Новые гидрогеназы, выделенные из thermococcus spp., гены, кодирующие эти гидрогеназы, и способы продуцирования водорода с использованием микроорганизмов, содержащих указанные гены

Новые гидрогеназы, выделенные из thermococcus spp., гены, кодирующие эти гидрогеназы, и способы продуцирования водорода с использованием микроорганизмов, содержащих указанные гены

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки создания изобретения

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым гидрогеназам, выделенным из новых штаммов, принадлежащих к роду Thermococcus; к генам, кодирующим указанные гидрогеназы; и к способам получения водорода с использованием штаммов, имеющих указанные гены.

Предшествующий уровень техники

Энергетическая ценность водорода привлекает внимание специалистов как источник энергии нового поколения, который может заменить ископаемое топливо, поскольку его теплотворная способность на единицу массы по меньшей мере в три раза превышает теплотворную способность нефтяного топлива, но при этом указанное топливо не выделяет веществ, которые могут оказывать негативное воздействие на окружающую среду, например, таких как двуокись углерода, NOx и SOx.

Традиционные способы получения водорода включают электролиз воды и термокрекинг или конверсию природного газа или сырой нефти (лигроина) с водяным паром. Однако осуществление этих способов сталкивается с определенными проблемами, заключающимися в том, что обработка ископаемого топлива должна проводиться при высоких температурах и высоком давлении. Кроме того, при осуществлении этих методов образуются смешанные газы, содержащие монооксид углерода, что требует применения сложных технологий по удалению монооксида углерода из смешанных газов.

С другой стороны, биологические способы получения водорода с использованием микроорганизмов имеют преимущества, заключающиеся в том, что они могут быть осуществлены в условиях, не требующих высоких температур и высокого давления, путем подведения отдельной энергии, а также в том, что вырабатываемые при этом газы не содержат монооксида углерода. Такие биологические способы получения водорода могут быть грубо разделены на способы на основе фотосинтезирующих микроорганизмов и способы на основе нефотосинтезирующих микроорганизмов (главным образом, анаэробных микроорганизмов). Примеры вышеупомянутых способов включают способ, описанный в Корейском патенте рег. No. 10-0680624, озаглавленном «Способ получения водорода с использованием фотосинтезирующих бактерий штамма Rhodobacter sphaeroides, обладающего высокой продуктивностью водорода при высокой концентрации соли».

Однако технология культивирования фотосинтезирующих бактерий при высокой концентрации соли с использованием света в качестве источника энергии пока еще недостаточно разработана, и используемые ранее фотосинтезирующие бактерии имеют тот недостаток, что в них ингибирование субстрата затрудняется при высоком парциальном давлении субстрата. Кроме того, указанные бактерии имеют тот недостаток, что их способность продуцировать водород может поддерживаться только под действием света.

Поэтому до сих пор продолжают предприниматься попытки разработать способ получения водорода с использованием микроорганизмов, которые могут продуцировать водород, используя органический углерод, и примеры таких способов описаны в Корейском патенте рег. No. 10-0315663, озаглавленном «Citrobacter sp. Y19 и получение водорода с использованием этого микроорганизма», и в Корейском патенте рег. No. 10-0315662, озаглавленном «Rhodopseduomonas palustris P4 и получение водорода с использованием этого микроорганизма».

Ранее, то есть 5 сентября 2008 года, авторами настоящего изобретения была подана патентная заявка (заявка на патент Кореи рег. No. 10-2008-0087794), относящаяся к новым белкам, выделенным из новых гипертермофильных Thermococcus onnurineus NA1 (рег. №: КСТС 10859ВР), и к генам, кодирующим такие белки, и настоящее изобретение, в частности, относится к тем генам и белкам из числа уже описанных в настоящей заявке, которые связаны с продуцированием водорода. Авторами настоящего изобретения были проведены эксперименты по оценке способности вышеописанного штамма продуцировать водород, и в результате этих экспериментов было обнаружено, что вышеуказанный штамм продуцирует большое количество водорода даже в условиях высоких температур и, кроме того, были обнаружены новые гидрогеназы, которые в высокой степени экспрессируются, в частности, в условиях культивирования с добавлением монооксида углерода (СО) или формиата, что послужило основой для создания настоящего изобретения.

ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является получение гидрогеназ, выделеных из гипертермофильных микроорганизмов Thermococcus spp., которые могут продуцировать водород даже в условиях высоких температур, и генов, кодирующих указанные гидрогеназы, а также разработка эффективных способов получения водорода с использованием штаммов, имеющих указанные гены.

