Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики злокачественных опухолей

Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики злокачественных опухолей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к новому медицинскому применению антител против CAPRIN-1 или их фрагментов, например, в качестве терапевтических и/или профилактических средств для лечения злокачественных опухолей.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Злокачественные опухоли являются основной причиной смерти. Лечение злокачественных опухолей, проводимое в настоящее время, представляет собой главным образом, хирургическое вмешательство, которое может быть объединено с лучевой терапией или химиотерапией. Несмотря на развитие новых хирургических способов и открытие новых противоопухолевых средств в последнее время, результаты лечения злокачественных опухолей в настоящее время заметно не улучшились, за исключением некоторых типов злокачественных опухолей. В результате новых успехов в молекулярной биологии и иммунологии злокачественных опухолей, были идентифицированы антитела, которые специфически взаимодействуют со злокачественными опухолями, антигены злокачественных опухолей, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками, а также гены, кодирующие антигены злокачественных опухолей, и были получены ожидаемые результаты для специфических иммунотерапевтических средств, направленных на антигены злокачественных опухолей (Tsuyoshi AKIYOSHI, "Gan To Kagaku-Ryoho (Cancer and Chemotherapy)", 1997, vol. 24, pp. 551-519 (Jp) (Cancer and Chemotherapy Publishers, Inc., Japan)).

В способах лечения злокачественных опухолей, для уменьшения побочных эффектов, желательно, чтобы пептиды, полипептиды или белки, распознаваемые в качестве антигенов злокачественных опухолей, отсутствовали почти во всех нормальных клетках, но специфически находились в злокачественных клетках. В 1991, Boon et al в Ludwig Institute в Бельгии выделили антиген меланомы человека MAGE 1, распознаваемый CD8-позитивными Т-клетками способом кДНК-экспресс клонирования, используя линию аутологичных злокачественных клеток и Т-клетки, реакционноспособные в отношении злокачественных опухолей (Bruggen P. et al., Science, 254:1643-1647 (1991)). В дальнейшем, сообщалось о способе SEREX (серологической идентификации антигенов путем рекомбинантного экспресс-клонирования), в котором опухолевые антигены, распознаваемые антителами, продуцированными посредством ответа на аутологичную злокачественную опухоль в организме, могут быть идентифицированы с использованием методики экспресс-клонирования генов (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813 (1995); и патент США No. 5698396). С помощью способа SEREX, были выделены некоторые антигены злокачественных опухолей, которые по существу не экспрессируются в нормальных клетках, но специфически экспрессируются в злокачественных клетках (Int. J. Cancer, 72: 965-971 (1997); Cancer Res., 58: 1034-1041 (1998); Int. J. Cancer, 29: 652-658 (1998); Int. J. Oncol., 14: 703-708 (1999); Cancer Res., 56: 4766-4772 (1996); и Hum. Mol. Genet 6: 33-39, 1997). Далее, были проведены клинические испытания клеточной терапии с использованием иммуноцитов, которые специфически взаимодействуют с антигенами злокачественных опухолей, которые представляют собой некоторые из выделенных антигенов злокачественных опухолей, и иммунотерапии, специфичной в отношении злокачественных опухолей, с использованием вакцин, содержащих антигены злокачественных опухолей или подобное.

При этом, в последние годы, в жизнь вошел целый ряд антительных лекарственных средств для лечения злокачественных опухолей, которые направлены на антигенные белки на злокачественных клетках. Такие лекарственные средства, используемые в качестве специфичных к злокачественным опухолям терапевтических средств, в определенной степени демонстрируют лекарственную эффективность, и, следовательно, они привлекли внимание. Однако, большинство антигенных белков мишеней также экспрессируется на нормальных клетках. В результате введения антитела, не только злокачественные клетки, а также нормальные клетки, на которых экспрессируется антиген-мишень, могут быть повреждены, вызывая тем самым побочный (или неблагоприятный) эффект, который становится проблематичным. Следовательно, ожидается, что если становится возможным идентифицировать антигены злокачественной опухоли, которые специфически экспрессируются на поверхности злокачественной клетки, и использовать антитела, направленные на такие антигены, в качестве лекарственных средств, тогда можно было бы проводить лечение антительными лекарственными средствами, которые вызывают меньше побочных эффектов.

