Химерный белок, являющийся флуоресцентным биосенсором для одновременной детекции пероксида водорода и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата, нуклеиновая кислота, кодирующая такой белок, кассета экспрессии и эукариотическая клетка-хозяин

Химерный белок, являющийся флуоресцентным биосенсором для одновременной детекции пероксида водорода и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата, нуклеиновая кислота, кодирующая такой белок, кассета экспрессии и эукариотическая клетка-хозяин

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

[001] Это изобретение относится в основном к области биологии и химии. В частности, изобретение направлено на биосенсоры на основе флуоресцентных белков.

Уровень техники

[002] Флуоресцентные белки семейства GFP (Green Fluorescent Protein, GFP), включая собственно GFP из медузы Aequorea victoria (avGFP), его мутанты и гомологи, сегодня широко известны благодаря их интенсивному использованию в качестве флуоресцентных маркеров in vivo в биомедицинских исследованиях (Lippincott-Schwartz et al. (2003) Science 300(5616):87-91 и Chudakov et al. Physiol Rev. 2010 90(3):1103-63).

[003] Флуоресцентные белки способны к флуоресценции при облучением светом подходящей длины волны. Флуоресцентные свойства этих белков обусловлены взаимодействием двух или более аминокислотных остатков, формирующих хромофор, а не флуоресценцией какого-либо одного аминокислотного остатка.

[004] GFP гидромедузы Aequorea aequorea (синоним A. victoria) был описан как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играет роль вторичного эммитера, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет (Johnson et al. (1962) J Cell Comp Physiol., 60:85-104). кДНК, кодирующая A. victoria GFP была клонирована (Prasher et al. (1992) Gene, 111(2):229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP автокаталитически образовывать хромофор (Chalfie et al. (1994) Science 263:802-805). Эти сведения открыли широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологи в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.

[005] GFP был использован в широком спектре приложений, включая исследование экспрессии генов и локализацию белков (Chalfie et al. (1994) Science 263:802-805, и Heim et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci., 91:12501-12504), как инструмент для визуализации внутриклеточного распределения органелл (Rizzuto et al. (1995) Curr. Biology, 5:635-642), для визуализации транспорта белков по секреторному пути (Kaether et al. (1995) FEBS Letters, 369:267-271).

[006] Были проведены многочисленные исследования для улучшения свойств avGFP (Aequorea victoria GFP) и для получения вариантов GFP, пригодных и оптимизированных для различных исследовательских целей. Была проведена оптимизация генетического кода avGFP (codon usage) для повышения уровня экспрессии в клетках млекопитающих ("гуманизированный" GFP, Haas et al. (1996) Current Biology, 6:315-324; Yang et al. (1996) Nucleic Acids Research, 24:4592-4593). Были получены различные мутанты GFP, в том числе "усиленный зеленый флуоресцентный белок" (EGFP), имеющий две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al. (1995) Nature 373:663-664). Другие мутанты являются синим, голубым и желто-зеленым спектральными вариантами avGFP и содержат замены аминокислотных остатков, формирующих хромофор, и/или остатков, формирующих окружение хромофора.

[007] Позднее гомологи GFP были клонированы из коралловых полипов семейства Anthozoa (Matz et al. (1999) Nature Biotechnol. 17: 969-973), рачков-копепод (Shagin et al. (2004) Mol Biol Evol., 21(5):841-850), ланцетников (Bomati et al., BMC Evolutionary Biology 2009, 9:77). Сегодня семейство GFP-подобных белков включает сотни флуоресцентных и окрашенных гомологов GFP. Сходство этих белков с GFP варьирует от 80-90% до менее чем 25% идентичности аминокислотной последовательности.

