Антитела к nkg2a и их применения

Антитела к nkg2a и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к анти-NKG2A антителам, в частности к гуманизированным версиям мышиных анти-NKG2A антител Z270, а также к способам получения и применения таких антител.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

CD94/NKG2A представляет собой цитотоксический ингибиторный рецептор, находящийся на субпопуляциях НК-, НКТ- и Т-клеток, который ограничивает уничтожение ими клеток, экспрессирующих CD94/NKG2A-лиганд HLA-E (см., например, WO99/28748). Антитела, которые ингибируют CD94/NKG2A, могут увеличивать цитолитическую активность опухолеспецифичных лимфоцитов против опухолевых клеток. Таким образом, терапевтические антитела, которые ингибируют CD94/NKG2A у онкологических больных без уничтожения CD94/NKG2A-экспрессирующих клеток, могут контролировать опухолевый рост. Кроме того, некоторые виды лимфом, например, такие как НК-лимфома, характеризуются CD94/NKG2A-экспрессией. У таких пациентов терапевтические антитела, которые поражают и уничтожают CD94/NKG2A-экспрессирующие клетки, могут ликвидировать опухолевые клетки. Анти-NKG2A антитела также были предложены для использования в лечении аутоиммунных и воспалительных заболеваний (см., например, US20030095965A1, WO2006070286).

Различные антитела против CD94/NKG2A были описаны в этой области. Например, Sivori и др. (Eur J Immunol 1996; 26:2487-92) обращаются к мышиному анти-NKG2A антителу Z270; Carretero и др. (Eur J Immunol 1997; 27:563-7) описывают мышиное aнти-NKG2A антитело Z199 (в настоящее время коммерчески доступное через Coulter, Inc., продукт № IM2750, США); Vance и др. (J Exp Med 1999:190: 1801-12) обращаются к мышиным анти-NKG2-20D5 антителам (в настоящее время коммерчески доступны через BD Biosciences Pharmingen, Catalog No. 550518, USA), а публикация патентной заявки США 20030095965 описывает мышиные антитела 3S9, которые предположительно связываются с NKG2A, NKG2C и NKG2E.

Доступные в настоящее время анти-CD94/NKG2A антитела являются антителами нечеловеческого происхождения, что делает их непригодными для большей части способов терапевтического применения у людей в связи с их иммуногенностью. Хотя доступны простые подходы к гуманизации, такие, например, как CDR-прививка, но, как правило, для получения оптимального гуманизированного варианта необходим индивидуальный подход к гуманизации, уменьшающий иммуногенность, но при этом в достаточной степени сохраняющий или улучшающий функциональные свойства. Соответственно, существует потребность в анти-СВ94/NKG2A антителах, которые подходят для лечения людей.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение предлагает анти-NKG2A антитела, а также композиции, содержащие такие антитела, а также способы получения и использования таких антител. В одном воплощении антитело является гуманизированной версией мышиного анти-NKG2A антитела Z270, обозначенной в данном документе как "humZ270". В другом воплощении антитело является гуманизированной версией анти-NKG2A антитела, имеющей в существенной степени идентичные с Z270 вариабельные домены тяжелых цепей (VH) и/или вариабельные домены легких цепей (VL).

Представлены типичные остатки участков, определяющих комплементарность (CDR), и/или сайты для аминокислотных замен в каркасном участке (framework region, FR) и/или в таких антителах для получения антител с улучшенными свойствами, такими как, например, более низкая иммуногенность, усиленное связывание антигенов или другие функциональные свойства, и/или с улучшенными физико-химическими свойствами, такими как, например, увеличение стабильности. В одном аспекте изобретение предлагает гуманизированные антитела, в которых по меньшей мере часть CDR Кабата идентична соответствующей части человеческой акцепторной последовательности. В одном воплощении человеческая акцепторная каркасная последовательность не включает никаких аминокислотных замен или бэк-мутаций. В другом воплощении человеческая каркасная последовательность включает по меньшей мере одну аминокислотную замену. Позиции по Кабату для таких типичных аминокислотных замен включают 5, 66, 67, 69, 71, 73 и 75 в каркасном участке домена VH, 46 и 48 в каркасном участке домена VL и 60, 63, 64 и 65 в CDR-H2.