Для достижения этих целей было разработано настоящее изобретение, которое относится к гидрогеназам, выделенным из штамма Thermococcus spp., способного продуцировать водород в аэробных условиях культивирования, и к генам, кодирующим указанные гидрогеназы. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения водорода путем культивирования указанного штамма и к способу получения водорода с использованием указанных генов.

В первом аспекте, настоящее изобретение относится к гидрогеназам, продуцируемым новым гипертермофильным штаммом Thermococcus onnurineus NA1 (рег. №: KCTC 10859BP). T. onnurineus NA1 имеет восемь новых кластеров генов гидрогеназы, и аминокислотные последовательности гидрогеназ, принадлежащих этим кластерам, представлены в SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 8.

Во втором аспекте, настоящее изобретение относится к генам, кодирующим указанные аминокислотные последовательности. Такими генами, предпочтительно, являются, но не ограничиваются ими, гены, представленные в SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19 (аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 8 соответствуют генам, представленным в SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19, соответственно).

В третьем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения водорода путем культивирования Thermococcus spp. Этот способ включает стадии: 1) приготовления среды в сосуде для культивирования; 2) культивирование Thermococcus spp. в сосуде для культивирования; 3) извлечения водорода из сосуда для культивирования. Микроорганизмом Thermococcus spp., предпочтительно, является Thermococcus onnurineus NA1 (рег. №: КСТС 10859ВР).

Кроме того, указанной средой может быть среда, в которую были добавлены один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из монооксида углерода, формиата и крахмала. Культивирование может быть осуществлено при высокой температуре 80°С в анаэробных условиях.

В четвертом аспекте, настоящее изобретение относится к дегидрогеназе, содержащей по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 11.

В пятом аспекте, настоящее изобретение относится к гену, кодирующему дегидрогеназу. Предпочтительно, указанный ген имеет последовательность оснований, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 20 - SEQ ID NO: 22 (аминокислоты SEQ ID NO: 9-11 соответствуют SEQ ID NO: 20-22, соответственно).

В шестом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в гидрогеназные кластеры CODH-MCH-MNH3 в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительно гены включают, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO: 21 (CODH-дегидрогеназы) и SEQ ID NO: 16 (MCH-гидрогеназы). Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной рекомбинантным вектором.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения водорода с использованием указанного трансформанта, включающему стадии: приготовления среды в сосуде для культивирования; подачи монооксида углерода в газовую фазу, присутствующую в сосуде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

В седьмом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в гидрогеназный кластер FDH2-MFH2-MNH2 в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительно гены включают, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO:22 (FDH2-дегидрогеназы) и SEQ ID NO:18 (MFH2-гидрогеназы). Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной рекомбинантным вектором.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения водорода с использованием указанного трансформанта, включающему стадии: приготовления, содержащей формиат среды в сосуде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

В восьмом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в гидрогеназный кластер FDH1-MFH1-MNH1 в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительно гены включают, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO:20 (FDH1-дегидрогеназы) и SEQ ID NO:13 (MFH1-гидрогеназы). Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированной рекомбинантным вектором.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения водорода с использованием указанного трансформанта, включающему стадии: приготовления содержащей крахмал среды в сосуде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

Способы получения водорода, в отличие от применяемых ранее химических способов получения водорода, имеют те преимущества, что они не требуют создания специальных условий, а именно высоких температур и высокого давления, и позволяют получать водород при температуре окружающей среды и при атмосферном давлении, а также не приводят к образованию вредных побочных продуктов. Кроме того, способы согласно изобретению имеют то преимущество, что, в отличие от известных способов получения водорода с использованием микроорганизмов, они являются гораздо более эффективными и позволяют получать водород высокой чистоты даже при высокой температуре.

Поэтому настоящее изобретение является экономически выгодным, поскольку оно позволяет исключить монооксид углерода при высокой температуре в процессе очистки нефти и т.п. и может быть непосредственно использовано для получения водорода без проведения отдельной стадии охлаждения после поглощения монооксида углерода. Кроме того, настоящее изобретение может быть использовано для кондиционирования воздуха.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

На фиг.1 представлена диаграмма Венна, иллюстрирующая общие и уникальные части протеома (совокупоности белков) четырех штаммов Thermococcales, T. onnurineus NA1 (NA1), T. kodakaraensis, P. furiosus и P. abyssi. Набор белков для этих штаммов был взят из коллекции RefSeq в NCBI.

