно 10 аминокислот, а консервативный блок 5 (СВ5) содержит приблизительно 12 аминокислот. Последовательности, расположенные перед этими пятью консервативными блоками и после них, являются в высокой степени вариабельными, а поэтому называются «вариабельными участками» V1-V6. В типичном случае домен I Bt δ-эндотоксина состоит из вариабельного участка 1, консервативного блока 1, вариабельного участка 2 и 52-х N-концевых аминокислот консервативного блока 2. Домен II в типичном случае состоит из С-концевых аминокислот (приблизительно 15) консервативного блока 2, вариабельного участка 3 и N-концевых аминокислот (приблизительно 10) консервативного блока 3. Домен III в типичном случае состоит из С-концевых аминокислот (приблизительно 38) консервативного блока 3, вариабельного участка 4, консервативного блока 4, вариабельного участка 5 и консервативного блока 5. Активные против чешуекрылых токсины Cry1, как и другие дельта-токсины, имеют вариабельный участок 6, состоящий приблизительно из 1-3 аминокислот, лежащий в пределах домена III.

Многие Bt-штаммы и δ-эндотоксины являются активными по отношению к различным видам насекомых и нематод. Однако относительно небольшое число этих штаммов и токсинов обладают активностью против жесткокрылых насекомых. Кроме того, большинство активных по отношению к жесткокрылым δ-эндотоксинов, известных в настоящее время, например, Сry3А, Сry3В, Сry3С, Cry7А, Сry8А, Сry8В и Сry8С, обладают недостаточной оральной токсичностью против кукурузного корневого жука, что не позволяет обеспечить адекватные меры борьбы с ним в случае подачи их через микробы и трансгенные растения. Поэтому существует необходимость разработки других подходов для производства новых токсинов, активных против кукурузного корневого жука.

Были разработаны активные против чешуекрылых δ-эндотоксины в попытках улучшения специфической активности или расширения спектра инсектицидной активности. Например, домен специфичности для тутового шелкопряда (Bombyx mori) из белка Cry1Aa переместили в белок Cry1Ас, таким образом наделив новой инсектицидной активностью полученный в результате гибридный Bt-белок (Ge и др. 1989, PNAS 86: 4037-4041). Кроме того, Bosch и др. 1998 (Патент США 5,736,131, включенный в настоящую заявку путем ссылки) описывает гибридные токсины Bacillus thuringiensis, содержащие на своем С-конце домен III первого Cry-белка, а на своем N-конце - домены I и II второго Cry-белка. Такие гибридные токсины продемонстрировали изменившуюся инсектицидную специфичность против чешуекрылых насекомых. Например, гибридный токсин Н04, описанный также в источнике De Maagd и др., Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537-1543 (1996), содержит на своем N-конце домены I и II белка Cry1Ab, а на своем С-конце - домен III белка Cry1C. Согласно полученным данным, Н04 обладает высокой токсичностью по отношению к чешуекрылому насекомому Spodoptera exigua (свекловичная совка) по сравнению с родительским токсином Cry1Ab, а также значительно большей токсичностью по сравнению с родительским токсином Cry1C. Также было показано, что заменой домена III в токсинах, не являющихся активными против свекловичной совки, таких как Cry1E и Cry1Ab, на домен III из Cry1C, являющегося активным против свекловичной совки, можно получить гибридные токсины, обладающие активностью против этого насекомого. Во всех гибридах, описанных в работе Bosch и др., используются домены из Cry-белков, активных против чешуекрылых, для получения новых токсинов с активностью против чешуекрылых. Полученные результаты дают основание предполагать, что домен III белка Cry1C является важным определителем специфичности относительно свекловичной совки. См. также источники Bosch и др., FEMS Microbiology Letters 118: 129-134 (1994); Bosch и др., Bio/Technology 12: 915-918 (1994); De Maagd и др., Appl. Environ. Microbiol. 62(8): 2753-2757 (1996); и De Maagd и др., Mol. Microbiol. 31(2): 463-471 (1999); каждый из которых включен сюда путем ссылки.