В других аспектах изобретение предлагает фармацевтические композиции, содержащие такие антитела и носитель, а также иммуноконъюгаты, содержащие такие антитела, конъюгированные с цитотоксическим или обнаруживаемым агентом.

В других аспектах изобретение предлагает нуклеиновые кислоты и векторы, кодирующие такие антитела, а также принимающие клетки, содержащие такие нуклеиновые кислоты и/или векторы. Также предложены рекомбинантные способы получения анти-NKG2A антител путем культивирования таких принимающих клеток с тем, чтобы продуцировать нуклеиновые кислоты.

В других аспектах изобретение предлагает изделия, содержащие контейнер, содержащий такие анти-NKG2A антитела, и инструкции с руководством пользователя для лечения у пациента заболеваний, таких как рак или вирусные заболевания. Возможно, изделие может содержать другой контейнер, содержащий другой агент, и инструкцию с руководством пользователя для лечения заболевания антителом в сочетании с агентом.

Изобретение также предлагает способы использования таких анти-NKG2A антител в лечении заболеваний, таких как рак, вирусные заболевания, воспалительные или аутоиммунные нарушения у пациента, возможно в сочетании с другим противораковым, противовирусным или противовоспалительным агентом.

ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ

Фиг.1 показывает согласование Z270VL и Z270VH с выбранными зародышевыми V- и J-сегментами и типичными последовательностями humZ270VL1 (SEQ ID NO:4) и humZ270VH1 (SEQ ID NO:5) с нумерацией аминокислотных остатков в соответствии со схемой Кабата (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.). Матричные остатки затенены в схеме Кабата; остатки CDR выделены жирным шрифтом в схеме Кабата; мышиные/зародышевые различия затенены в последовательностях VKI_02/JK4 (SEQ ID NO:9) и VH1_18/JH6 (SEQ ID NO:10); остатки потенциальных бэк-мутаций затенены в последовательностях humZ270VH/VL. Выявленные потенциальные бэк-мутации в VL были L46F и I48V. Выявленные потенциальные бэк-мутации в тяжелой цепи были V5Q, M69L, T71V, Т73К и T75S. Также показаны полученные в результате консенсусные последовательности humZ270VL («humZ270VL1 cons»; SEQ ID NO:6) и humZ270VH1 («humZ270VH1 cons»; SEQ ID NO:7). В humZ270VL1 cons аминокислота в позиции 46 представляет собой L или F, аминокислота в позиции 48 представляет собой I или V. В humZ270VH1 cons аминокислота в позиции 5 представляет собой V или Q; аминокислота в позиции 69 представляет собой М или L; аминокислота в позиции 71 представляет собой Т или V; аминокислота в позиции 73 представляет собой Т или K и/или аминокислота в позиции 75 представляет собой Т или S. В альтернативных humZ270VH1, humZ270VH1 cons2 (SEQ ID NO:8) аминокислота в позиции 5 представляет собой V или Q; аминокислота в позиции 60 представляет собой S или А; аминокислота в позиции 63 представляет собой L или F; аминокислота в позиции 64 представляет собой Q или K; аминокислота в позиции 65 представляет собой G или D; аминокислота в позиции 66 представляет собой R или K; аминокислота в позиции 67 представляет собой V или А; аминокислота в позиции 69 представляет собой М или L; аминокислота в позиции 71 представляет собой Т или V; аминокислота в позиции 73 представляет собой Т или K и/или аминокислота в позиции 75 представляет собой Т или S.

Фиг.2 показывает CDR типичного антитела humZ270 в соответствии с определениями Кабата. Различия при сравнении с мышиными CDRs 2270 выделены жирным шрифтом.

Фиг.3А-Н показывает плазмиды, приведенные в разделе Примеры. (А) pMD19-T векторная карта для клонирования в Т-вектор (ТА cloning). (В) карта клонирующего вектора pJSV002 для транзиентной экспрессии. (С) Легкая цепь, вставленная в pJSV002 с мышиным константным каппа-регионом. (D) Вариант pJSV002-mlgG1, содержащий мышиный константный регион lgG1. (E) pJSV002-mlgG1 Z270 H1, содержащий вариабельный регион тяжелой цепи Z270 и константный регион тяжелой цепи lgG1. (F) pJSV002-hKappa Z270 L11, содержащий вариабельный регион легкой цепи и константный регион человеческой каппа-цепи. (G) pJSV002-lgG4-S241P. (H) pJSV002-lgG4-S241PZ270H1.

