Способ лечения состояния ротовой полости больного (варианты)

Способ лечения состояния ротовой полости больного (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области тканевой инженерии, в частности к использованию культивированного тканевого конструкта для регенерации и восстановления ткани ротовой полости.

Уровень техники

Область тканевой инженерии сочетает биоинженерные методы с принципами наук о жизни для понимания структурных и функциональных взаимосвязей в нормальных и патологических тканях млекопитающих. Целью тканевой инженерии является разработка и конечное применение биологических заместителей для восстановления, поддержания или улучшения функций ткани. Таким образом, посредством тканевой инженерии можно конструировать и изготовлять биоинженерную ткань в лаборатории. Биоинженерные ткани могут включать клетки, которые обычно связаны с нативными тканями млекопитающих или человека и со скаффолдами синтетического или экзогенного матрикса.

Новая биоинженерная ткань должна быть функциональной при пересадке в тело хозяина и должна непрерывно включаться в тело организма-хозяина или постепенно биореконструироваться клетками из организма пациента-реципиента. Изготовление эквивалента ткани без поддерживающего звена или без скаффолда бросает научные вызовы в области создания новой биоинженерной ткани.

Большую часть операций по пересадке мягкой ткани ротовой полости проводят с использованием аутологической ткани неба. Хотя такая процедура может работать очень хорошо при проведении некоторых операций, у нее есть недостаток, заключающийся в необходимости создания "донорного участка", который может быть весьма болезненным у пациентов. Этот дополнительный донорный участок представляет собой весьма скудный источник ткани, поэтому лишь небольшое количество зубов можно обрабатывать за один раз. В результате может возникнуть необходимость в проведении многократных операций, либо у дантиста имеется возможность для лечения только "наихудших зубов", даже притом, что несколько зубов могут остаться неизлеченными, хотя процедура трансплантации также может быть полезной для них.

Раскрытие изобретения

Изобретение относится к способам лечения состояний ротовой полости больного посредством имплантации культивированного тканевого конструкта в ткань ротовой полости больного.

Культивированные тканевые конструкты изобретения содержат культивированные клетки и компоненты эндогенно-вырабатываемого внеклеточного матрикса, не требуя компоненты экзогенного матрикса или сетевые опорные или скаффолд элементы. Таким образом, изобретение преимущественно можно целиком изготовить из человеческих клеток и компонентов человеческого матрикса, вырабатываемого этими клетками, для использования в организме человека.

Имплантат культивированных тканевых конструктов содержит фибробласты, вырабатывающие компоненты внеклеточного матрикса либо без добавления компонентов внеклеточного матрикса, сетевой опоры либо без добавления скаффолд элементов.

Культивированные тканевые конструкты содержат фибробласты, вырабатывающие компоненты внеклеточного матрикса в системе с детерминированным составом и/или без использования неопределенных биологических компонентов или компонентов нечеловеческого происхождения, таких как бычья сыворотка или экстракты органов.

Кроме этого, культивированные тканевые конструкты можно изготовить путем последовательного засевания клеток различных типов, которые вырабатывают культивированный тканевый конструкт, имитирующий клеточную композицию и тканевые структуры нативных тканей. В частности, этот культивированный тканевый конструкт содержит, по меньшей мере, слой эпителиальных клеток, нанесенных на слой культивированных клеток фибробластов. Кроме этого, тканевый конструкт вырабатывается или самособирается культивированными клетками без необходимости в скаффолд элементе или в добавлении компонентов экзогенного внеклеточного матрикса.

Имплантат культивированного тканевого конструкта данного изобретения также содержит гелевую смесь коллагенового раствора и агента, вызывающий контракцию.

Кроме этого, имплантаты культивированного тканевого конструкта данного изобретения содержат слой коллагенового геля, который содержит коллаген вместе с агентом, вызывающим контракцию, расположенным на гелевом слое бесклеточного коллагена.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения эпителиальные клетки добавляют к слою, содержащему коллагеновый гель и агент, вызывающий контракцию.