[008] Были получены кристаллические структура avGFP дикого типа, GFP S65T мутанта и ряда гомологов GFP (Ormo et al. (1996) Science 273: 1392-1395; Wall et al. (2000) Nat Struct Biol, 7:1133-1138; Yarbrough et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:462-467; Prescott et al. (2003) Structure (Camb), 11:275-284; Petersen et al. (2003) J Biol Chem, 278:44626-44631; Wilmann et al. (2005) J Biol Chem, 280:2401-2404; Remington et al. (2005) Biochemistry, 44, 202-212; Quillin et al. (2005) Biochemistry, 44:5774-5787). Было постулировано, что все члены семейства обладают общей 3D структурой (GFP-подобным доменом), представляющей собой так называемый "бочонок" из 11 бета-слоев, образующих компактную встречно-параллельную структуру, внутри которой располагается альфа-спираль, содержащая хромофор. Хромофор формируется внутри GFP-подобного домена путем окислительной циклизации трех консервативных аминокислотных остатков в центральном регионе альфа-спирали (Cody et al. (1993) Biochemistry 32: 1212-1218). Положения аминокислотных остатков, формирующих хромофор, соответствует Ser65-Tyr66-Gly67 региону avGFP. Эти аминокислотные остатки легко могут быть идентифицированы у любого GFP-подобного белка путем выравнивания его последовательности с последовательностью avGFP.

[009] Флуоресцентные белки представляют собой уникальное семейство структурно родственных белков, которые способны формировать хромофор автокаталитически без привлечения внешних субстратов или кофакторов. Под действием индуцирующего света, хромофор производит флуоресценцию, легко детектируемую с помощью современного лабораторного оборудования (спектрофлуориметр, флуоресцентный микроскоп, флуоресцентно-активируемый клеточный сортер, планшетный флуориметр).

[010] Процесс автокаталитического формирования хромофора белков с различными спектральными свойствами подробно описан в ряде статей и включает несколько химических реакций (Heim et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA. 91:12501-12504; Ormo et al. (1996) Science. 273:1392-1395; Yang et al. (1996) Nat Biotechnol. 14:1246-1251; Brejc et al. (1997) J. Proc Natl Acad Sci USA. 94:2306-2311; Palm et al. (1997) Nat Struct Biol. 4:361-365; Gurskaya et al. (2001) BMC Biochem. 2:6; Gross et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA. 97:11990-11995; Wall et al. (2000) Nat Struct Biol. 7:1133-1138; Yarbrough et al. (2001) J. Proc Natl Acad Sci USA. 98:462-467; Pakhomov et al. (2008) Chem. Biol., 15:755-764; Quillinet et al. (2005) Biochemistry 44:5774-5787; Yampolsky et al. (2005) Biochemistry 44: 5788-5793; Shu et al. (2006) Biochemistry 45:9639-9647; Kikuchi et al. (2008) Biochemistry 47:11573-11580; Yampolsky et al., (2009) Biochemistry, 48 (33):8077-8082).

[011] GFP-подобные белки широко используют для создания генетически-кодируемых биосенсоров (Prinz et al., Proteomics 2008, 8, 1179-1196). Исследование внутриклеточных процессов с помощью таких биосенсоров становятся все более популярным, так как только такие сенсоры могут дать информацию об изменении исследуемого параметра непосредственно в живой системе. Генетически-кодируемые биосенсоры востребованы как в фундаментальных исследованиях сигнальных путей организма, так и при тестировании токсических и лекарственных препаратов на модельных клеточных линиях или организмах. Генетически кодируемые биосенсоры относятся к классу безреагентных и многоразовых сенсоров, в отличие от химических индикаторов биологически активных субстанций, требующих экзогенно добавляемых красителей, субстратов или кофакторов.

[012] Биосенсоры на основе флуоресцентных белков представляют собой химерные белки, в состав которых входит сенсорный домен - белок, белковый домен или полипептид, чувствительный к изменению определенного параметра клетки, например, изменению концентрации какого-либо соединения, иона или молекулы (ионов кальция, перекиси водорода, ионов водорода и т.д.). В качестве сигнальной части биосенсора используют GFP-подобные белки.

[013] Одним из типов биосенсоров являются так называемые транслокационные сенсоры, в которых сенсорный домен, связываясь с тестируемым соединением, индуцирует изменение клеточной локализации белка (например, транслокацию из цитоплазмы на плазменную мембрану, из цитоплазмы в ядро или наоборот). Детектируемым параметром в таких биосенсорах является изменение локализации флуоресцентного сигнала в клетке.