Белок 1, связанный с цитоплазмой и пролиферацией (CAPRIN-1), представляет собой внутриклеточный белок, который экспрессируется, когда нормальные клетки в фазе покоя активируются или подвергаются делению. Также известно, что CAPRIN-1 вовлечен в регуляцию транспорта и трансляции мРНК путем образования цитоплазматических стрессовых зерен с РНК в клетке. CAPRIN-1 имеет различные названия, такие как GPI-заякоренный мембранный белок 1 и белок 1 мембранного компонента поверхностного маркера (M11S1), как если бы было известно, что этот белок является мембранным белком. Эти различные названия происходят из сообщения (J. Biol. Chem., 270: 20717-20723, 1995), что генная последовательность CAPRIN-1 исходно имеет GPI-связывающую область, и CAPRIN-1 является мембранным белком, экспрессируемым в злокачественных клетках толстой кишки. Позже сообщалось о том, что последовательность гена CAPRIN-1, описанная в этом сообщении, является ошибочной; т.е., имеет место сдвиг рамки путем делеции единичного нуклеотида из последовательности гена CAPRIN-1, в настоящее время зарегистрированного GenBank или подобным, так что 80 аминокислот было делетировано с С-конца, и полученный в результате артефакт (74 аминокислоты) в этом сообщении представлял собой GPI связывающую часть; и другая ошибка также присутствует на 5' стороне генной последовательности, тем самым приводя в результате к делеции 53 аминокислот с N-конца (J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004). Далее, сообщалось, что белок, кодируемый последовательностью гена CAPRIN-1 в настоящее время зарегистрированной GenBank или тому подобное, не являлся белком клеточной мембраны (J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004).

Кроме того, на основании сообщения J. Biol. Chem., 270: 20717-20723, 1995, что CAPRIN-1 является белком клеточной мембраны, в US 2008/0075722 и WO 2005/100998 описывается, что CAPRIN-1 под названием M11S1 может быть использован для лечения злокачественных опухолей в качестве мишени антительных лекарственных средств для лечения злокачественных опухолей, и в качестве одного из белков клеточной мембраны; однако, в примерах не содержится описания лечения злокачественных опухолей с использованием антитела против указанного белка. Однако, как сообщалось в J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004, было общепризнанным на дату подачи US 2008/0075722 вплоть до настоящего времени, что CAPRIN-1 не экспрессируется на поверхности клетки, и, следовательно, очевидно, что содержания US 2008/0075722 и WO 2005/100998, основанные только на ошибочной информации, что CAPRIN-1 является белком клеточной мембраны, не следует рассматривать в качестве общепринятого технического уровня знаний специалистов в данной области.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМА, РЕШАЕМАЯ НАСТОЯЩИМ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Задачей настоящего изобретения является идентификация антигенных белков злокачественной опухоли, специфически экспрессирующихся на поверхности злокачественных клеток, и применение антител, направленных на такие белки, в качестве терапевтических и/или превентивных (или профилактических) средств для лечения злокачественных опухолей.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМЫ

В результате тщательных исследований, авторы настоящего изобретения в настоящее время получили кДНК, кодирующую белок, который связывается с антителом, находящимся в сыворотке организма, несущего опухоль, с помощью способа SEREX, используя библиотеки кДНК, полученной из ткани семенников, и сыворотки от собак со злокачественной опухолью молочной железы. Используя полученные гены собаки и гомологичные им гены человека, быка, лошади, мыши и цыпленка, белки CAPRIN-1, имеющие аминокислотные последовательности с четными номерами SEQ ID NO:2-30 (т.е. четные последовательности SEQ ID NO:2-30), и были получены антитела против белков CAPRIN-1. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что CAPRIN-1 специфически экспрессируется в злокачественных клетках молочной железы, клетках опухоли головного мозга, при лейкозе, лимфоме, раке легких, раке пищевода, раке толстой кишки, раке желудка и раке почек, и эти части белков CAPRIN-1 специфически экспрессировались на поверхности таких злокачественных клеток. Далее, авторы настоящего изобретения в настоящее время обнаружили, что антитела против белков CAPRIN-1, экспрессируемых на поверхностях злокачественных клеток, могут повреждать (или поражать) злокачественные клетки, экспрессирующие CAPRIN-1. Эти сведения привели к созданию настоящего изобретения.