Фиг.4 показывает различные последовательности, полученные из Z270, от (А) до (J), SEQ ID NOS:14-23 соответственно, или основанные на них. См. подробности в Примерах 2-5.

Фиг.5 показывает типичный дизайн вектора для экспрессии гуманизированных тяжелых цепей Z270.

Фиг.6 показывает типичный дизайн вектора для экспрессии гуманизированных легких цепей Z270.

Фиг.7 показывает в общих чертах типичное проведение транзиентной экспрессии гуманизированных антител Z270 в клетках НЕК293.

Фиг.8 показывает типичный анализ Biacore для определения humZ270, аффинно связывающегося с антигеном.

Фиг.9 показывает детерминанты аффинности химерного Z270 (А) и humZ270VL1/VH1 (В).

Фиг.10 показывает детерминанту аффинности humZ270VL1/VH1, имеющего различные бэк-мутации в легкой или тяжелой цепях. Химерный Z270 используется для сравнения.

Фиг.11 показывает стратегию стандартной CDR-прививки мышиных CDRs Кабата Н1-Н3 в акцепторный каркас тяжелой цепи VH1_18/JH6, без (humZ270H3) или с (humZ270VH4) бэк-мутациями.

Фиг.12 показывает соответствие между конструкциями humZ270VH в различных человеческих акцепторных последовательностях, все частично с человеческой частью CDR-H2.

Фиг.13 показывает результаты оценки аффинности вариантов humZ270 VL1/VH1 и VH3-VH8 при анализе Biacore, нормализованные по KD hZ270VL1/VH1.

Фиг.14 показывает остатки, выбранные для аланининового сканирующего мутагенеза, чтобы выявить критические остатки рецепторных зон в VL и VH сегментах Z270.

Фиг.15 показывает результаты оценки аффинности Z270VH апаниновых мутантов при анализе Biacore, нормализованные по связыванию химерного Z270.

Фиг.16 показывает результаты оценки аффинности Z270VL аланиновых мутантов при анализе Biacore, нормализованные по связыванию химерного Z270.

Фиг.17 показывает связывание различных рекомбинантных вариантов Z270 с клетками Ba/F3 со стабильной сверхэкспрессией или CD94/NKG2A, или CD94/NKG2C, выявленное путем проточной цитометрии.

Фиг.18 показывает результаты анализа оценки способности рекомбинантного Z270, химерного Z270, humZ270VL1/VH1 и Z199 к индуцированию уничтожения ⁵¹Cr-меченых LCL 721221-Cw3 клеток CD94/NKG2A+NKL-клетками, свидетельствующие, что humZ270VL1/VH1 более эффективен в индукции уничтожения.

Фиг.19 показывает, что humZ270VL1/VH1 эффективно связывается с Ba/F3-CD94/NKG2A клетками в зависимости от концентрации (ромбы). Однако после предварительной инкубации клеток с HLA-E тетрамерами связывание humZ270VL1/VH1 с Ba/F3-CD94/NKG2A клетками было предотвращено (квадраты).

Фиг.20 показывает, что два различных препарата humZ270VL1/VH1 и варианта humZ270 с V5Q мутацией в VH связываются с CD94/NKG2A-, но не CD94/NKG2C-экспрессирующими клетками, хотя VSQ-вариант чуть менее эффективно.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термин "антитело" используется в данном документе в самом широком смысле и конкретно включает в себя моноклональные антитела полной длины, поликлональные антитела, полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), а также фрагменты антител до тех пор, пока они проявляют требуемую биологическую активность. Представлены различные методики, имеющие отношение к получению антител, например, Harlow и др., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988).