Имеются данные о нескольких попытках разработки 5-эндотоксинов, активных против жесткокрылых. Chen и Stacy (Патент США 7,030,295, включенный сюда путем ссылки) успешно создали токсин, активный против кукурузного корневого жука, путем введения не встречающегося в природе сайта узнавания протеазы в домен I, в домен III, или как в домен I, так и в домен III белка Сry3А. Один из полученных в результате модифицированных Сry3А-белков, обозначенный Сry3А055, в домен I которого ввели сайт узнавания протеазы, оказался активным по отношению к различным видам Diabrotica. Van Rie и др., 1997 (Патент США №. 5,659,123) разрабатывали Сry3А путем произвольной замены аминокислот, считающихся важными в вопросе доступности растворителю, в домене II на аминокислоту аланин. Некоторые из этих произвольных замен в домене II, согласно полученным данным, проявились в повышении активности против западного кукурузного корневого жука. Однако другие исследователи показали, что некоторые замены аланином в домене II белка Сry3А дали в результате разрушение связи с рецептором или нестабильность структуры (Wu и Dean, 1996, J. Mol. Biol. 255: 628-640). Согласно данным English и др., 1999 (Номер публикации международной патентной заявки WO 99/31248) в результате замены аминокислот в Сry3Вb повысилась токсичность против южного и западного кукурузного корневого жука. Однако из полученных данных по 35 мутантам Сry3Вb видно, что только три из них, с мутациями в основном в домене II и на стыке домен I - домен II, оказались активными против западного кукурузного корневого жука. Кроме того, вариации токсичности исходного Сry3Вb против западного кукурузного корневого жука в одних и тех же пробах превышали различия между подвергшимися мутациям токсинами Сry3Вb и исходными токсинами Сry3Вb. Shadenkov и др. (1993, Mol. Biol. 27:586-591) получили гибридный белок путем слияния аминокислот 48-565 белка Сry3А с аминокислотами 526-725 белка Cry1Aa. Таким образом, скрещивание последовательностей Сry3А и Cry1Aa произошло в консервативном блоке 4, расположенном в домене III. Сry3А является очень активным против колорадского картофельного жука (Leptinotarsa decemlineata). Однако гибридный белок, описанный Shadenkov и др., не был активным против колорадского картофельного жука, несмотря на то, что гибридный белок состоял из последовательности Сry3А более чем на 75%. Таким образом, добавление только 25% последовательности Cry1Aa уничтожило активность против жесткокрылых насекомых, которой обладал родительский белок Сry3А. Это позволяет предположить, что гибридные белки, полученные путем слияния части Cry-белка, активного против жесткокрылых, например белка Сry3А, с активным против чешуекрылых Cry-белком, например Cry1A, не будут обладать активностью против жесткокрылых насекомых, в частности против жесткокрылого насекомого, не имеющего такой природной восприимчивости к Сry3А, как у кукурузного корневого жука.

Исходя из вышеописанного, очевидно, что остается потребность разработки новых эффективных средств борьбы с вредителями, которые были бы экономически выгодными фермерам и приемлемыми для окружающей среды. В особенности, нужны такие белки, обладающие токсичностью против видов Diabrotica, главного вредителя кукурузы, способ действия которых отличался бы от существующих средств борьбы с вредителями в плане ослабления развития сопротивляемости. Кроме того, желательно, чтобы подача таких средств борьбы осуществлялась через продукты, минимизирующие вред для окружающей среды, например через трансгенные растения.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В свете этих потребностей целью настоящего изобретения является предоставление новых сконструированных гибридных инсектицидных белков (сГИБов). Такие новые сГИБы получают путем слияния уникальных комбинаций вариабельных участков и консервативных блоков, по меньшей мере, двух различных Cry-белков и, по выбору, включения протоксинного хвостового участка из Bt Cry-белка в С-конец, или N-концевого пептидильного фрагмента, или того и другого. Не ограничивающим примером является комбинирование полных или неполных вариабельных участков и консервативных блоков из первого Cry-белка, обладающего активностью против жесткокрылых, с полными или неполными вариабельными участками и консервативными блоками второго Cry-белка, обладающего активностью против чешуекрылых и отличающегося от первого Cry-белка, и, по выбору, включение протоксинной хвостовой области из активного против чешуекрылых Bt Cry-белка или N-концевого пептидильного фрагмента, или обоих, в результате чего получаются новые сконструированные гибридные инсектицидные белки, обладающие активностью против спектра насекомых, отличающегося от спектра первого или второго родительских Cry-белков или того и другого. Такие новые сГИБы могут содержать полные или неполные вариабельные участки, консервативные блоки или домены из модифицированного белка Сry3А, а также из Cry-белка, отличающегося от модифицированного белка Сry3А. Пептидильный фрагмент может наделять сГИБ инсектицидной активностью, или может делать инсектицидную активность сГИБа более высокой, чем у сГИБа, не имеющего пептидильного фрагмента, или может делать сГИБ более стабильным, чем сГИБ, не имеющий пептидильного фрагмента. Токсичность сГИБа по настоящему изобретению против кукурузного корневого жука (Diabrotica sp.) неожиданно оказалась удивительно высокой. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим данный сГИБ или комплементарным к гибридизирующемся в жестких условиях рекомбинантным гибридным нуклеиновым кислотам по настоящему изобретению.