Таким образом, настоящее изобретение характеризуется описанными ниже признаками.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, которая содержит в качестве активного ингредиента антитело или его фрагмент, обладающее иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1, имеющего любую аминокислотную последовательность с четными номерами SEQ ID NO:2-30 или аминокислотную последовательность на 80% или более, предпочтительно, на 85% или более, более предпочтительно, на 90% или более, и более предпочтительно, на 95% или более идентичную любой аминокислотной последовательности с четными номерами SEQ ID NO:2-30, или фрагмента белка CAPRIN-1, содержащего 7 или более последовательных аминокислот.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, злокачественная опухоль представляет собой рак молочной железы, опухоль головного мозга, лейкоз, лимфому, рак легких, рак пищевода, рак толстой кишки, рак желудка или рак почек.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, антитело представляет собой моноклональное или поликлональное антитело.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, антитело представляет собой антитело человека, гуманизированное антитело, химерное антитело, одноцепочечное антитело или биспецифичное антитело.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, антитело представляет собой антитело, обладающее иммунологической реактивностью в отношении полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную в последовательности SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 136, или аминокислотную последовательность на 80% или более, предпочтительно, на 85% или более, более предпочтительно, на 90% или более, и, еще более предпочтительно, на 95% или более идентичную аминокислотной последовательности или фрагмента этого полипептида.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, в фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли, содержащей антитело в качестве активного ингредиента, указанное выше антитело представляет собой любое из антител с (a) по (k), описанное ниже, и обладает иммунологической реактивностью в отношении белка CAPRIN-1.

(a) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:40, 41 и 42 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:44, 45, и 46.

(b) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:40, 41, и 42 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:50, 51, и 52.

(c) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:40, 41, и 42 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:55, 56, и 57.

(d) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:40, 41, и 42 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:60, 61, и 62.

(e) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:40, 41 и 42 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:65, 66 и 67.

(f) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:70, 71 и 72 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:74, 75 и 76.

(g) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:80, 81 и 82 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO: 84, 85 и 86.

(h) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO:90, 91 и 92 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO: 94, 95 и 96.

(i) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO: 100, 101 и 102 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO: 104, 105 и 106.

(j) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO: 110, 111 и 112 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO: 114, 115 и 116.

(k) Антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO: 120, 121 и 122 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности, показанные в SEQ ID NO: 124, 125 и 126.

ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антитела против CAPRIN-1, используемые в настоящем изобретении, повреждают (или поражают) злокачественные клетки. Следовательно, такие антитела против CAPRIN-1 применимы для лечения или профилактики злокачественных опухолей.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 показаны профили экспрессии генов, кодирующих белки CAPRIN-1 в нормальных тканях и линиях опухолевых клеток. На этой фигуре ссылка №1 показывает профиль экспрессии каждого гена, кодирующего CAPRIN-1, и ссылка №2 показывает профиль экспрессии гена GAPDH.

На Фиг. 2 показана цитотоксическая активность антитела против CAPRIN-1 (или антитела против CAPRIN-1) в отношении линии злокачественных клеток молочной железы, экспрессирующих ген CAPRIN-1 (T47D). На этой фигуре ссылка №3 показывает активность после добавления антитела против CAPRIN-1, ссылка №4 показывает активность после добавления контрольного антитела, и ссылка №5 показывает активность в отсутствие какого-либо антитела.