На фиг.2A представлена репрезентативная карта восьми кластеров генов гидрогеназы в T. onnurineus NA1. А, В, С и D: мембраносвязанные гидрогеназы и цитоплазматические NiFe-гидрогеназы. S1, S2 и S3: T. onnurineus NA1. Гены были окрашены в соответствии с функциональными категориями COG. TON_0051-0055 представляют собой SEQ ID NO: 1-5; TON_0486-0498 представляют собой SEQ ID NO: 35-47; TON_0533-0544 представляют собой SEQ ID NO: 48-59; TON_1583-1595 представляют собой SEQ ID NO: 100-112; TON_0261-0289 представляют собой SEQ ID NO: 6-34; TON_1016-1031 представляют собой SEQ ID NO: 60-75; а TON_1559-1582 представляют собой SEQ ID NO: 76-99.

На фиг.2B представлена организация генов из трех кластеров генов гидрогеназ (fdh1-mfh1-mnh1, fdh2-mfh2-mnh2 и codh-mch-mnh), имеющих 3-модульный генный кластер в геноме T. onnurineus NA1. Гены, принадлежащие к тем же самым субкластерам, показаны одним и тем же цветом.

На фиг.3 показаны паттерны распределения и консервативности кластеров генов гидрогеназы в 31 архегеноме. В синие скобки (первая скобка, третья скобка, пятая скобка снизу) заключены CDS, обнаруживающие низкое сходство (<25%) с любыми CDS из 31 архегенома. В черных скобках показаны CDS, аналогичные гидрогеназе 4 от P. abyssi. 31 археген представлен ниже:

№.	Ген	№	Ген
1	Aeropyrum_pernix	17	Pyrococcus_abyssi
2	Pyrobaculum_aerophilum	18	Pyrococcus_furiosus
3	Sulfolobus_acidocaldarius_DSM_639	19	Pyrococcus_horikoshii
4	Sulfolobus_solfataricus	20	Thermococcus_kodakaraensis_KOD1
5	Sulfolobus_tokodaii	21	Archaeogiobus_fulgidus
6	Haloarcula_marismortui_ATCC_43049	22	Methanosarcina_barkeri_fusaro
7	Natronomonas_pharaonis	23	Methanosarcina_mazei
8	Halobacterium_sp	24	Metnanosarcina_acetivorans
9	Haloquadratum_walsbyi	25	Methanospirillum_hungatei_JF-1
10	Methanococcoides_burtonii_DSM_6242	26	Methanobacterium_thermoautotrophicum
11	Picrophilus_torridus_DSM_9790	27	Methanococcus_jannaschii
12	Thermoplasma_acidophilum	28	Methanococcus_maripaludis_S2
13	Thermoplasma_volcanium	29	Methanosphaera_stadtmanae
14	Methanosaeta_thermophila_PT	30	Methanopyrus_kandleri
15	Pyrobaculum_islandicum DSM_4184	31	Nanoarchaeum_equitans
16	Thermofilum_pendens_Hrk_5

На фиг.4 и 5 проиллюстрировано сравнение α-субъединиц CODH- и F420-гидрогеназных белков. На фиг.4 представлено филогенетическое дерево CODH, а на фиг.5 представлено филогенетическое дерево α-субъединицы F420-гидрогеназы. Гомологи белков на филогенетическом дереве были взяты из базы данных NCBI.

На фиг.6 показан график роста T. onnurineus NA1 в зависимости от CO. T. onnurineus NA1 культивировали в среде 1, в которую были добавлены CO (дорожка 2; треугольники), сера (3; квадраты) или то и другое (дорожка 4; перевернутые треугольники). Были включены контроли без добавок (дорожка 1; кружки) и культура в среде YPS (C). DAPI-окрашенные клетки были непосредственно подсчитаны на фильтрах под флуоресцентным микроскопом. a: Влияние состава среды при различных концентрациях дрожжевого экстракта (YE). b: Кривые роста Т. onnurineus NA1 в среде 1 с другими добавками. c: Анализ транскрипции гена CODH.

На фиг.7 проиллюстрирован рост микроорганизма T. onnurineus NA1 и продуцирование водорода указанным микроорганизмом в YPS (A) или в CO-содержащей среде. Незаштрихованные кружки: рост; и заштрихованные кружки: продуцирование водорода.