Кроме того, в изобретение включены векторы, содержащие такие рекомбинантные (или комплементарные к ним) нуклеиновые кислоты, растение или микроорганизм, включающие в себя такие нуклеиновые кислоты и дающие возможность их экспрессии, например трансгенная кукуруза; потомство таких растений, в котором содержаться нуклеиновые кислоты, устойчиво включенные в него и наследуемые согласно Менделю, а также/или семена таких растений и такого потомства.

Изобретение также включает в себя композиции и формулировки, содержащие сГИБы, обладающие возможностью ингибировать способность насекомых выживать, расти и размножаться, или позволяющие ограничить причиняемый насекомыми ущерб урожаю зерновых, например, путем применения этих сГИБов или композиций или формулировок в местах инвазии насекомых или профилактической обработкой восприимчивых к насекомым площадей или растений для защиты их от насекомых-вредителей.

Кроме того, изобретение относится к способу получения сГИБов и к способам использования нуклеиновых кислот, например, в микроорганизмах, для борьбы с насекомыми или в трансгенных растениях для придания защиты от насекомых.

Описанные здесь новые сГИБы обладают высокой активностью против насекомых. Например, сГИБы по настоящему изобретению можно использовать для борьбы с серьезными вредителями-насекомыми, такими как западный кукурузный корневой жук (Diabrotica virgifera virgifera), северный кукурузный корневой жук (D. longicornis barberi) и мексиканский кукурузный корневой жук (D. virgifera zeae). Некоторые сГИБы можно также применять для борьбы с европейским мотыльком кукурузным (Ostrinia nubilalis) и другими чешуекрылыми насекомыми. СГИБы можно применять отдельно или в комбинации с другими стратегиями борьбы с насекомыми для получения максимальной эффективности борьбы с вредителями при минимальном вреде для окружающей среды.

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения станут понятными специалистам в данной отрасли в процессе изучения следующего описания изобретения с не ограничивающими его примерами.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Поданные ниже рисунки являются частью настоящего описания и включены с целью продемонстрировать некоторые аспекты настоящего изобретения. Понимание изобретения может быть облегчено путем обращения к одному или нескольким из этих фигур в комбинации с подробным описанием конкретных исполнений изобретения, представленным здесь.

Фиг.1А-1Е показывает сопоставление последовательности в некоторых исполнениях сГИБ с родительским Cry-белками или модифицированными белками Cry3А, применявшимися для конструирования этих сГИБов, включая Сry3А, Cry1Ab и Сry3А055, а также указывает процент идентичности. Подчеркнуты N-концевые пептидильные фрагменты. Пять консервативных блоков обозначены ярлычками СВ1-СВ5. Местоположения соединений между доменами I, II и III обозначены вертикальной пунктирной линией. Последовательность AAPF узнавания протеазы катепсин G показана жирным.