На Фиг. 3 показана цитотоксическая активность антитела против CAPRIN-1 (или антитела против CAPRIN-1) в отношении линии злокачественных клеток молочной железы, экспрессирующих ген CAPRIN-1 (MDA-MB-157). На этой фигуре ссылка №6 показывает активность после добавления антитела против CAPRIN-1, ссылка №7 показывает активность после добавления контрольного антитела, и ссылка №8 показывает активность в отсутствие какого-либо антитела.

На Фиг. 4 показана цитотоксичность в отношении линии злокачественных клеток молочной железы MDA-MB-157, экспрессирующих CAPRIN-1, где цитотоксичность демонстрируется моноклональными антителами против CAPRIN-1 (т.е. моноклональными антителами #1-#11), которые являются реакционноспособными в отношении поверхности злокачественной клетки. В частности, на этой фигуре показаны уровни активности после добавления моноклонального антитела против CAPRIN-1 #1 (ссылка №9), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #2 (ссылка №10), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #3 (ссылка №11), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #4 (ссылка №12), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #5 (ссылка №13), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #6 (ссылка №14), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #7 (ссылка №15), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #8 (ссылка №16), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #9 (ссылка №17), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #10 (ссылка №18), и моноклонального антитела против CAPRIN-1 #11 (ссылка №19), уровень активности после добавления моноклонального антитела, взаимодействующего с самим белком CAPRIN-1, но не с поверхностью злокачественной клетки (ссылка №20), и уровень активности после добавления PBS вместо каждого антитела (ссылка №21).

На Фигурах 5a-5c показано противоопухолевое действие моноклональных антител против CAPRIN-1 (т.е., моноклональных антител #1-#11), взаимодействующих с поверхностью злокачественной клетки, у мышей Balb/c, которым трансплантировали линию клеток саркомы мышей CT26, экспрессирующих CAPRIN-1. На этих фигурах показаны размеры опухоли у мышей после введения моноклонального антитела против CAPRIN-1 #1 (ссылка №22), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #2 (ссылка №23), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #3 (ссылка №24), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #4 (ссылка №25), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #5 (ссылка №26), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #6 (ссылка №27), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #7 (ссылка №28), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #8 (ссылка №29), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #9 (ссылка №30), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #10 (ссылка №31), и моноклонального антитела против CAPRIN-1 #11 (ссылка №32), размер опухоли у мышей после введения моноклонального антитела, взаимодействующего с самим белком CAPRIN-1, а не с поверхностью злокачественной клетки (ссылка №33), и размер опухоли у мышей после введения PBS вместо каждого антитела (ссылка №34).

На Фигурах 6a-6c показано противоопухолевое действие моноклональных антител против CAPRIN-1 (т.е. моноклональных антител #1-#11), взаимодействующих с поверхностью злокачественной клетки, у мышей Balb/c, которым были трансплантированы клетки карциномы мышей линии N1E, экспрессирующих CAPRIN-1. На этих фигурах показаны размеры опухоли у мышей после введения моноклонального антитела против CAPRIN-1 #1 (ссылка №35), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #2 (ссылка №36), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #3 (ссылка №37), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #4 (ссылка №38), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #5 (ссылка №39), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #6 (ссылка №40), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #7 (ссылка №41), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #8 (ссылка №42), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #9 (ссылка №43), моноклонального антитела против CAPRIN-1 #10 (ссылка №44), и моноклонального антитела против CAPRIN-1 #11 (ссылка №45), размер опухоли у мышей после введения моноклонального антитела, взаимодействующего с самим белком CAPRIN-1, а не с поверхностью злокачественной клетки (ссылка №46), и размер опухоли у мышей после введения PBS вместо каждого антитела (ссылка №47).

СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как описано ниже, противоопухолевая активность антител против полипептида с любой последовательностью с четными номерами SEQ ID NO:2-30, использованных в настоящем изобретении, может определяться путем исследования in vivo ингибирования опухолевого роста у животного с опухолью, или путем исследования in vitro проявляется или, или нет иммуноцит- или комплемент-опосредованная цитотоксическая активность против опухолевых клеток, экспрессирующих этот полипептид.