[014] Другой тип - спектральные биосенсоры, способные в ответ на появление в среде тестируемого соединения изменять конформацию сенсорного домена. Это изменение в свою очередь вызывает изменение конформации и спектральных свойств входящего в состав биосенсора GFP-подобного белка. В таких биосенсорах часто используют варианты GFP-подобных белков, подвергнутые круговой пермутации (Suslova et al. (2005) Trends Biotechnol. 23(12):605-13; Griesbeck, (2004) Curr Opin Neurobiol., 14(5):636-641; Bunt et al. (2004) Int Rev Cytol., 237:205-277).

[015] Создание пермутированных GFP-подобных белков необходимо для увеличения подвижности хромофорного окружения и, следовательно, для большей лабильности спектральных свойств белка. Круговая пермутация флуоресцентных белков описана (Topell S. et al. (2002) Methods in Molecular Biology. 183:31-48). Например, для круговой пермутации avGFP в его первичную структуру вносится разрыв в область между 144 и 149 аминокислотами, нативные N- и С-концы оперативно совмещаются при помощи полипептидного линкера. Новые N- и С-концы находятся в непосредственной близости от хромофора и могут влиять на его микроокружение. Круговая пермутация производится на уровне нуклеиновой кислоты путем оперативного сшивания 3'- и 5'-концов нуклеотидной последовательности, кодирующей флуоресцентный белок, и внесения разрыва в последовательность между кодонами, кодирующими новые N- и С-концевые аминокислоты. Методы для получения таких конструкций хорошо известны специалистам в данной области. В результате круговой пермутации кпФБ (круговой пермутант флуоресцентного белка) приобретает способность реагировать на конформационные перестройки в области новых N- и С-концов изменением спектра флуоресценции (сенсоры с использованием обычных флуоресцентных белков оказались малочувствительными). Эффективность биосенсоров на основе кпФБ, полученных из avGFP, была продемонстрирована на примере сенсора на ионы кальция (Nagai et al., (2001) Proc Natl Acad Sci USA. 98(6):197-202) и пероксид водорода (Belousov et al., (2006) Nature Method. 4:281-286).

[016] Одним из важнейших и изученных липидных вторичных мессенджеров является фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфат (PIP3), для детекции которого востребованы генетически-кодируемые биосенсоры. PIP3 представляет собой фосфорилированное производное фосфатидилинозитола (PI), отрицательно заряженного фосфолипида, минорного компонента цитоплазматической стороны клеточной мембраны эукариотических клеток. Фосфатидилинозитол представляет собой глицерофосфолипид, содержащий скелет глицерола, замещенный двумя остатками жирных кислот и полярной инозитольной группой через остаток фосфорной кислоты. Инозитол в составе фосфатидилинозитола может быть фосфорилирован с образованием фосфатидилинозитол фосфата (PIP), фосфатидилинозитол бифосфата (PIP2) и фосфатидилинозитол трифосфата (PIP3). PIP, PIP2 и PIP3 называют фосфоинозитидами.

[017] Внутриклеточная передача сигнала с участием фосфорилированных форм фосфатидилинозитола (PI), фосфоинозитидов, происходит в ответ на активацию рецепторов на плазматической мембране (ПМ), таких как тирозинкиназные рецепторы (Bae et al. (2000) The Journal of biological chemistry 275: 10527-31; Bäumer et al. (2008) The Journal of biological chemistry 283:7864-76), рецепторы, сопряженные с G-белком (Xu et al. (2007) The Journal of cell biology 178:141-53), и интегрины (Kolanus et al. (1997) Current opinion in cell biology 9:725-31).