"Фрагмент антитела" включает в себя часть антитела полной длины, предпочтительно его антиген-связывающие или вариабельные участки. Примеры фрагментов антитела включают Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂, F(ab)₃, Fv (как правило, VL и VH домены из одной ветви антитела), одноцепочечные Fv (scFv), dsFv, Fd фрагменты (как правило, VH и СН1 домен) и dAb фрагменты (как правило, VH домен); VH, VL, VhH и V-NAR домены; миниантитела, би-, трех-, четырехвалентные антитела и каппа-антитела (см., например, III et al., Protein Eng 1997; 10: 949-57); верблюжий IgG; IgNAR и полиспецифичные фрагменты антитела, сформированные из фрагментов антитела, а также один или более изолированных CDRs или функциональную рецепторную зону, где изолированные CDRs или антиген-связывающие остатки или полипептиды могут быть ассоциированы или связаны друг с другом с тем, чтобы сформировать функциональный фрагмент антитела. Различные типы фрагментов антитела были описаны и рассмотрены, например, в Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;23, 1126-1136; WO2005040219, и опубликованных патентных заявках США 20050238646 и 20020161201.

Термин "производное антитела" в значении, в котором он используется в данном документе, включает в себя антитело полной длины или фрагмент антитела, предпочтительно содержащий по меньшей мере его антиген-связывающий или вариабельный регионы, где одна или более аминокислот химически модифицированы, например, путем алкилирования, ПЭГилирования, ацилирования, формирования эфира или амида или, например, путем связывания антитела со второй молекулой. Он включает ПЭГилированные антитела, цистеин-ПЭГилированные антитела, а также их варианты, но не ограничивается ими.

"Иммуноконъюгат" включает производное антитела, ассоциированное или связанное со вторым агентом, таким как цитотоксический агент, обнаруживаемый агент и т.д.

"Гуманизированное" антитело является человеческим/нечеловеческим химерным антителом, которое содержит минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого иммуноглобулина. По большей части гуманизированные антитела являются иммуноглобулинами (реципиентными антителами), в которых остатки из гипервариабельного региона реципиента заменяются остатками из гипервариабельного региона нечеловеческих видов (донорского антитела), например, мыши, крысы, кролика или примата, не являющегося человеком, с необходимой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасного участка (framework region, FR) человеческого иммуноглобулина заменяются соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не были найдены в реципиентном или донорском антителе. Эти модификации производятся в целях дальнейшего улучшения показателей антитела. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по существу весь, по меньшей мере один или, как правило, два вариабельных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют этим нечеловеческим иммуноглобулинам, и все или по существу все остатки FR являются теми же последовательностями человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело, возможно, может также включать по меньшей мере часть константного участка (Fc) иммуноглобулина, как правило, человеческого. Для получения более подробной информации см., например, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), WO 92/02190, патентную заявку США 20060073137 и патенты США 6750325, 6632927, 6639055, 6548640, 6407213, 6180370, 6054297, 5929212, 5895205, 5886152, 5877293, 5869619, 5821337, 5821123, 5770196, 5777085, 5766886, 5714350, 5693762, 5693761, 5530101, 5585089 и 5225539.

Термин "гипервариабельный участок" в значении, в котором он используется в данном документе, относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок обычно содержит аминокислотные остатки из "участков, определяющих комплементарность", или "CDR" (остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al. 1991, см. выше) и/или такие же остатки из "гипервариабельных петель" (остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987:196:901-917). Как правило, нумерация аминокислотных остатков в этом участке производится способом, описанным Кабатом и др., см. выше. Такие фразы, как "позиция Кабата", "используя нумерацию Кабата", "нумерация остатков вариабельного домена по Кабату" и "по Кабату", используемые в данном документе, ссылаются на эту систему нумерации для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи. При использовании системы нумерации Кабата фактическая линейная последовательность аминокислот в пептиде может содержать меньше аминокислот, что укорачивает FR или CDR вариабельного домена, а может содержать дополнительные аминокислоты, вставленные в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать одиночную аминокислотную вставку (остаток 52А по Кабату) после остатка 52 в CDR H2, а также вставленные остатки (например, остатки 82а, 82b, 82с и т.д. по Кабату) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Кабату может быть определена для данного антитела путем согласования регионов гомологичных последовательностей антител со "стандартной", нумерованной по Кабату последовательностью. Позиции всех аминокислотных остатков в VL или VH последовательностях, описанных в данном документе, даны по Кабату, если нет иного указания или противоречия контексту.

Остатки "каркасного участка", или "FR", представляют собой VH или VL остатки помимо остатков CDRs, как они здесь определены.