Кроме того, нуклеотидные последовательности полипептидов, кодирующих эти белки, состоящие из аминокислотных последовательностей с четными номерами SEQ ID NO: 2-30 (т.е., SEQ ID NO:2, 4, 6…28 и 30) показаны в последовательностях с нечетными номерами SEQ ID NO:1-29 (т.е., SEQ ID NO:1, 3, 5…27 и 29), соответственно.

Аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 и 14 в списке последовательностей, описанные в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой аминокислотные последовательности белков CAPRIN-1, которые были выделены способом SEREX с использованием библиотек кДНК из ткани семенников, и сыворотки, полученной от собак с раком молочной железы, в качестве полипептидов, обладающих способностью связываться с антителами, специфически находящимися в сыворотках, полученных от собак, имеющих опухоли; аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID NO:2 и 4 представляют собой аминокислотные последовательности белков CAPRIN-1, выделенных у человека в качестве гомологов указанных полипептидов собак; аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO:16 представляет собой аминокислотную последовательность белка CAPRIN-1, выделенного у быка в качестве гомолога указанного полипептида собак; аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 18 представляет собой аминокислотную последовательность белка CAPRIN-1, выделенную у лошади в качестве гомолога указанного полипептида собаки; аминокислотная последовательность, показанная в (четные номера) последовательностях SEQ ID NO:20-28 представляет собой аминокислотные последовательности белков CAPRIN-1, выделенных у мышей в качестве гомологов полипептидов собаки; и аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO:30 представляет собой аминокислотную последовательность белка CAPRIN-1, выделенного у цыпленка в качестве гомолога указанного полипептида собаки (см. Пример 1, описанный ниже). Известно, что CAPRIN-1 экспрессируется при активации или клеточном делении нормальных клеток в стадии покоя.

Было известно, что CAPRIN-1 не экспрессировался на поверхности клеток. Однако, в результате исследования связанного с настоящим изобретением, было обнаружено, что некоторые части белка CAPRIN-1 экспрессируются на поверхностях различных злокачественных клеток. В соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно используется антитело, которое связывается с частью в пределах белка CAPRIN-1, экспрессируемой на поверхностях злокачественных клеток. Примеры частичных пептидов в пределах белка CAPRIN-1, экспрессируемых на поверхностях злокачественных клеток, включают полипептиды, состоящие из последовательности 7 или более непрерывных аминокислот в области аминокислотных остатков №№ (или аминокислот (aa)) 50-98 или аминокислотных остатков №№ (aa) 233-305 в любой аминокислотной последовательности с четными номерами SEQ ID NO:2-30, за исключением последовательностей SEQ ID NO:6 и 18, списка последовательностей. Их конкретные примеры включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO:37 или 136 (предпочтительно, область аминокислотной последовательности SEQ ID NO:137 или 138 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:136), или аминокислотную последовательность на 80% или более, предпочтительно, на 85% или более, более предпочтительно, на 90% или более, и, еще более предпочтительно, на 95% или более идентичную указанным аминокислотным последовательностям. Антитела по настоящему изобретению включают все антитела, способные связываться с указанными выше пептидами и обладающие противоопухолевой активностью.

Антитела против CAPRIN-1, применимые в настоящем изобретении, как описано выше, могут быть любого типа, при условии, что они могут проявлять противоопухолевую активность. Их примеры включают моноклональные антитела, поликлональные антитела, синтетические антитела, мультиспецифичные антитела, антитела человека, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные антитела (scFV), и их фрагменты, такие как Fab и F(ab')₂. Эти антитела и их фрагменты могут быть получены способами, известными специалистам в данной области. В настоящем изобретении, предпочтительными являются антитела, способные специфически связываться с белком CAPRIN-1. Такие антитела предпочтительно представляют собой моноклональные антитела; однако, при условии, что гомогенные антитела могут быть стабильно продуцированы, также могут быть использованы поликлональные антитела. Кроме того, если пациентом является человек, антитело человека или гуманизированное антитело является предпочтительным во избежание иммунологического отторжения или для его ингибирования.