[018] Различные формы фосфоинозитидов находятся во всех внутриклеточных мембранах и участвуют в регуляции многих сигнальных процессов, как правило, через привлечение белков с фосфоинозитид-взаимодействующими доменами. Эти домены отличаются друг от друга по специфичности к разным формам фосфоинозитидов (Várnai et al. (2006) Biochimica et biophysica acta 1761:957-67). Pl и фосфоинозитиды могут быть фосфорилированы фосфатидилинозитолкиназами и дефосфорилированы липидными фосфатазами. Фосфатидилинозитол-3-киназы (PI-3K) фосфорилирует фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат с образованием PIP3, который в дальнейшем может быть дефосфорилирован липидной фосфатазой PTEN (Tamguney et al. (2007) Journal of cell science 120:4071-9).

[019] Образование в мембране PIP3 может быть обнаружено с помощью химерных флуоресцентных белков, таких как GFP, оперативно слитых с фосфоинозитид-чувствительными белковыми доменами PI-3K (Cantley LC (2002) Science 296:1655-1657). В частности, было разработано несколько транслокационных биосенсоров для детекции PIP3 с использованием доменов протеинкиназы Akt, тирозин киназы Брутона (Bruton's tyrosine kinase, Btk) и основного рецептора для фосфоинозитида-1 (GRP1), описанных Varnai et al. (1999; J Biol Chem 274:10983-10989); Venkateswarlu et al. (1998; Biochem J 335:139-146), Watton и Downward (1999; Cirr Biol 9:433-436); Sato et al. (2003; Nat Cell Biol 5:1016-1022). Транслокационный биосенсор BtkPH-GFP (Varnai et al. (1999) J Biol Chem 274:10983-10989), являющийся химерным белком, состоящим из РН (pleckstrin homology)-домена Btk (1-117 аминокислоты Btk), оперативно связанным своим С-концом с N-концом EGFP, принят Заявителем в качестве аналога.

[020] BtkPH-GFP транслоцируется из цитоплазмы к мембране в ответ на появление PIP3 и позволяет по изменению распределения интенсивности флуоресценции между цитоплазмой и мембраной оценивать пространственно-временной характер действия липидных протеинкиназ и фосфатаз.

[021] Другим важным вторичным мессенджером является пероксид водорода (Н₂O₂), который действует путем специфичного обратимого окисления редокс-активных тиоловых групп в остатках цистеинов некоторых белков. Предполагают, что внутриклеточные сигнальные эффекты Н₂О₂ осуществляются в соответствии с моделью компартментализованной окислительно-восстановительной передачи сигнала, когда белок-мишень и источник Н₂O₂ находятся в непосредственной близости друг от друга.

[022] Для детекции пероксида водорода описан флуоресцентный биосенсор Hyper, разработанный Заявителем (принят Заявителем в качестве ближайшего аналога).

[023] Hyper представляет собой химерный белок, состоящий из регуляторного домена белка OxyR E.coli, реагирующего с пероксидом водорода и интегрированного в пептидную цепь OxyR пермутированного желтого флуоресцентного белка cpYFP. Hyper представляет собой конструкцию, в которой cpYFP соединен с двумя фрагментами чувствительного к Н₂O₂ домена OxyR посредством коротких пептидных линкеров. Нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагменты белка OxyR и cpYFP, оперативно сшиты между собой с использованием линкерных последовательностей. Линкерные последовательности - нуклеотидные последовательности, кодирующие одну или несколько аминокислот, используются для повышения подвижности частей химерного белка относительно друг друга и способствуют более успешному формированию правильной 30-структуры (Belousov et al. (2006), Nature Methods; 3(4):281-286).

[024] Разработанные на сегодняшний день биосенсоры могут быть использованы для мониторинга одного из клеточных параметров. Однако в большом числе случаев востребованным является одновременный мониторинг нескольких клеточных параметров. Однако на сегодняшний день многопараметрических биосенсоров не разработано.

[025] В частности, известно, что генерация пероксида водорода NADPH-оксидазами и сигнализация с участием липидов являются кооперативными процессами. Сборка компонентов комплекса NADPH-оксидазы на мембране и ее активация зависят от появления продуктов активности PI-3K (Kanai et al. (2001) Nature cell biology 3:675-8). H₂O₂, продуцируемый NADPH-оксидазами, окисляет тиолат в активном центре фосфатазы PTEN и тем самым увеличивает время жизни продуктов PI-3K (Dröge et al. (2002) Physiological reviews 82:47-95).