Прочностные характеристики тканевых конструктов делают ихудобными в обращении, они легко отслаиваются от аппарата для культивирования, в котором они образуются и их непосредственно имплантируют без необходимости в какой-либо опоре или носителе в клинических или испытательных приложениях. Тканевые конструкты изобретения показаны для лечения пациентов с поражениями ткани ротовой полости, такими как выемка в десне, потеря межзубного сосочка, альвеолярная недостаточность, поврежденный имплантат ротовой полости, дефекты зоны разделения корней зубов, и для пациентов, нуждающихся в реконструкции ткани после резекций опухоли челюстно-лицевой области.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 представляет собой график, показывающий увеличение концентрации коллагена, определяемой по анализу гидроксипролина, по сравнению с количеством клеток в дермальном конструкте, полученном из клеток крайней плоти новорожденного человека и описываемом в Примере 1.

Фиг.2 представляет собой график данных, иллюстрирующий контракцию гидратированной коллагеновой сетки клетками фибробластов.

Фиг.3 представляет собой график данных, иллюстрирующий контракцию клетками фибробластов гидратированных коллагеновых сеток с различным содержанием коллагена.

Фиг.4 представляет собой график данных, иллюстрирующий контракцию клетками фибробластов гидратированных коллагеновых сеток, содержащих различные количества клеток фибробластов.

Фиг.5 представляет собой график данных, показывающий способность клеток фибробластов вызывать контракцию гидратированной коллагеновой сетки при использовании клеток различных уровней удвоения популяции.

Фиг.6 представляет собой график данных, иллюстрирующий влияние 10,0 мкг/мл ингибитора цитохалазина В на способность клеток фибробластов вызывать контракцию гидратированной коллагеновой сетки.

Фиг.7 представляет собой график данных, иллюстрирующий эффект 0,36 мкг/мл ингибитора колцемида на способность клеток фибробластов вызывать контракцию гидратированной коллагеновой сетки.

Фиг.8 представляет собой график данных, иллюстрирующий эффект цитозин арабинозида на способность клеток фибробластов вызывать контракцию гидратированной коллагеновой сетки.

Фиг.9 представляет собой график, иллюстрирующий влияние тромбина на контракцию коллагеновыхсетоктромбоцитами при концентрации тромбина 4,0 единиц/мл.

Фиг.10 представляет собой график, иллюстрирующий контракцию коллагеновой сетки в зависимости от концентрации тромбоцитов и наличия тромбина при концентрации 4,0 единиц/мл.

Фигуры 11-14 представляет собой графики, иллюстрирующие контракцию коллагеновых сеток в зависимости от функции, типа и концентрации используемого коллагена.

Фиг.15 представляет собой график, иллюстрирующий влияния ингибиторов цитохалазина В и колцемида на контракцию гидратированных коллагеновых сеток тромбоцитами.

Фиг.16 представляет собой изображение в изометрии, с частичным разрезом, одного аппарата согласно настоящему изобретению.

Фиг.17 представляет собой развернутое изображение в изометрии аппарата, показанного на Фиг.16.

Фиг.18 представляет собой сечение вдоль линии 3-3 аппарата, показанного на Фиг.16.

Фиг.19 представляет собой трехмерное изображение, частично отклоненное, другого аппарата в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг.20 - развернутое изображение (сверху) аппарата, показанного на Фиг.19.

Фиг.21 представляет собой развернутое сечение вдоль линии 6-6 аппарата, показанного на Фиг.19.

Осуществление изобретения

Изобретение относится к способам лечения расстройства ротовой полости больного посредством имплантации культивированного тканевого конструкта.

Следует отметить, что термины "культивированный тканевый конструкт", "генно-инженерная живая ткань", "конструкт клеточного матрикса", "слой клеточного матрикса", "эквивалент кожи", "живая ткань" и "живая соединительная ткань" могут использоваться взаимозаменяемо, как варианты осуществления культивированных тканевых конструктов настоящего изобретения.

До сих пор конструируемые в настоящее время живые тканевые конструкты собираются клетками не полностью и должны основываться либо на добавлении или внедрении компонентов экзогенного матрикса, либо включении синтетических звеньев для структуры или опоры, либо использовании обоих указанных частей.