Выражение "специфически связывающееся с белком CAPRIN-1", используемое в контексте настоящего изобретения, означает, что антитело, представляющее интерес, специфически связывается с белком CAPRIN-1 и по существу не связывается с другими белками.

Как описано ниже, противоопухолевую активность антитела, используемого в настоящем изобретении, можно оценивать путем исследования in vivo ингибирования опухолевого роста у животного имеющего опухоль, или исследования in vitro проявление, или нет иммуноцит- или комплемент-опосредованной цитотоксической активности против опухолевых клеток, экспрессирующих этот полипептид.

Более того, пациентами, нуждающимися в лечении и/или профилактике злокачественных опухолей в соответствии с настоящим изобретением, являются млекопитающие, такие как человек, домашние животные, скот, или спортивные животные. Предпочтительным пациентом является человек.

Получение антигенов, получение антител и фармацевтические композиции, относящиеся к настоящему изобретению, будут рассмотрены ниже.

Получение антигенов, используемых для получения антител

Белки или их фрагменты, используемые в качестве сенсибилизирующих антигенов для получения антител против CAPRIN-1, используемых в настоящем изобретении, не ограничиваются их происхождением, например, животным, включая, например, людей, собак, быков, лошадей, мышей, крыс или цыплят. Однако, такие белки или их фрагменты предпочтительно выбирают, принимая во внимание их совместимость с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Белки млекопитающих в основном являются предпочтительными, и белки человека являются особенно предпочтительными. Например, если CAPRIN-1 представляет собой CAPRIN-1 человека, может быть использован белок CAPRIN-1 человека, его частичный пептид или клетки, способные экспрессировать CAPRIN-1 человека.

Нуклеотидные последовательности и аминокислотные последовательности CAPRIN-1 человека и их гомологи могут быть получены, например, путем доступа в GenBank (NCBI, USA) и с использованием алгоритма BLAST или FASTA (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877,1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997).

В соответствии с настоящим изобретением, в тех случаях, когда нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 1 или 3) или аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2 или 4) CAPRIN-1 человека используют в качестве основной последовательности, мишенями являются нуклеиновые кислоты или белки, состоящие из последовательности, на 70%-100%, предпочтительно, на 80%-100%, более предпочтительно, на 90%-100%, и, еще более предпочтительно, на 95%-100% (например, на 97%-100%, 98%-100%, 99%-100%, или 99,5%-100%) идентичной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности ORF или зрелой части основной нуклеотидной последовательности или аминокислотной последовательности. Термин "% идентичности последовательности", используемый в контексте настоящего изобретения, означает процент (%) числа идентичных аминокислот (или нуклеотидов), от общего числа аминокислот (или нуклеотидов) в случае выравнивания двух последовательностей, так, чтобы максимальное сходство могло достигаться с введением или без введения разрывов.

Фрагменты белка CAPRIN-1 имеют длину в диапазоне от аминокислотной длины эпитопа (или антигенной детерминанты), который является наименьшей единицей антигена, распознаваемого антителом, до менее чем полноразмерной длины этого белка. Эпитоп относится к полипептидному фрагменту, обладающему антигенностью или иммуногенностью у млекопитающих и, предпочтительно, у людей. Наименьшая единица полипептидного фрагмента состоит приблизительно из 7-12 аминокислот, и, например, от 8 до 11 аминокислот. Их конкретным примером является аминокислотная последовательность, показанная в SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:137, или SEQ ID NO:138, аминокислотная последовательность на 80% или более, предпочтительно, на 85% или более, более предпочтительно, на 90% или более, и еще более предпочтительно, на 95% или более идентичная указанной аминокислотной последовательности.