"Вариант" полипептида относится к полипептиду с аминокислотной последовательностью, которая в существенной степени идентична указанному (эталонному) полипептиду, как правило, нативному или "родительскому". Вариант полипептида может иметь одну или более аминокислотных замен, делеций и/или вставок в определенных позициях в нативной аминокислотной последовательности.

"Консервативными" аминокислотными заменами являются те замены, в которых аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь со сходными физико-химическими свойствами. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, известны в данной области и включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Термин "в существенной степени идентичны" в контексте двух аминокислотных последовательностей означает, что последовательности при оптимальном совмещении, например, с помощью программ Gap и BestFit, использующих по умолчанию разницу в весе, имеют по меньшей мере примерно 50, по меньшей мере примерно 60, по меньшей мере примерно 70, по меньшей мере примерно 80, по меньшей мере примерно 90, по меньшей мере примерно 95, по меньшей мере примерно 98 или по меньшей мере примерно 99 процентов идентичной последовательности. В одном воплощении позиции остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Идентичность последовательностей, как правило, измеряется с помощью программного анализа последовательностей. Белковый программный анализ подбирает одинаковые последовательности, используя оценку установленного сходства по различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные аминокислотные замены. Например, публично доступное программное обеспечение GCG содержит программы, такие как "Gap" и "BestFit", которые могут быть использованы с параметрами по умолчанию для определения гомологии и идентичности последовательностей тесно связанных полипептидов, таких как гомологичные полипептиды организмов разных видов или белок дикого типа и его мутированная форма. См., например, GCG версии 6.1. Полипептидные последовательности также могут быть сравнены с помощью FASTA или ClustalW с применением параметров по умолчанию или рекомендованных параметров. Программа FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) в GCG версии 6.1. предоставляет совмещение и процентную идентичность последовательностей в регионах лучшего совпадения запрашиваемой и исследуемой последовательностей (Pearson, Methods Enzymol. 1990:183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000:132:185-219). Другим предпочтительным алгоритмом при сравнении последовательности с базой данных, содержащей большое число последовательностей различных организмов, или выведенных последовательностей является компьютерная программа BLAST, особенно blastp, использующая параметры по умолчанию. См., например, Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990:215:403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997:25:3389-402 (1997); все включены сюда путем ссылки. "Соответствующими" аминокислотными позициями в двух в существенной степени идентичных аминокислотных последовательностях являются те позиции, которые выровнены с помощью какого-либо белкового программного анализа, описанного здесь, как правило, с использованием параметров по умолчанию.

Антитело с "биологической характеристикой" эталонного антитела (например, Z270) обладает одной или более биологическими характеристиками этого антитела, которые отличают его от других антител, связывающихся с тем же антигеном (например, NKG2A). Например, антитело с биологической характеристикой Z270 может блокировать активацию NKG2A и/или перекрестно конкурировать с Z270 в связывании с внеклеточным доменом NKG2A.

NKG2A (OMIM 161555, полное раскрытие которого включено сюда путем ссылки) является членом группы транскриптов NKG2 (Houchins, et al. (1991) J. Exp.Med. 173:1017-1020). NKG2A кодируется 7 экзонами, охватывающими 25 т.н., с возможностью альтернативного сплайсинга. NKG2A является ингибиторным рецептором, находящимся на поверхности субпопуляции НК клеток, α/β Т-клеток, γ/δ Т-клеток и НКТ-клеток. Как ингибиторные KIR рецепторы, он имеет ITIM (иммунорецепторный основанный на тирозине ингибиторный мотив) в цитоплазматическом домене. Используемый в данном документе термин "NKG2A" относится к любому варианту, производному или изоформе гена NKG2A или закодированного им белка. Он также включает любые последовательности нуклеиновых кислот или белковые последовательности, имеющие одно или более биологических свойств и функций, общих с NKG2A дикого типа, NKG2A полной длины, а также имеющие нуклеотидную или аминокислотную идентичность не менее 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. Человеческий NKG2A содержит 233 аминокислоты в 3 доменах: цитоплазматическом домене, содержащем остатки 1-70, трансмембранном регионе, содержащем остатки 71-93, и внеклеточном регионе, содержащем остатки 94-233, в следующей последовательности:

MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASWTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL (SEQ ID NO:11)

NKG2C (OMIM 602891, полное раскрытие которого включено сюда путем ссылки) и NKG2E (OMIM 602892, полное раскрытие которого включено сюда путем ссылки) являются двумя другими членами группы транскриптов NKG2 (Gilenke, et al. (1998) Immunogenetics 48:163-173). NKG2C и NKG2E являются активирующими рецепторами, находящимися на поверхности НК-клеток.