Биоинженерные тканевые конструкты, описываемые в этом документе, проявляют многие природные свойства ткани, из которой происходят ее клетки. Вырабатываемые таким образом тканевые конструкты могут использоваться для лечения состояния ротовой полости пациента.

Один предпочтительный вариант осуществления представляет собой конструкт клеточного матрикса, содержащий первый тип клеток и эндогенно-вырабатываемый внеклеточный матрикс, в котором первый тип клеток способен синтезировать и выделять внеклеточный матрикс для вырабатывания конструкта клеточного матрикса.

Другой предпочтительный вариант осуществления представляет собой двухслойный конструкт, содержащий первый тип клеток и эндогенно-вырабатываемый внеклеточный матрикс и слой клеток второго типа, располагаемых на нем или внутри конструкта клеточного матрикса, образованного первым типом клеток.

Более предпочтительный вариант осуществления представляет собой конструкт клеточного матрикса, содержащий фибробласты, например, те, что происходят из дермы, для образования культивированного дермального конструкта.

Другой более предпочтительный вариант осуществления представляет собой конструкт клеточного матрикса, содержащий фибробласты, например, те, что происходят из дермы, для образования культивированного дермального конструкта со слоем кератиноцитов, культивированных на нем для образования эпидермального слоя, чтобы получить в результате культивированный двухслойный кожный конструкт. Культивированные кожные конструкты изобретения проявляют многие физические, морфологические и биохимические особенности естественной кожи.

В еще более предпочтительном варианте осуществления конструкт клеточного матрикса представляет собой тканевый конструкт, который схож с дермальным слоем кожи - человеческий дермальный конструкт, который образуется в системе детерминированного (определенного) состава, содержащей клетки человеческого происхождения и не использующей химически неопределенные компоненты во время их культивирования.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления тканевые конструкты изобретения изготавливают в системе определенного химического состава, содержащей клетки человеческого происхождения, но не содержащей химически неопределенные компоненты или биологические компоненты или клетки нечеловеческого происхождения.

В другом варианте осуществления данного изобретения культивированные тканевые конструкты содержат гелевую смесь, содержащую раствор коллагена и агент, вызывающий контракцию.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения культивированные тканевые конструкты содержат первый слой, содержащий бесклеточный коллагеновый гель и второй слой, располагаемый на первом слое, при этом второй слой содержит второй коллагеновый гель, содержащий коллаген и агент, вызывающий контракцию. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения второй слой коллагена с агентом, вызывающим контракцию, засевают клетками кератиноцитов.

А: Применения культивированных тканевых конструктов:

Культивированный тканевый конструкт изобретения можно применять для лечения расстройств ротовой полости, таких как выемка в десне, потеря межзубного сосочка, недостаточность альвеолярного отростка, последствия от поврежденного имплантата ротовой полости или после резекций челюстно-лицевой опухоли.

Общепризнано, что для здоровья требуется, чтобы вокруг каждого зуба была функциональная зона неподвижной части десны. В отсутствии этой ткани часто возникает атрофия края десны, приводящая к потере части кортикальной пластинки, создавая худший прогноз для зубов. Кроме того, часто обнаруживают воспаление слизистой оболочки спереди от зубов при отсутствии функциональной зоны неподвижной части десны, несмотря на хороший домашний уход за ротовой полостью. Это воспаление может вызывать остеопороз вокруг зубов.

С конца 1960-х годов этот тип проблемы регулярно исправляют посредством свободного аутогенного трансплантата. Слизистую оболочку удаляют с лицевой стороны от рассматриваемых зубов, и ороговевшую ткань собирают из неба и накладывают в виде шва на слой трансплантата. Вначале трансплантат поддерживается плазматической циркуляцией, а затем подвергается реваскуляризации из окружающего слоя. Успех данного типа трансплантата достигает 100%. Однако у многих больных имеется сильное желание идентифицировать донорный материал, использующийся вместо небной ткани. В результате этого количество хирургических участков, необходимых для этой процедуры, конечно, может сократиться наполовину. Через несколько лет стали использовать заменяющие донорные материалы.