На Фиг.2А-2Е показан набор выполнений сГИБ, активных, по меньшей мере, против западного кукурузного корневого жука, и указан процент идентичности по сравнению со сГИБ 8AF. N-концевые пептидильные фрагменты подчеркнуты одной линией. С-концевые протоксинные хвостовые участки подчеркнуты двойной линией. Пять консервативных блоков обозначены ярлычками СВ1-СВ5. Местоположения соединений между доменами I, II и III показаны значком "↓" и имеют соответствующие ярлычки. Местоположения позиций кроссинговера обозначены значком "♦" Последовательность AAPF узнавания протеазы катепсин G показана жирным.

На Фиг.3 показана карта рекомбинантного вектора 12207, используемого для трансформации кукурузы и включающего экспрессионную кассету с промотором убиквитина кукурузы, операбельно связанным с кодирующей последовательностью FRCG, операбельно связанной с NOS-терминатором.

На Фиг.4 показана карта рекомбинантного вектора 12161, используемого для трансформации кукурузы и включающего в себя экспрессионную кассету с промотором убиквитина кукурузы, операбельно связанным с кодирующей последовательностью FR8a, операбельно связанной с NOS-терминатором.

На Фиг.5 показана карта рекомбинантного вектора 12208, используемого для трансформации кукурузы и включающего в себя экспрессионную кассету с промотором, которым является вирус скручивания желтых листьев цеструма (сmр), операбельно связанный с кодирующей последовательностью FRCG, операбельно связанной с NOS-терминатором.

На Фиг.6 показана карта рекомбинантного вектора 12274, используемого для трансформации кукурузы и включающего в себя экспрессионную кассету с промотором, которым является вирус скручивания желтых листьев цеструма (сmp), операбельно связанный с кодирующей последовательностью FR8a, операбельно связанной с NOS-терминатором.

На Фиг.7 показана карта рекомбинантного вектора 12473, используемого для трансформации кукурузы и включающего в себя экспрессионную кассету с промотором убиквитин кукурузы (ubi), операбельно связанный с кодирующей последовательностью FRD3, операбельно связанной с NOS-терминатором.

На Фиг.8 показана карта рекомбинантного вектора 12474, используемого для трансформации кукурузы и включающего в себя экспрессионную кассету с промотором, которым является вирус скручивания желтых листьев цеструма (сmр), операбельно связанный с кодирующей последовательностью FRD3, операбельно связанной с NOS-терминатором.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, СОДЕРЖАЩИХСЯ В ПЕРЕЧНЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: 1 - нуклеотидная последовательность 2OL-8a.

SEQ ID NO: 2 - последовательность 2OL-8a, кодированная SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 - нуклеотидная последовательность FR8a.

SEQ ID NO: 4 - последовательность FR8a, кодированная SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 5 - нуклеотидная последовательность FRCG.

SEQ ID NO: 6 - последовательность FRCG, кодированная SEQ ID NO: 5.

SEQ ID NO: 7 - нуклеотидная последовательность FR8a-9F.

SEQ ID NO: 8 - последовательность FR8a-9F, кодированная SEQ ID NO: 7.

SEQ ID NO: 9 - нуклеотидная последовательность FR-9F-catg.

SEQ ID NO: 10 - последовательность FR-9F-catg, кодированная SEQ ID NO: 9.

SEQ ID NO: 11 - нуклеотидная последовательность FR8a-12AA.

SEQ ID NO: 12 - последовательность FR8a-12AA, кодированная SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 13 - нуклеотидная последовательность WR-9mut.

SEQ ID NO: 14 - последовательность WR-9mut, кодированная SEQ ID NO: 13.

SEQ ID NO: 15 - нуклеотидная последовательность FRD3.

SEQ ID NO: 16 - последовательность FRD3 кодированная SEQ ID NO: 15.

SEQ ID NO: 17 - нуклеотидная последовательность FR-12-cg-dmS.

SEQ ID NO: 18 - последовательность FR-12-cg-dm3, кодированная SEQ ID NO: 17.

SEQ ID NO: 19 - нуклеотидная последовательность 9F-cg-del6.

SEQ ID NO: 20 - последовательность 9F-cg-del6, кодированная SEQ ID NO: 19.