Полипептиды, содержащие указанный выше белок CAPRIN-1 человека и его частичные пептиды, могут быть синтезированы в соответствии со способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (флуоренилметилоксикарбонильный способ) или способ tBoc (т-бутилоксикарбонильный способ) (Japanese Biochemical Society (ed.), "Biochemical Experimentation Course (Seikagaku Jikken Koza) 1", Protein Chemistry IV, Chemical Modification and Peptide Synthesis, Kagaku-dojin Publishing Company, Inc. (Japan), 1981). Также они могут быть синтезированы общими способами с использованием целого ряда коммерчески доступных синтезаторов пептидов. Кроме того, полипептиды, представляющие интерес, могут быть получены путем получения полинуклеотидов, кодирующих указанные выше полипептиды с использованием известных способов генной инженерии (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, etc.), встраивая каждый из полинуклеотидов в вектор экспрессии, и вводя этот вектор в клетку-хозяина, тем самым давая возможность клетке-хозяину продуцировать этот полипептид. Таким путем могут быть получены желаемые полипептиды.

Полинуклеотиды, кодирующие указанные выше полипептиды, легко могут быть получены с помощью известных методик генной инженерии или общих способов, с использованием коммерчески доступных синтезаторов нуклеиновых кислот. Например, ДНК, содержащая нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, может быть получена с помощью ПЦР с использованием библиотеки хромосомной ДНК человека или кДНК в качестве матрицы и пары праймеров, обеспечивающих амплификацию нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1. Условия ПЦР могут быть определены соответствующим образом. Например, такие условия могут включать проведение 30 циклов стадий реакции (в качестве одного цикла), состоящих из: 94°C, 30 секунд (денатурация); 55°C, от 30 секунд до 1 минуты (отжиг); и 72°C, 2 минуты (элонгация) с использованием термостабильной ДНК полимеразы (например, Taq полимеразы) и Mg²⁺-содержащего ПЦР буфера, с последующим взаимодействием при 72°C в течение 7 минут после завершения 30 циклов. Однако настоящее изобретение не ограничено приведенными выше примерами условий для ПЦР. Методики проведения ПЦР и условия описаны, например, у Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons (Глава 15, в частности).

Кроме того, желаемая ДНК может быть выделена путем получения соответствующих зондов и праймеров на основании информации о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, показанных в SEQ ID NO:1-30 в списке последовательностей, описанных в настоящей заявке, и скрининга библиотеки кДНК человека, или подобной, с использованием таких зондов и праймеров. Предпочтительно такую библиотеку кДНК получают из клетки, органа или ткани, в которых экспрессируется белок с любой последовательностью с четными номерами SEQ ID NO:2-30. Примеры клеток или тканей включают клетки или ткани из семенников и злокачественных опухолей или опухолей, таких как лейкоз, рак молочной железы, лимфома, опухоль головного мозга, рак легких и рак толстой кишки. Проведение таких работ, как получение зондов или праймеров, конструирование библиотек кДНК, скрининг библиотек кДНК и клонирование представляющих интерес генов, как описано выше, известно специалистам в данной области, и они могут быть выполнены, например, в соответствии со способами, описанными у Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd edition, Current Protocols in Molecular Biology (1989) и Ausbel et al. (ibid.). ДНК, кодирующие белок CAPRIN-1 человека и его частичные пептиды, могут быть получены из полученных таким образом ДНК.

Описанными выше клетками-хозяевами могут быть любые клетки, при условии, что они могут экспрессировать описанные выше полипептиды. Пример прокариотических клеток-хозяев включает, но не только, Escherichia coli. Примеры эукариотических клеток-хозяев включают, но не только, клетки млекопитающих, такие как клетки почек мартышки (COS1), ооциты китайского хомячка (CHO), линию клеток эмбриональных почек человека (HEK293), и линию клеток эмбриональной кожи мыши (NIH3T3), клетки дрожжей, таких как почкующиеся дрожжи и делящиеся клетки дрожжей, клетки тутового шелкопряда и яйцеклетки Xenopus.