В последние годы стали использовать лиофилизированную кожу трупа, а совсем недавно в качестве донорного материала стали использовать бесклеточный дермальный имплантат. Хотя и очень отдаленный, но возможный, риск заражения, связанный с этими типами дермальных материалов (главным образом риск заражения СПИДом и гепатитом) сравнительно препятствует их использованию. В дополнение к этому, получающийся в результате эстетический облик имплантатов, в которых используется этот донорный материал, обычно не совсем идеален.

В: Культивированные тканевые конструкты, содержащие структурный слой, по меньшей мере, одного типа клеток, вырабатывающих внеклеточный слой, с эндогенно-вырабатываемым внеклеточным матриксом

Один предпочтительный вариант осуществления изобретения содержит структурный слой, по меньшей мере, одного типа клеток, вырабатывающих внеклеточный матрикс, и компоненты эндогенно-вырабатываемого внеклеточного матрикса, для краткости обозначаемый термином "матрикс", при этом матрикс полностью синтезируется и собирается посредством культивирования клеток. Этот слой в этом документе называется "конструктом клеточного матрикса" или "слоем клеточного матрикса", поскольку клетки секретируют и содержатся сами по себе внутри и вдоль их матрикса. Как раскрывается в совместно рассматриваемой заявке на патент США под серийным №09/523809, зарегистрированной 03/03/2000, и включенной в этот документе по ссылке в ее общем виде, культивированные тканевые конструкты не требуют, и таким образом не включают, компоненты экзогенного матрикса, а именно, компоненты матрикса, которые не вырабатываются культивированными клетками, но вводятся с помощью других средств. В более предпочтительном варианте осуществления показано, что конструкт клеточного матрикса, вырабатываемый дермальными фибробластами человека имеет преобладающую концентрацию коллагена, схожую с его концентрацией в естественной коже. Методом электронной микроскопии показано, что матрикс по природе является волокнистым, включая в себя коллаген, который проявляет четырехступенчатую структуру полос длиной 67 нм, а также организацию упаковки фибрилл и фибрилльных связок, схожую с природным коллагеном.

Методом электрофореза ПААГ-ДСН с задержанным снижением обнаружено присутствие в данных конструктах коллагена как типа I, так и типа III, - преобладающих типов коллагена, найденных в естественной коже человека. С использованием стандартных методик иммунногистохимии (ИГХ) дермальный конструкт клеточного матрикса окрашивается положительно по отношению к декорину, дерматансульфат протеогликану, который, как известно, связан с фибриллами коллагена и, как предполагается, регулирует диаметр фибрилл in vivo. Декорин можно также визуализировать в конструкте посредством ПЭМ. Вырабатываемая ткань также окрашивается положительно по отношению к тенасцину - гликопротеину внеклеточного матрикса, обнаруживаемому, например, в мезенхиме или тканях при восстановлении. Было показано, что подобно ткани при восстановлении in vivo, в ткани, вырабатываемой в культуре, увеличивается соотношение коллагена типа I к коллагену типа III по мере образования матрикса.

Не стремясь связать с теорией, предполагают, что клетки быстро заполняются в открытом пространстве между ними вместе с рыхлым матриксом, аналогично грануляционной ткани, состоящей главным образом из коллагена типа III и фибронектина, а затем реконструируют этот рыхлый матрикс плотным матриксом, состоящим главным образом из коллагена типа I. Было показано, что вырабатываемый клеточный матрикс содержит гликозаминогликаны (ГАГ), например, гиалуроновую кислоту (ГК), фибронектин; протеогликаны, помимо декорина, например, бигликан и версикан и, профиль сульфированных гликозаминогликанов, таких как дигиалуроновая кислота, ди-хондроитин-0-сульфат, ди-хондроитин-4-сульфат, ди-хондроитин-6-сульфат, ди-хондроитин-4,6-сульфат, ди-хондроитин-4-сульфат-UA-2S и ди-хондроитин-6-сульфат-UA-2S. Эти структурные и биохимические особенности проявляются сами по себе во время развития конструкта в культуре и становятся отчетливо очевидными, когда конструкт приближается к своей конечной форме. Присутствие этих компонентов в полностью сформированном культивированном дермальном конструкте клеточного матрикса указывает на то, что конструкт имеет структурные и биохимические характеристики, приближающиеся к нормальной дерме.