HLA-E (OMIM 143010, полное раскрытие которого включено сюда путем ссылки) является неклассической молекулой МНС, которая экспрессируется на клеточной поверхности и регулируется путем связывания с пептидами, образованными из сигнальных последовательностей других молекул МНС I класса.

HLA-E связывается с натуральными киллерами (НК-клетками) и некоторыми Т-клетками, специфично связываясь с CD94/NKG2A, CD94/NKG2B и CD94/NKG2C (см., например, Braud et al. (1998). Nature 391:795-799, полное раскрытие которого включено сюда путем ссылки). Поверхностной экспрессии HLA-E достаточно, чтобы защитить клетки-мишени от лизиса клетками CD94/NKG2A+клональными НК-, Т- или НКТ-клетками. Используемый здесь термин "HLA-E" относится к любому варианту, производному или изоформе гена HLA-E или закодированного им белка. Он также включает любые последовательности нуклеиновых кислот или белковые последовательности, имеющие одно или более биологических свойств и функций, общих с HLA-E дикого типа, HLA-E полной длины, и имеющие нуклеотидную или аминокислотную идентичность не менее 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более.

Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК предпоследовательности или секреторного лидерного пептида функционально связана с ДНК полипептида, если он экспрессируется как препротеин, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если она затрагивает транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если она расположена так, чтобы облегчить трансляцию. Как правило, "функциональная связь" означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными и, в случае секреторного лидерного пептида, непрерывны и в фазе считывания. Вместе с тем, энхансеры не должны быть смежными. Связывание достигается путем лигирования в удобных рестрикционных сайтах. Если таких сайтов нет, то в соответствии с обычной практикой используются синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.

"Изолированная" молекула представляет собой молекулу, которая в композиции, в которой она находится, является преобладающей разновидностью по отношению к молекулам, к классу которых она принадлежит (например, она составляет по меньшей мере примерно 50% от всех типов молекул в композиции и, как правило, будет составлять по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или более из разновидностей молекул, например, пептидов). Как правило, гомогенность молекул антитела композиции среди молекул антител будет составлять 98%, 98% или 99% в контексте всех присутствующих в композиции видов пептидов или по меньшей мере в связи с существенно активными видами пептидов в контексте предлагаемого использования.

В контексте данного изобретения "лечение" означает предотвращение, облегчение, управление, удаление или уменьшения одного или более симптомов или соответствующих клинических проявлений болезни или нарушения, если это не противоречит контексту. Например, "лечение" пациента, у которого не были выявлены симптомы или соответствующие клинические проявления болезни или нарушения, является превентивной или профилактической терапией, в то время как "лечение" пациента, у которого были определены симптомы заболевания или соответствующие клинические проявления болезни или нарушения, обычно не является превентивной или профилактической терапией.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение касается антител, связывающихся с NKG2A. В одном аспекте антитело представляет собой гуманизированную версию антитела Z270, которое является мышиным моноклональным антителом, специфично связывающимся с NKG2A, но не с человеческими NKG2C и NKG2E. Z270 может блокировать функцию человеческого CD94/NKG2A и специфично индуцировать уничтожение клеток CD94/NKG2A-несущими лимфоцитами в зависимости от концентрации.

Изобретение предлагает, например, варианты humZ270, в которых по меньшей мере часть VH CDR, такая как CDR-H2, идентична соответствующей части человеческой VH акцепторной последовательности, что позволяет снизить иммуногенность гуманизированного антитела. Удивительно, что такие гуманизированные варианты могут быть более эффективны в потенциировании цитотоксичности CD94/NKG2A-экспрессирующих цитотоксических лимфоцитов, чем мышиные или химерные формы Z270. В других аспектах изобретение предлагает антитела, имеющие CDRs, содержащие определенные антиген-связывающие остатки, соответствующие таким же остаткам в мышином антителе Z270, и человеческие последовательности каркасного участка. Эти и другие аспекты более подробно описаны в следующих разделах и разделе Примеры.