SEQ ID NO: 21 - нуклеотидная последовательность FR-cg-dmS.

SEQ ID NO: 22 - последовательность FR-cg-dm3, кодированная SEQ ID NO: 21.

SEQ ID NO: 23 - нуклеотидная последовательность 9F-cg-dm3.

SEQ ID NO: 24 - последовательность 9F-cg-dm3, кодированная SEQ ID NO:23.

SEQ ID NO: 25 - нуклеотидная последовательность B8a.

SEQ ID NO: 26 - последовательность B8a, кодированная SEQ ID NO: 25.

SEQ ID NO: 27 - нуклеотидная последовательность 5*B8a.

SEQ ID NO: 28 - последовательность 5*B8a, кодированная SEQ ID NO: 27.

SEQ ID NO: 29- нуклеотидная последовательность V3A.

SEQ ID NO: 30 - последовательность V3A, кодированная SEQ ID NO: 29.

SEQ ID NO: 31 - нуклеотидная последовательность V4F.

SEQ ID NO: 32 - последовательность V4F кодированная SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO: 33 - нуклеотидная последовательность 5*V4F.

SEQ ID NO: 34 - последовательность 5*V4F, кодированная SEQ ID NO: 33.

SEQ ID NO: 35 - нуклеотидная последовательность 2OL-7.

SEQ ID NO: 36 - последовательность 2OL-7, кодированная SEQ ID NO: 35.

SEQ ID NO: 37 - нуклеотидная последовательность T7-2OL-7.

SEQ ID NO: 38 - последовательность T7-2OL-7, кодированная SEQ ID NO:37.

SEQ ID NO: 39 - нуклеотидная последовательность 5*2OL-7.

SEQ ID NO: 40 - последовательность 5*2OL-7, кодированная SEQ ID NO: 39.

SEQ ID NO: 41 - нуклеотидная последовательность 2OL-10.

SEQ ID NO: 42 - последовательность 2OL-10, кодированная SEQ ID NO: 41.

SEQ ID NO: 43 - нуклеотидная последовательность 5*2OL-10.

SEQ ID NO: 44 - последовательность 5*2OL-10 кодированная SEQ ID NO: 43.

SEQ ID NO: 45 - нуклеотидная последовательность 2OL-12A.

SEQ ID NO: 46 - последовательность 2OL-12A, кодированная SEQ ID NO: 45.

SEQ ID NO: 47 - нуклеотидная последовательность 2OL-13.

SEQ ID NO: 48 - последовательность 201-13, кодированная SEQ ID NO: 47.

SEQ ID NO: 49 - нуклеотидная последовательность V5u6.

SEQ ID NO: 50 - последовательность V5и6, кодированная SEQ ID NO: 49.

SEQ ID NO: 51 - нуклеотидная последовательность 5*V5u6.

SEQ ID NO: 52 - последовательность 5*V5и6, кодированная SEQ ID NO: 51.

SEQ ID NO: 53 - нуклеотидная последовательность 88A-dm3.

SEQ ID NO: 54 - последовательность 88A-dm3, кодированная SEQ ID NO: 53.

SEQ ID NO: 55 - нуклеотидная последовательность FR(1Fa).

SEQ ID NO: 56 - последовательность FR(1Fa), кодированная SEQ ID NO: 55.

SEQ ID NO: 57 - нуклеотидная последовательность FR(1Ac).

SEQ ID NO: 58 - последовательность FR(1Ac), кодированная SEQ ID NO: 57.

SEQ ID NO: 59 - нуклеотидная последовательность FR(1Ia).

SEQ ID NO: 60 - последовательность FR(1Ia), кодированная SEQ ID NO: 59.

SEQ ID NO: 61 - нуклеотидная последовательность DM23A.

SEQ ID NO: 62 - последовательность DM23A, кодированная SEQ ID NO: 61.

SEQ ID NO: 63 - нуклеотидная последовательность 8AF.

SEQ ID NO: 64 - последовательность 8AF, кодированная SEQ ID NO: 63.

SEQ ID NO: 65 - нуклеотидная последовательность 5*cry3A055.