Тогда как вышеупомянутый перечень является перечнем биохимических и структурных особенностей культивированного конструкта клеточного матрикса, образованного из дермальных фибробластов, следует понимать, что культивированные конструкты клеточного матрикса, образованные из других типов фибробластов будут вырабатывать многие из этих и других особенностей, фенотипических для ткани, из которой они происходят. В некоторых случаях фибробласты могут быть индуцированы для экспрессии нефенотипических компонентов либо посредством химического воздействия или контакта, физических нагрузок либо посредством трансгенных способов.

Другим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является слой клеточного матрикса, в котором есть второй слой клеток, располагаемых на нем. Второй слой клеток культивируется на слое клеточного матрикса для образования биоинженерного двухслойного тканевого конструкта. В более предпочтительном варианте осуществления клетки второго слоя по происхождению являются эпителиальными. В наиболее предпочтительном варианте осуществления второй слой содержит культивированные кератиноциты человека, которые вместе с первым слоем клеточного матрикса, конструктом клеточного матрикса, образованным из дермальных фибробластов и эндогенного матрикса для образования дермального слоя, составляют живой конструкт кожи. Когда эпидермальный слой полностью сформирован, он представляет собой многослойный, стратифицированный и хорошо дифференцированный слой кератиноцитов, которые проявляются в виде базального слоя, надбазального слоя, зернистого слоя и рогового слоя. Кожный конструкт имеет хорошо развитую базальную мембрану, находящуюся при дермально-эпидермальном соединении, что показано методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Базальная мембрана выглядит самой толстой вокруг полудесмосом, маркированныхфиксирующими фибриллами, которые состоят из коллагена типа VII, что видно методом ПЭМ. Фиксирующие фибриллы могут выглядеть выходящими из базальной мембраны, захватывая фибриллы коллагена в дермальном слое. Эти фиксирующие фибриллы, а также другие компоненты базальной мембраны, выделяются кератиноцитами. Также известно, что пока кератиноциты способны выделять на себе компоненты базальной мембраны, распознаваемая базальная мембрана не будет образовываться в отсутствии фибробластов. Иммунногистохимическое окрашивание кожного конструкта настоящего изобретения также показало присутствие ламинина - белка базальной мембраны.

В предпочтительном способе изобретения для образования конструкта клеточного матрикса, первый тип клеток, тип клеток, вырабатывающий внеклеточный матрикс, высевают на субстрат, культивируют и побуждают синтезировать и выделять упорядоченный внеклеточный матрикс вокруг них для образования конструкта клеточного матрикса. Вдругом предпочтительном способе изобретения поверхность конструкта клеточного матрикса засевают клетками второго типа клеток, которые культивируют для образования двухслойного тканевого конструкта. В более предпочтительном способе полнослойный кожный конструкт, имеющий особенности, схожие с естественной кожей человека, образуется посредством культивирования фибробластов, таких как дермальные фибробласты человека, в условиях, достаточных для индуцирования синтеза матрикса с целью образования клеточного матрикса дермальных клеток и матрикса дермального слоя, на котором засевают эпителиальные клетки человека, такие как кератиноциты, и их культивируют в условиях, достаточных для образования полностью дифференцированного, стратифицированного эпидермального слоя.

Таким образом, один способ получения тканевых конструктов настоящего изобретения включает в себя:

(a) культивирование, по меньшей мере, одного типа клеток, вырабатывающих внеклеточный матрикс, в отсутствии компонентов экзогенного внеклеточного матрикса или структурного поддерживающего звена; и,

(b) стимулирование клеток, полученных на стадии (а) к синтезу, выделению и упорядочиванию компонентов внеклеточного матрикса для образования тканевого конструкта, состоящего из клеток и матрикса, синтезированного теми клетками; при этом стадии (а) и (b) можно проводить одновременно или последовательно.

Для образования двухслойного тканевого конструкта, содержащего конструкт клеточного матрикса и второй клеточный слой на нем, способ дополнительно включает стадию: (с) культивирования клеток второго типа на поверхности образованного тканевого конструкта для вырабатывания двухслойного тканевого конструкта.