Гуманизированные анти-NKG2A антитела

В уровне техники описан ряд способов гуманизации нечеловеских антител. Как правило, в процессе гуманизации нуклеотиды, кодирующие регионы взаимодействия мышиного антитела, могут быть клонированы в кДНК-вектор, кодирующий человеческий IgG, который может быть сделан таким образом, чтобы вырабатывалось химерное антитело, состоящее главным образом из человеческого IgG, несущего мышиные CDRs. Такие химерные антитела могут иметь пониженную аффинность, пониженную стабильность или другие нежелательные особенности в сравнении с оригинальным мышиным антителом, а также могут быть иммуногенными. Таким образом, возможно, отдельные аминокислоты в химерном антителе необходимо будет оптимизировать для получения функционального моноклонального антитела высокого качества для терапевтических применений у людей.

Как правило, гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков, введенных в него из источника, который не является человеком. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки часто называют "импортными" остатками, которые, как правило, взяты из "импортного" вариабельного домена. Гуманизация может быть выполнена при помощи способа Winter и сотрудников (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), путем замены последовательностей гипервариабельного региона на соответствующие последовательности человеческого "акцепторного" антитела. Соответственно, такие "гуманизированные" антитела являются химерными антителами (патент США №4816567), в которых существенно меньшая часть, чем интактный человеческий вариабельный домен, заменена на соответствующую последовательность от нечеловеческих видов. На практике гуманизированные антитела, как правило, представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки гипервариабельного региона и, возможно, некоторые остатки FR заменены на остатки аналогичных сайтов антител грызунов.

Другой способ получения гуманизированных антител описан в публикации патентной заявки США 2003/0017534, где гуманизированные антитела и препараты антител получают с помощью трансгенных животных, не являющихся человеком. С помощью генной инженерии получают животных, не являющихся человеком, содержащих один или более гуманизированных иммуноглобулиновых локусов, которые способны проходить генную перегруппировку и генную конверсию в трансгенных животных, не являющихся человеком, чтобы продуцировать разнообразные гуманизированные иммуноглобулины.

Выбор обоих человеческих вариабельных доменов, и легкого, и тяжелого, которые будут использоваться в производстве гуманизированных антител, имеет очень важное значение для уменьшения антигенности. Согласно так называемому "best-fit" (наиболее подходящему) способу, последовательность вариабельного домена антитела грызунов просматривается в библиотеке известных человеческих последовательностей вариабельного домена или в библиотеке человеческих зародышевых последовательностей. Человеческая последовательность, наиболее близкая к последовательности грызуна, может быть принята в качестве человеческого каркасного участка для гуманизированного антитела (Sims et al., J. Immunol. 1993:151:2296 et seq.; Chothia et al., Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196:901-917). Другой способ использует особенности каркасного участка, полученного из консенсусной последовательности всех человеческих антител, в частности, подгруппы легких или тяжелых цепей. Тот же каркасный участок может быть использован для нескольких различных гуманизированных антител (Carter et al., PNAS USA, 1992:89:4285 et seq.; Presta et al., J Immunol 1993:151:2623 et seq.). Другие способы, направленные на снижение иммуногенности молекул антител у пациента, являющегося человеком, включают "шпон" антител (см., например, патент США 6797492 и публикации патентных заявок США 20020034765 и 20040253645) и модификацию антител путем анализа Т-клеточных эпитопов и их удаления (см., например, публикацию патентной заявки США 20030153043 и патент США №5712120).

Кроме того, важно, чтобы антитела были гуманизированы с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических свойств. Для достижения этой цели в соответствии с предпочтительным способом гуманизированные антитела получают в процессе анализа родительских последовательностей и различных эскизных гуманизированных продуктов, проводимого с использованием трехмерных моделей родительских и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулинов, как правило, доступны и известны специалистам в данной области. Имеются компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных, кандидатных иммуноглобулиновых последовательностей. Исследование этих изображений позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании кандидатной иммуноглобулиновой последовательности, т.е. проводится анализ остатков, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связать свой антиген. Таким образом, остатки FR могут быть выбраны из реципиентых и импортных последовательностей и комбинированы для достижения желаемой характеристики антитела, такой как повышенная аффинность к целевому антигену(ам). Обычно остатки гипервариабельного региона непосредственно и наиболее существенно вовлечены в связывание оказывающего влияние антигена.