[026] Так как липидная и окислительно-восстановительная сигнализация, как правило, взаимосвязаны, то технология одновременного наблюдения за появлением PIP3 и продукцией Н₂О₂ является высоко востребованной, однако биосенсоров для одновременного мониторинга продукции Н₂O₂ и PIP3 в клетках до сих пор не было создано.

Раскрытие изобретения

[027] Таким образом, изобретательской задачей было создание двупараметрического флуоресцентного биосенсора, позволяющего проводить одновременный мониторинг продукции Н₂O₂ и активности PI-3K (продукции PIP3) в живой клетке.

[028] Заявителем было установлено, что химерный белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:02, содержащий аминокислотную последовательность РН-домена протеинкиназы Btk с заменой Е41К (то есть заменой остатка глутаминовой кислоты в положении 41 на остаток лизина), оперативно связанную своим С-концом с N-концом биосенсора Hyper через короткий полипептидный линкер, позволяет осуществлять одновременную детекцию изменений концентрации Н₂О₂ и PIP3 в живой клетке.

[029] Таким образом, предметом изобретения является охарактеризованный выше химерный белок с SEQ ID NO:02, являющийся флуоресцентным биосенсором для одновременной детекции пероксида водорода и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата в живых клетках, в том числе в клетках живого организма.

[030] Другим объектом изобретения является выделенная нуклеиновая кислота (НК) с последовательностью SEQ ID NO:1, которая кодирует указанный выше флуоресцентный биосенсор с последовательностью SEQ ID NO:02.

[031] Выделенные нуклеиновые кислоты, последовательности которых отличаются от представленных нуклеотидных последовательностей вследствие вырожденности генетического кода, также входят в рамки настоящего изобретения.

[032] В настоящем изобретении также предусмотрены генетические конструкции для амплификации и экспрессии заявленной НК: векторы, включающие нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению, а также кассеты экспрессии.

[033] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрены клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты по настоящему изобретению.

[034] Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрены наборы, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты по настоящему изобретению.

[035] Заявитель подтверждает, что ему не известен химерный белок, выделенная нуклеиновая кислота и связанные с ними другие объекты изобретения из предшествующего уровня техники.

[036] Указанные выше аналоги являются условными, так как отличаются от предусмотренного биосенсора по назначению.

[037] Химерный белок - биосенсор не имеет также известного из уровня техники близкого структурного аналога. Также полученный Заявителем близкий по структуре химерный белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:03, кодируемый нуклеиновой кислотой с последовательностью SEQ ID NO:4, вообще не обнаружил свойств двупараметрического биосенсора (см. данные Примера 2).

Краткое описание фигур

[038] Фиг.1 показывает принципиальную схему строения биосенсора (от N-конца к С-концу белка) для одновременной детекции пероксида водорода и PIP3. Линией обозначен полипептидный линкер, связывающий РН-домен протеинкиназы Btk и Hyper.

[039] Фиг.2 показывает серию флуоресцентных микрофотографий клеток NIH-3Т3, экспрессирующих pBtkPH-E41K-HyPer, отражающих динамику изменения концентрации Н₂О₂ и PIP3 у цитоплазматической поверхности ПМ в ответ на стимуляцию клеток PDGF. Клетки стимулировали PDGF (10 нг/мл). Соответствующие временные точки в минутах отмечены на каждом изображении. Верхний ряд серии изображений является ратиометрическим и представляет внутриклеточное распределение отношения F500/F420, отражающее изменения концентрации Н₂O₂. Средний и нижний ряды изображений демонстрирует внутриклеточное распределение BtkPH-E41K-HyPer в двух каналах детекции флуоресценции. На первом изображении из верхнего ряда обведены отдельные клетки и пронумерованы 1-4. Масштабная линейка 15 мкм.