Типом клеток, вырабатывающих внеклеточный матрикс, для использования в изобретении может являться любой тип клеток, способных вырабатывать и выделять компоненты внеклеточного матрикса, а также упорядочивать компоненты клеточного матрикса для образования конструкта клеточного матрикса. Можно культивировать несколько типов клеток, вырабатывающих внеклеточный матрикс, для образования конструкта клеточного матрикса. Клетки различных типов или источники тканей можно культивировать вместе в виде смеси для вырабатывания комплементарных компонентов и структур, схожих с теми, что обнаружены в нативных тканях. Например, тип клеток, вырабатывающий внеклеточный матрикс, может иметь другие типы клеток, смешанные с ним, для вырабатывания такого количества внеклеточного матрикса, которое обычно не вырабатывается первым типом клеток. В качестве альтернативы, тип клеток, вырабатывающий внеклеточный матрикс, можно также смешивать с другими типами клеток, которые образуют специализированные тканевые структуры в ткани, но не вносят существенного вклада в суммарное образование матриксного аспекта конструкта клеточного матрикса, например, в определенных кожных конструктах изобретения.

Хотя в соответствии с данным изобретением можно использовать любой тип клеток, вырабатывающих внеклеточный матрикс, предпочтительные типы клеток для использования в данном изобретении происходят из мезенхимы. Более предпочтительными типами клеток являются фибробласты, стромальные клетки и другие клетки поддерживающей соединительной ткани, более предпочтительно дермальные фибробласты человека, находящиеся в человеческой дерме, для получения человеческого дермального конструкта. Клетки фибробластов, как правило, вырабатывают несколько белков внеклеточного матрикса, главным образом коллаген. Существует несколько типов коллагенов, вырабатываемых фибробластами, однако коллаген типа I является наиболее распространенным in vivo. Штаммы клеток фибробластов человека могут происходить из нескольких источников, включая, без ограничений, мужскую крайнюю плоть новорожденного, дерму, сухожилие, легкое, пуповину, хрящ, мочеиспускательный канал, корнеальную строму, слизистую оболочку рта и кишечник. Человеческие клетки не ограничиваются только фибробластами и могут включать клетки гладкой мышцы, хондроциты и другие клетки соединительной ткани мезенхимного происхождения. Предпочитается, но не требуется, чтобы происхождение вырабатывающих матрикс клеток, используемых при получении тканевого конструкта, велось от такого типа ткани, с которой они будут иметь сходство или будут имитировать ее после использования изобретенных способов культивирования. К примеру, в варианте осуществления, в котором вырабатывается кожный конструкт, предпочтительной клеткой, вырабатывающей матрикс, является фибробласт, предпочтительно дермального происхождения.

В другом предпочтительном варианте осуществления фибробласты, отделяемые микропрепарированием от сосочков дермы волосяных фолликул, могут использоваться для получения матрикса в отдельности и в комбинации с другими фибробластами. В варианте осуществления, в котором вырабатывается роговичный конструкт, клетка, вырабатывающая матрикс, происходит из роговичной стромы. Доноры клеток могут варьироваться в зависимости от развития и возраста. Клетки могут происходить из донорных тканей эмбрионов, новорожденных или более старых индивидуумов, включая взрослые особи. Эмбриональные клетки-предшественники, например, стволовые клетки мезенхимы, можно использовать в изобретении и индуцировать для дифференциации и развития в желаемую ткань.

Хотя человеческие клетки предпочтительны для использования в изобретении, клетки, используемые в способе, не ограничиваются клетками из человеческих источников. Можно использовать клетки из других видов млекопитающих, включая следующие, но не ограничиваясь ими: лошадиные, собачьи, свиные, коровьи и овечьи источники или источники из видов грызунов, таких как мышь или крыса. Кроме этого, в изобретении также можно использовать клетки, которые самопроизвольно, химически или вирусно трансфицированы, рекомбинантные клетки или генно-инженерные клетки. В тех вариантах осуществления, которые включают использование нескольких типов клеток, можно использовать гибридные смеси нормальных клеток из двух или более двух источников, смеси нормальных и генетически модифицированных или трансфицированных клеток или смеси клеток из двух или более двух видов или тканевых источников.