Пример 1, приведенный ниже, описывает конструирование типичных гуманизированных анти-NKG2A антител, которые связываются с NKG2A, а на Фиг.1 по меньшей мере частично показан анализ. Как показано на Фиг.1, в одном антителе humZ270 изобретения С-концевая часть CDR-H2 (соответствующая по Кабату остаткам 61-65) идентична соответствующей части человеческой акцепторной последовательности. Кроме того, как указано на Фиг., последовательность humZ270VL (SEQ ID NO:4), возможно, может включать мутации в одном или обоих из указанных остатков FR L46 и 148, а последовательность humZ270VH (SEQ ID NO:5), возможно, может включать мутации в одном или более из указанных остатков FR V5, М69, Т71, Т73 и Т75 с аминокислотой нумерацией по Кабату. Таблица 1 описывает типичные варианты humZ270VL и humZ270VH, содержащие типичные человеческо-мышиные бэк-мутации в последовательностях FR humZ270VH и humZ270VL, а также типичные комбинации FR мутаций. В Таблице 1 и в других, имеющихся в данном документе, аминокислотные позиции обозначаются по Кабату, где аминокислоты V5, М69, Т71, Т73 и Т75 в домене humZ270VH соответствуют аминокислотам V5, М70, Т72, Т74 и Т76 в SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 или других типичных последовательностях humZ270VH, описанных в данном документе.

Соответственно, данное изобретение предлагает гуманизированные версии анти-NKG2A антитела, полученные с помощью гибридомы Z270, а также гуманизированные версии нечеловеческих антител с измененными биологическими характеристиками и/или существенной идентичностью последовательности с Z270. В другом воплощении моноклональное антитело или его фрагмент или производное способно к связыванию с нечеловеческим NKG2A, полученным от примата.

Гуманизированное антитело в данном случае включает нечеловеческий гипервариабельный участок или CDR остатки, вставленные в человеческие домены VH и VL.

В одном аспекте изобретение предлагает гуманизированное антитело, содержащее антиген-связывающие остатки из CDRs мышиных антител Z270 в человеческом акцепторном каркасе, где по меньшей мере шесть С-концевых аминокислотных остатков CDR-H2 являются такими же, как и в человеческой акцепторной последовательности. Такие гуманизированные антитела могут быть более эффективны, чем оригинальное мышиное антитело Z270 или его химерная версия, например, они могут усиливать цитотоксическую активность CD94/NKG2A-экспрессирующего цитотоксического лимфоцита, например, такого как НК-клетка, НКТ-клетка, α/β Т-клетка и/или γ/δ Т-клетка, или популяции CD94/NKG2A-экспрессирующих цитотоксических лимфоцитов.

Типичные антитела изобретения включают антиген-связывающие остатки, соответствующие или являющиеся частью CDR-H2 и CDR-H3 Z270: D52, D54, R94, F99, Т(100C) и W(100F) из SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:5, которые были показаны в разделе Примеры, будучи важными для связывания антигена. Возможно, антитела также могут содержать VH остатки N35, Y53, Е56, D98, V(100A) и L(100D).

В другом аспекте гуманизированное антитело содержит последовательность CDR-H1, соответствующую остаткам 31-35 из SEQ ID NO:5, и последовательность CDR-H3, соответствующую остаткам 95-102 из SEQ ID NO:5, где CDR-H2 последовательность включает остатки 50-59 из SEQ ID NO:5. В таких гуманизированных антителах регион VH может быть идентичен последовательности SEQ ID NO:5, например, на 50% или более, например, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70% или по меньшей мере на 75%. Типичные гуманизированные VH домены, имеющие такие последовательности, описаны среди примеров и ниже.

В одном воплощении в таких гуманизированных антителах аминокислота в позиции 5 региона VH может быть V или Q; аминокислота в позиции 69 региона VH может быть М и L; аминокислота в позиции 71 региона VH может быть Т или V; аминокислота в позиции 73 региона VH может быть Т или K и/или аминокислота в позиции 75 региона