SEQ ID NO: 66 - последовательность 5*Cry3 A055, кодированная SEQ ID NO: 65.

SEQ ID NO: 67 - оптимизированная для кукурузы нуклеотидная последовательность

сry3А.

SEQ ID NO: 68 - последовательность Сry3А, кодированная SEQ ID NO: 67.

SEQ ID NO: 69 - нуклеотидная последовательность cry3A055.

SEQ ID NO: 70 - последовательность Cry3A055, кодированная SEQ ID NO: 69.

SEQ ID NO: 71 - оптимизированная для кукурузы нуклеотидная последовательность

cry1Ab.

SEQ ID NO: 72 - последовательность Cry1Ab, кодированная SEQ ID NO: 71.

SEQ ID NO: 73 - оптимизированная для кукурузы нуклеотидная последовательность

cry1Ba.

SEQ ID NO: 74 - последовательность Cry1Ba, кодированная SEQ ID NO: 73.

SEQ ID NO: 75 - оптимизированная для кукурузы нуклеотидная последовательность

cry1Fa.

SEQ ID NO: 76 - последовательность Cry1Fa, кодированная SEQ ID NO: 75.

SEQ ID NO: 77 - нуклеотидная последовательность cry8Aa.

SEQ ID NO: 78 - последовательность Cry8Aa, кодированная SEQ ID NO: 77.

SEQ ID NO: 79 - нуклеотидная последовательность cry1Ac.

SEQ ID NO: 80 - последовательность Cry1 Ac кодированная SEQ ID NO: 79.

SEQ ID NO: 81 - нуклеотидная последовательность cry1Iа.

SEQ ID NO: 82 - последовательность Cry1Ia, кодированная SEQ ID NO: 81.

SEQ ID NO: 83 - 125-праймерные последовательности, применяемые в изобретении.

SEQ ID NO: 126-134 - N-концевые пептидильные фрагменты.

SEQ ID NO: 135 - полноразмерный белок Сry3А.

SEQ ID NO: 136-143 - праймерные последовательности, применяемые в изобретении.

SEQ ID NO: 144 - кодирующая последовательность T7-8AF.

SEQ ID NO: 145 - последовательность T7-8AF, кодированная ASEQ ID NO: 144.

SEQ ID NO: 146 - кодирующая последовательность -catG8AF.

SEQ ID NO: 147 - последовательность -CatG8AF, кодированная SEQ ID NO: 146.

SEQ ID NO: 148 - кодирующая последовательность 8AFdm3.

SEQ ID NO: 149 - последовательность 8AFdm3, кодированная SEQ ID NO: 148.

SEQ ID NO: 150 - кодирующая последовательность 8AFlongdm3.

SEQ ID NO: 151 - последовательность 8AFlongdm3, кодированная SEQ ID NO: 150.

SEQ ID NO: 152 - кодирующая последовательность cap8AFdm3.

SEQ ID NO: 153 - последовательность cap8AFdm3, кодированная SEQ ID NO: 152.

SEQ ID NO: 154 - кодирующая последовательность; 8AFdm3Т.

SEQ ID NO: 155 - последовательность 8AFdm3T, кодированная SEQ ID NO: 154.

SEQ ID NO: 156 - кодирующая последовательность 8AFlongdm3T.

SEQ ID NO: 157 - последовательность 8AFlongdm3T, кодированная SEQ ID NO: 156.

SEQ ID NO: 158 - кодирующая последовательность cap8AFdm3T.

SEQ ID NO: 159 - последовательность cap8AFdm3T, кодированная SEQ ID NO: 158.

SEQ ID NO: 160 - FR8a+34 сГИБ.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Для внесения ясности ниже поданы определения некоторых терминов, используемых в настоящем описании:

«Активность» сГИБов по настоящему изобретению означает, что данные сГИБы функционируют как орально активные средства борьбы с насекомыми, обладают токсическим эффектом и способны нарушить или затруднить питание насекомого, что может приводить или не приводить к гибели насекомого. Если сГИБ по настоящему изобретению доставлен в организм насекомого, то результатом в типичном случае является гибель насекомого или невозможность насекомого питаться источником, из которого сГИБ попадает в его организм.