Рекомбинантные или генно-инженерные клетки можно использовать для вырабатывания конструкта клеточного матрикса с целью создания тканевого конструкта, который служит в качестве имплантата для доставки лекарства пациенту, нуждающемуся в повышенных количествах природных клеточных продуктов или в терапевтическом лечении. Клетки могут вырабатывать или поставлять пациенту через имплантат продукты рекомбинантных клеток, факторы роста, гормоны, пептиды или белки на протяжении продолжительного периода времени, или, если это необходимо, при биологическом, химическом или термическом сигнале о состоянии пациента. Желательна длительная или краткосрочная экспрессия генного продукта в зависимости от указания по применению культивированного тканевого конструкта. Длительная экспрессия желательна в том случае, когда культивированный тканевый конструкт имплантируют для снабжения пациента терапевтическими продуктами на протяжении длительного периода времени.

Наоборот, краткосрочная экспрессия желательна в тех случаях, когда культивированный тканевый конструкт пересаживают пациенту с раной, в которой клетки культивированного тканевого конструкта активируют нормальное или близкое к нормальному заживление или снижают скарификацию раненного участка. После заживления ткани необходимость в генных продуктах из культивированного тканевого конструкта на данном участке исчезает или может исчезнуть. Клетки можно также обрабатывать методами генной инженерии для экспрессии белков или различных типов компонентов внеклеточного матрикса, которые являются либо "нормальными", но экспрессируются на высоком уровне, либо модифицированными иным образом для создания пересаживаемого устройства, содержащего внеклеточный матрикс и живые клетки, которые терапевтически полезны для лучшего заживления раны, облегченного или направленного образования новых сосудов или минимизированного образования шрама или келоида. Эти процедуры общеизвестны в данной области техники и описываются в Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), включенной в этот документ по ссылке. Все вышеупомянутые типы клеток входят в пределы определения "клетка, вырабатывающая матрикс", используемого в этом изобретении.

Преимущественным главным компонентом внеклеточного матрикса, вырабатываемым фибробластами, является фибриллярный коллаген, в частности коллаген типа I. Фибриллярный коллаген является ключевым компонентом в структуре клеточного матрикса, однако это изобретение не ограничивается матриксами, состоящими только из этого белка и белкового типа. К примеру, другие коллагены - как фибриллярный, так и нефибриллярный коллаген из семейства таких типов коллагенов, как II, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, XIV, XV, XVI, XVII, XVIII, XIX, можно получить путем использования подходящего типа клеток. Подобным же образом, к другим матриксным белкам, которые могут вырабатываться и осаждаться с использованием настоящего способа, относятся, без ограничений: эластин; протеогликаны, такие какдекорин и бигликан; или гликопротеины, например, тенасцин, витронектин, фибронектин, ламинин, тромбоспондин I и гликозаминогликаны (ГАГ), например, гиалуроновая кислота (ГК).

Клетку, вырабатывающую матрикс, культивируют в сосуде, подходящем для клеточной или тканевой культуры животного, например, в чашке для культивирования, колбе или вращающемся флаконе, которые способствуют образованию трехмерной тканеобразной структуры. Подходящей поверхностью для выращивания клеток может являться любой биологически совместимый материал, к которому клетки могут приклеиваться и который можно обеспечить фиксирующими средствами для формируемого конструкта клеточного матрикса. В качестве поверхностей для выращивания клеток, можно использовать такие материалы, как: стекло, нержавеющая сталь, полимеры, включая поликарбонат, полистирол, поливинилхлорид, поливинилиден, полидиметилсилоксан, фторполимеры и фторированный этилен-пропиленовый полимер и силиконовые субстраты, включая кварцевое стекло, поликристаллический кремний или кремниевые кристаллы. Материал поверхности для выращивания клеток можно химически обрабатывать или модифицировать, электростатически заряжать или покрывать биологическими препаратами, такими как поли-L-лизин или пептиды. Примером пептидного покрытия является RGD пептид.