[040] Фиг.3 показывает графики, отражающие активацию PI-3K и изменение концентрации Н₂O₂ в каждой отдельной клетке, представленной на Фиг.2. Отношение F500/F420 отражает изменение концентрации Н₂O₂, отношение (Fmem-Fcyt)/Fmem отражает транслокацию биосенсора на мембрану.

[041] Фиг.4 показывает динамику изменения концентрации Н₂O₂ и PIP3 у цитоплазматической поверхности плазматической мембраны Тн-лимфоцитов при формировании иммунологического синапса (ИС).

Осуществление изобретения

[042] Как указано выше, настоящее изобретение направлено на выделенные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют двупараметрический флуоресцентный биосенсор, позволяющий проводить одновременную детекцию изменения концентрации пероксида водорода и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата в живых клетках. Заявленный биосенсор является химерным белком, включающим РН-домен протеинкиназы Btk с заменой Е41К, оперативно связанный через короткий полипептидный линкер с биосенсором, на пероксид водорода Hyper. Также обеспечиваются векторы и кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения. Также обеспечиваются выделенные рекомбинантные белки, кодируемые нуклеиновыми кислотами настоящего изобретения.

[043] Указанные нуклеиновые кислоты применяются во многих приложениях и методах, в частности, для одновременного мониторинга изменений концентрации пероксида водорода и фосфатидилинозитол-3,4,5-трифосфата внутри живых клеток и выявления клеток, в которых произошла активация продукции переоксида водорода и PIP3.

[044] Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде различных объектов его воплощения.

Белок-биосенсор

[045] В настоящем документе предусмотрен двупараметрический флуоресцентный биосенсор.

[046] Заявленный биосенсор обладает способностью к детектируемой флуоресценции, которая может быть зарегистрирована с помощью визуального скрининга, спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, флуоресцентной микроскопии, с помощью FACS или другим общепринятым способом для регистрации флуоресценции. В отсутствие пероксида водорода, заявленный биосенсор имеет максимум (пик) эмиссии в диапазоне от 500 нм до 550 нм, например, 520 нм, и два пика возбуждения флуоресценции; первый в диапазоне 400-450 нм (например, 420 нм) и второй в диапазоне 470-510 нм (например, 500 нм).

[047] Предусмотренный в настоящем документе флуоресцентный биосенсор является двупараметрическим биосенсором, который благодаря связывающему РН-домену протеинкиназы Btk транслоцируется на плазматическую мембрану эукариотических клеток при связывании с PIP3 и детектируемо изменяет спектральные характеристики флуоресценции при связывании с пероксидом водорода.

[048] При появлении пероксида водорода заявленный биосенсор переходит в окисленное состояние. При окислении биосенсора меняется интенсивность флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны 500 нм (F500) к интенсивности флуоресценции при возбуждении светом с длиной волны 420 нм (F420). Для нужд настоящего изобретения соотношение «F500/F420» является сигналом биосенсора на перекись водорода.

[049] При экспрессии в клетке хозяине НК настоящего изобретения происходит накопление заявленного биосенсора в цитоплазме клеток. При появлении PIP3 заявленный биосенсор меняет внутриклеточную локализацию, то есть транслоцируется, из цитоплазмы клеток на ее плазменную мембрану. Для нужд настоящего изобретения изменение внутриклеточной локализации биосенсора является его сигналом на PIP3. Изменение внутриклеточной локализации биосенсора можно отслеживать по локализации флуоресцентного сигнала в клетке с помощью флуоресцентной микроскопии.

[050] Предусмотренный в настоящем документе флуоресцентный биосенсор является химерным белком, структура которого показана на Фиг.1. Методы получения химерных белков хорошо известны в данной области и подробно описаны в разделе «Молекулы нуклеиновых кислот», infra.

[051] Входящие в состав многопараметрического биосенсора по изобретению белок Hyper и РН-домен оперативно связаны друг с другом, с помощью полипептидного линкера (Фиг.1). Длина и состав аминокислот линкера может быть различен. Например, длина линкера может быть от 1 аминокислотного остатка до 100 аминокислотных остатков, чаще 10-50 аминокислотных остатков, например 20, 25, 30, 33, 35, 40, 45 аминокислотных остатков. Последовательность аминокислот линкера может варьировать в широких пределах, так как в большинстве случаев не влияет на функционирование химерного белка.