Термин «ассоциированные с / операбельно связанные» относится к двум нуклеиновым кислотам, связанным друг с другом физически или функционально. Например, говорят, что промотор или регуляторная последовательность ДНК «ассоциированы с» последовательностью ДНК, кодирующей РНК, или белком, в том случае, если эти две последовательности связаны оперативно или расположены так, что регуляторная последовательность ДНК будет воздействовать на уровень экспрессии кодирующей или структурной последовательности ДНК.

В контексте настоящего изобретения «химерный инсектицидный белок» (ХИБ) представляет собой инсектицидный белок, содержащий пептидильный фрагмент, который ввели путем слияния в N-концевую часть сГИБа. Этот пептидильный фрагмент может наделять данный сГИБ инсектицидной активностью, может делать активность сГИБа выше, чем у сГИБа, не имеющего такого пептидильного фрагмента, или же может сделать сГИБ более стабильным, чем сГИБ без пептидильного фрагмента, в частности против, по меньшей мере, западного кукурузного корневого жука. Пептидильный фрагмент представляет собой последовательность аминокислот, которая в типичном случае гетерологична Bt Сr-белку (не получена из него), но может быть и полученной из Bt Cry-белка. Такие пептидильные фрагменты вытянуты за N-концевую часть инсектицидного белка и в природе не встречаются в N-концевой части Bt Cry-белков. Одним из примеров N-концевого пептидильного фрагмента является последовательность аминокислот MTSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 129), которая не получена из Bt Cry-белка.

«Кодирующая последовательность» - это нуклеиново-кислотная последовательность, транскрибированная в РНК, такую как мРНК, рРНК, тРНК, мяРНК, смысловая РНК или антисмысловая РНК. Желательно, чтобы затем эта РНК транслировалась в организме для производства белка.

В контексте настоящего изобретения «связывание» нуклеиновых кислот означает, что две или несколько нуклеиновых кислот соединяют вместе при помощи любых способов, известных в данной отрасли. Для примера, не являющегося ограничивающим, скажем, что нуклеиновые кислоты можно лигировать вместе при помощи, например, ДНК-лигазы или соединять отжигом при помощи ПЦР. Нуклеиновые кислоты также можно соединять путем химического синтеза нуклеиновой кислоты, используя последовательность из двух или нескольких отдельных нуклеиновых кислот.

«Борьба» с насекомыми означает препятствование посредством токсического воздействия способности насекомых-вредителей выживать, расти, питаться и/или размножаться или ограничение ущерба или потери урожая злаков, вызываемых насекомыми. «Борьба» с насекомыми может означать или не означать уничтожение их, хотя в предпочтительном варианте она означает уничтожение насекомых.

В контексте настоящего изобретения термин «соответствует» означает, что когда последовательность аминокислот определенных белков (например, Bt Cry-белков или модифицированных Сry3А-белков) совместить друг с другом, то аминокислоты, которые совпадают с определенными пронумерованными позициями, например, в токсине Сry3А (либо SEQ ID NO: 68, либо SEQ ID NO: 134); в токсине Cry3A055 (SEQ ID NO: 70) или в токсине Cry1Ab (SEQ ID NO: 72), хотя не обязательно они должны находиться точно в этих пронумерованных позициях относительно ссылочной последовательности аминокислот, особенно по отношению к идентификации доменов I, II и III, а также/или консервативных блоков и вариабельных участков, то позиции этих аминокислот «соответствуют» друг другу. Например, в схеме домена I гибридного белка аминокислоты 11-244 белка Cry3A055 (SEQ ID NO: 70) соответствуют аминокислотам 58-290 нативного белка Сry3А (SEQ ID NO: 135), или аминокислотам 11-243 нативного белка Сry3А (SEQ ID NO: 68), или аминокислотам 33-254 нативного белка Cry1Ab.

В контексте настоящего изобретения слова «Cry-белок» могут использоваться как взаимозаменяющие со словами «дельта-эндотоксин» или «δ-эндотоксин».

В контексте настоящего изобретения «сконструированный гибридный инсектицидный белок» (сГИБ) предста