В тех случаях, когда прокариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, может быть использован вектор экспрессии, имеющий точку начала репликации для прокариотических клеток, промотор, сайт связывания с рибосомой, сайт множественного клонирования, терминатор, ген резистентности к лекарственным средствам, ген ауксотрофной комплементарности, или подобное. В качестве векторов экспрессии для Escherichia coli, можно привести в пример pUC векторы, pBluescriptII, системы экспрессии pET, системы экспрессии pGEX, и подобные. ДНК, кодирующую указанный выше полипептид, встраивают в такой вектор экспрессии, прокариотическую клетку-хозяина трасформируют этим вктором, а затем культивируют полученную таким образом клетку, так, чтобы полипептид, кодируемый ДНК, мог экспрессироваться в этой прокариотической клетке-хозяине. Одновременно, этот полипептид также может быть экспрессирован в виде слитого белка с другим белком.

В тех случаях, когда эукариотические клетки используют в качестве клеток-хозяев, могут быть использованы векторы экспрессии для эукариотических клеток, имеющие промотор, область сплайсинга, сайт добавления поли(А) или подобное. Примеры таких векторов экспрессии включают pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, вектор EBV, pRS, pcDNA3, и pYES2. С помощью методик, аналогичных упомянутым выше, ДНК, кодирующую указанный выше полипептид, встраивают в такой вектор экспрессии, эукариотическую клетку-хозяина трансформируют этим вектором, а затем культивируют полученную таким образом трансформированную клетку, так, чтобы полипептид, кодируемый указанной выше ДНК, мог быть экспрессирован в эукариотической клетке-хозяине. В тех случаях, когда в качестве вектора экспрессии используют pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, или тому подобное, указанный выше полипептид может быть экспрессирован в качестве слитого белка с меткой, такой как His-метка (например, (His)₆-(His)₁₀), FLAG-метка, myc-метка, HA-метка или GFP.

Для введения вектора экспрессии в клетку-хозяина, могут быть использованы хорошо известные способы, такие как электропорация, способ с использованием фосфата кальция, липосомный способ, способ с использованием DEAE декстрана, микроинъекция, вирусное инфицирование, липофекция и связывание с пептидом, проникающим через клеточную мембрану.

Выделение и очистку полипептида, представляющего интерес, из клеток-хозяев, можно проводит с использованием известных методик выделения в сочетании. Примеры таких известных методик включают, но не только, обработку с использованием денатурирующего вещества, такого как мочевина или поверхностно-активное вещество, обработку ультразвуком, ферментативное расщепление, высаливание, фракционирование растворителем и преципитацию, диализ, центрифугирование, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, SDS-PAGE, изоэлектрофокусирующий электрофорез, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, аффинную хроматографию и хроматографию с обращенной фазой.

Структура антитела

В основном, антитела представляют собой гетеромультимерные гликопротеины, содержащие по меньшей мере две тяжелые цепи и две легкие цепи. При этом, антитела, за исключением IgM, являются гетеротетрамерными гликопротеинами (приблизительно 150 кДа), содержащими две идентичные легкие (L) цепи и две идентичные тяжелые (H) цепи. Обычно, каждая легкая цепь соединена с тяжелой цепью посредством одной ковалентной дисульфидной связи. Однако, количество дисульфидных связей между тяжелыми цепями варьирует среди различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая цепь и легкая цепь также имеет внутрицепочечную дисульфидную связь(и). Каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (область VH) на одном своем конце, с которым последовательно соединено несколько константных областей. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (область VL) с одного своего конца, и имеет одну константную область на своем противоположном конце. Константную область легкой цепи выравнивают с первой константной областью тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи выравнивают с вариабельным доменом тяжелой цепи. Особая область вариабельного домена антитела, которая называется "областью, определяющей комплементарность (CDR)", демонстрирует специфическую вариабельность, чтобы придать антителу специфичность связывания. Относительно консервативная часть в вариабельной области называется "каркасной областью (FR)". Полный вариабельный домен тяжелой цепи или легкой цепи содержит 4 FR, соединенные друг с другом посредством 3 CDR. Такие CDR называются "CDRH1", "CDRH2", и "CDRH3", соответственно, в таком порядке от N-конца в тяжелой цепи. Аналогично, для легкой цепи они называются "CDRL1", "CDRL2", и "CDRL3", соответственно. CDRH3 играет наиболее важную роль в отношении специфич