В то время как тканевый конструкт изобретения можно выращивать на твердой поверхности для выращивания клеток, предпочтительна поверхность для выращивания клеток с порами, которые связывают как верхнюю, так и нижнюю поверхности мембраны, давая возможность для двустороннего контакта среды с развивающимся тканевым конструктом или для контакта только снизу от культуры. Двухсторонний контакт позволяет среде контактировать как с верхней, так и с нижней поверхностями развивающегося конструкта, обеспечивая максимальную площадь воздействия питательных веществ, содержащихся в среде. Среда также может контактировать только с нижней поверхностью образующегося тканевого конструкта, так что верхняя поверхность может быть открыта для воздуха, как при развитии культивируемого кожного конструкта.

Предпочтительным сосудом для культивирования является такой сосуд, в котором используется вставка носителя, культурально-обработанный проницаемый элемент, например, пористая мембрана, которую суспендируют в сосуде для суспенидрования, содержащем среду. Обычно мембрану закрепляют за один конец трубчатого элемента или каркаса, который вводят вовнутрь и состыковывают с основанием, таким как чашка Петри или чашка для культивирования, которое можно накрывать крышкой. Сосуды для культивирования, включающие вставку носителя с пористой мембраной, известны в данной области техники и предпочтительны для выполнения изобретения, они описываются в нескольких патентах США, относящихся к данной области, некоторые из которых стали коммерчески доступными, включая, например, патенты №№: 5766937, 5466602, 5366893, 5358871, 5215920, 5026649, 4871674, 4608342, раскрытие этих патентов включено в этот документ по ссылке. При использовании данных типов сосудов для культивирования тканевый конструкт вырабатывается на поверхности мембраны, предпочтительно на верхней лицевой поверхности, а культура контактирует с клеточной средой как на верхней, так и на нижней поверхностях.

Поры в поверхности роста позволяют проходить культуральной среде для обеспечения питательными веществами нижней части культуры через мембрану, тем самым давая возможность клеткам подпитываться с двух сторон или исключительно с нижней стороны. Предпочтительным размером пор является такой размер, который достаточно мал, чтобы не дать возможность клеткам расти через мембрану, но достаточно велик для того, чтобы обеспечить проход питательных веществ, содержащихся в культуральной среде, к нижней стороне конструкта клеточного матрикса, например, посредством капиллярного действия.

Предпочтительные размеры пор составляют менее 3 микронов и варьируются в диапазоне от 0,1 микрона до 3 микронов, более предпочтительно в диапазоне от 0,2 микрона до 1 микрона, и наиболее предпочтительно используют поры с размером от 0,4 микрона до 0,6 микрона.

В случае дермальных фибробластов человека наиболее предпочтительным материалом является поликарбонат с размером пор от 0,4 до 0,6 микронов. Максимальный размер пор зависит не только от размера клетки, но также и от способности клетки изменять свою форму и проходить через мембрану. Важно, чтобы тканеобразный конструкт приклеивался к поверхности, но не прирастал или захватывал субстрат так, чтобы его можно было удалить от него, например, путем отслаивания с приложением минимальной нагрузки.

Размер и форма образующегося тканевого конструкта определяются размером поверхности сосуда или мембраны, на которой он выращивается. Субстраты могут иметь круглую, угловую форму, форму с закругленным углами или неправильную форму. Субстраты могут также быть плоскими или иметь контур в виде литейной формы с целью получения фасонного конструкта для стыковки с раной или имитирования физической структуры естественной ткани. При расчете на большие площади поверхности субстрата для выращивания засевают пропорционально большее количество клеток на поверхности, и требуется больший объем среды для эффективного погружения и питания клеток. Когда тканевый конструкт полностью сформирован, либо в виде однослойного конструкта клеточного матрикса, либо в виде двухслойного конструкта, его удаляют путем отслаивания от мембранного субстрата перед пересадкой пациенту.

Культивированные тканевые конструкты изобретения не опираются на синтетические и саморассасывающиеся элементы, например, на сетчатые элементы для образования тканевых конструктов. Сетчатые элементы устраивают в виде плетенного, вязанного или войлочного материала. В с