[052] Специфические биосенсоры, представляющие интерес, включают биосенсор, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID No:2.

[053] Также обеспечиваются белки, которые по существу сходны с указанным выше специфическим белком, где по существу сходны означает, что эти белки имеют аминокислотную последовательность, идентичную последовательности исходного белка, по крайней мере, на 85% идентичности, обычно, по крайней мере, 90% и чаще, по крайней мере, 95%, (например, 95% и выше; 96% и выше, 97% и выше; 98% и выше: 99% и выше или 100% идентичности последовательности).

[054] Например, мутантные варианты биосенсора могут быть получены с использованием стандартных методов молекулярной биологии, как подробно описано в разделе "молекулы нуклеиновых кислот" ниже. Примеры обеспечивают общие приемы, и использование стандартных способов, так что специалисты, квалифицированные в данной области, могут легко получить большой ряд дополнительных мутантов и проверить, было ли изменено биологическое (например, биохимическое, спектральное, и т.д.) свойство. Например, интенсивность флуоресценции может быть измерена с использованием спектрофлуориметра при различных длинах волн возбуждения.

[055] Мутанты могут сохранять свойства исходного белка или могут иметь биологические свойства, отличные от форм исходного белков. Термин "биологические свойства" белков настоящего изобретения относится, но не лимитирован, спектральными свойствами, такими как максимум возбуждения флуоресценции, максимум испускания, максимальный коэффициент экстинкции, яркость (например, по сравнению с референсным белком), фотостабильность и подобные; биохимические свойства, такие как in vivo и/или in vitro стабильность (например, полупериод распада); скорость созревания, склонность к агрегации и склонность к олигомеризации и другие подобные свойства (по сравнению с референсным белком). Мутации включают единичные аминокислотные замены, делеции и инсерции одной или более аминокислот, укорочение или удлинение N-конца, укорочение или удлинение С- конца и тому подобное.

[056] Белки настоящего изобретения присутствуют в среде, отличной от их естественной среды; например, они рекомбинантны. Белки настоящего изобретения могут находиться в выделенном состоянии, что означает, что белки по существу свободны от других белков и других биологических молекул, присутствующих в естественной среде, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты и т.п., где термин "по существу свободны" в этом случае означает, что меньше чем 70%, обычно меньше чем 60% и чаще меньше чем 50% композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой некоторые другие биологические молекулы, встречающиеся в природе. В некоторых воплощениях, белки присутствуют в по существу очищенной форме, где "по существу очищенная форма" означает очищенная, по меньшей мере, на 95%, обычно, по меньшей мере, на 97% и чаще, по меньшей мере, на 99%.

[057] Заявленные белки могут быть получены искусственным путем, например, экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, белка, представляющего интерес, в соответствующем хозяине, как описано ниже. Для очистки белка могут применяться любые обычные методики, где подходящие методы очистки белка описаны в Guide to Protein Purification (Deuthser ed., Academic Press, 1990). Например, лизат может быть приготовлен из исходного источника и очищен с использованием ВЭЖХ, вытеснительной хроматографии, гель-электрофореза, афинной хроматографии и т.п.

Молекулы нуклеиновых кислот

[058] Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентный биосенсор для одновременной детекции пероксида водорода и активности PI-3K внутри живых клеток, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:02. Специфическим примером НК по данному изобретению является нуклеиновая кислота с последовательностью нуклеотидов, показанная в SEQ ID NO:01.

[059] Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу ДНК, такую как геномная ДНК или кДНК, или молекулу РНК, такую как молекула мРНК. Как здесь используется, термин "кДНК" относится к нуклеиновым кислотам, которые обладают размещением элементов последовательности, найденным в нативных зрелых мРНК, где элементы последовательности представляют собой экзоны и 5' и 3' некодирующие области.

[060] Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая флуоресцентный биосенсор, может быть синтезирована из подходящих нуклеозидтрифосфатов или выделена из биологических источников.

[061] Оба метода основаны на хорошо известных в данной области протоколах. Например, доступность информации о последовательности аминокислот или информации о нуклеотидной последовательности дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению с помощью олигонуклеотидного синтеза. В случае использования информации о последовательности аминокислот, может быть синтезировано несколько нуклеиновых кислот, отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области. Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкты могут быть очищены с помощью хорошо известных в данной области методов, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), или других методов, как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и пo инструкции, описанной, например, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research.

[062] Части нуклеиновой кислоты, кодирующие различные элементы (белковые домены, белки, линкерные полипептиды), могут быть встроены в полилинкер вектора, таким образом, что между различными частями не будет стоп-кодонов в рамке считывания и не будет сбоек рамки считывания. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть собрана из фрагментов с помощью ДНК-лигазы или ПЦР с праймерами, содержащими части, комплементарные концевым последовательностям соединяемых фрагментов. Нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор или его фрагмент, может быть выделена любым из многих известных методов.

[063] Кроме того, также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют биосенсор настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности, вырожденные варианты нуклеиновых кислот создают для увеличения экспрессии в клетке-хозяине. В этом воплощении кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту.

[064] Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются, по меньшей мере, приблизительно на 50% чистыми, обычно, по меньшей мере, приблизительно на 90% чистыми и обычно являются "рекомбинантными", то есть они фланкированы одним или более нуклеотидами, с которыми обычно не связаны в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.

[065] Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высоко сходными нуклеотидными последовательностями могут представлять нуклеотидные замены в последовательности, которые возникают в процессе нормальной репликации или дупликации. Другие замены могут быть специально рассчитаны и вставлены в последовательность для определенных целей таких, как изменение кодонов определенных аминокислот или нуклеотидной последовательности регуляторного региона. Такие специальные замены могут быть произведены in vitro с помощью различных технологий мутагенеза или получены в организмах-хозяевах, находящихся в специфических селекционных условиях, которые индуцируют или отбирают эти изменения. Такие специально полученные варианты последовательности могут быть названы "мутантами" или "производными" исходной последовательности.

[066] Мутантные или производные нуклеиновые кислоты могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации, для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см., например, Gustin et al., Biotechniques (1993) 14:22; Barany, Gene (1985) 37:111-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp.15.3-15.108), включая подверженный ошибкам ПЦР (error-prone PCR), shuffling, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, генное реассемблирование (gene reassembly), генный сайт-насыщающий мутагенез (GSSM), искусственную перестройку с легированием (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены методом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацил-содержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассогласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радиоактивный мутагенез, делетационный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез искусственных генов, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации.

[067] Также предусмотрены вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты.

[068] Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д. последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области, множество таких векторов доступно коммерчески. Для приготовления конструкции полноразмерную нуклеиновую кислоту или ее часть обычно вставляют в вектор посредством соединения ДНК-лигазой с расщепленным ферментами рестрикции сайту в векторе.

[069] Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно, присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляют легированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности.

[070] Также предусмотрены кассеты экспрессии или системы, используемые для получения заявленных флуоресцентных биосенсоров или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты.

[071] В экспрессионном векторе или кассете экспрессии заявленная нуклеиновая кислота является оперативно связанной с регуляторной последовательностью, которая может включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы и обеспечивает инициацию считывания РНК (транскрипции) в клетке-хозяине. В экспрессионном векторе или кассете экспрессии нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть также связана с сигналами терминации транскрипции, функциональным в клетке-хозяине. Методы изготовления кассет экспрессии или систем для экспрессии желаемого продукта известны специалистам, квалифицированным в данной области.

[072] Кассета экспрессии может существовать, как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку. Для экспрессии генный продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой по изобретению, экспрессируется в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжевые клетки, клетки насекомых, земноводных или млекопитающих.

[073] Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки настоящего изобретения, могут быть получены способами, известными в данной области (например, котрансфекцией с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение трансфецированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном).

[074] Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. coli, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или другие эукариотические кле