На фиг.8 проиллюстрирован анализ, проводимый с использованием микромассивов (microarray) (A), и ОТ-ПЦР-анализ (B) экспрессии кластеров генов гидрогеназы T. onnurineus NA1 в YPS (A) или в CO-содержащей среде (B). На фиг.8 (A) проиллюстрирован анализ восьми кластеров генов гидрогеназы в T. onnurineus NA1, проводимый с использованием микромассивов. Изменения в иерархической кластеризации мРНК в присутствии CO сравнивали с кластеризацией в культуральной среде YPS, используемой в качестве контроля. Стимуляция и ингибирование показаны красным и зеленым цветом, соответственно. Условия роста показаны в верхней части картины кластеризации. На правой стороне картины кластеризации, ОРС для каждого из codh-mch-mnh3, fdhl-mfhl-mnhl или fdh2-mfh2-mnh2 показаны в виде горизонтальных полос. YE: дрожжевой экстракт. На фиг.8 (B) представлены результаты количественного ОТ-ПЦР-анализа в присутствии CO или YPS, проводимого для каждой из крупных субъединиц гидрогеназ mbh (TON_1593), mbx (TON 0489), frh (TON_1560), sulf I (TON_0534), mch (TON_1023), mfh2 (TON_1569) и mfhl (TON_0276). Ген, кодирующий шаперонин (cha), использовали в качестве контроля для нормализации уровней экспрессии.

На фиг.9 представлено нарушение гена-мишени крупной субъединицы каждой из гидрогеназ mch (TON_1023) и mfh2 (TON_1569). На фиг.9 (A) представлена организация гена каждого из кластеров codh-mch-mnh3 и fdh2-mfh2-mnh2 в T. onnurineus NA1. P_gdh: промоторная область, расположенная слева (выше) от 5'-конца гена глутамат-дегидрогеназы T. kodakaraensis KOD1; и hmg_Pfu: ген 3-гидрокси-метилглутарил-кофермент A-редуктазы Pyrococcus furiosus. На фиг.8(B) проиллюстрирована идентификация нарушения гена с помощью ПЦР. На левой панели проиллюстрирована ПЦР-амплификация с использованием праймеров для области кассеты сверхэкспрессии (P_gdh-hmg_Pfu). На правой панели проиллюстрирована ПЦР-амплификация с использованием праймеров для крупной субъединицы каждой из гидрогеназ mch _TNA1 и mfh2 _TNA1. M: маркер размера (l т.п.н.-лэддер); W: дикого типа; дорожки 1 и 2: мутантные штаммы.

На фиг.10 проиллюстрирован рост мутантных штаммов ^Δ mch _TNA1 и ^Δ mfh2 _TNA1 и продуцирование ими водорода в среде, содержащей YPS или CO. Незаштрихованные кружки: рост; заштрихованные кружки: продуцирование водорода.

На фиг.11 проиллюстрирован рост T. onnurineus NA1 и продуцирование им водорода в среде, содержащей YPS (А) или формиат (В). Незаштрихованные кружки: рост; заштрихованные кружки: продуцирование водорода.

На фиг.12 проиллюстрирован анализ, проводимый с использованием микромассивов (A) и ОТ-ПЦР-анализ (B) экспрессии кластеров гидрогеназы T. onnurineus NA1 в среде, содержащей YPS, (A) или в формиатсодержащей среде (B). На фиг.12 (A) проиллюстрирован анализ 8 кластеров генов гидрогеназы в T. onnurineus NA1, проводимый с использованием микромассивов. Изменения в иерархической кластеризации мРНК в присутствии формиата сравнивали с кластеризацией в культуральной среде YPS, используемой в качестве контроля. Стимуляция и ингибирование показаны красным и зеленым цветом, соответственно. Условия роста показаны в верхней части картины кластеризации. На правой стороне картины кластеризации, ОРС для каждого из кластеров mbh, codh-mch-mnhЗ, fdh1-mfh1-mnh1 и fdh2-mfh2-mnh2 показаны в виде горизонтальных полос. YE: дрожжевой экстракт. На фиг.12 (B) представлены результаты количественного ОТ-ПЦР-анализа в присутствии YPS, проводимого для каждой из крупных субъединиц гидрогеназ mbh (TON_1593), mbx (TON 0489), frh (TON_1560), sulf I (TON_0534), mch (TON_1023), mfh2 (TON_1569) и mfh1 (TON_0276). Ген T. onnurineus NA1, кодирующий шаперонин (cha), использовали в качестве контроля для нормализации уровней экспрессии.

На фиг.13 представлено нарушение гена-мишени крупной субъединицы каждой из гидрогеназ mfh1 (TON_0276) и mfh2 (TON_1569). На фиг.13 (A) представлена организация гена каждого из кластеров fdh1-mfh1-mnh1 и fdh2-mfh2-mnh2 в T. onnurineus NA1. P_gdh: промоторная область, расположенная слева от 5'-конца гена глутамат-дегидрогеназы T. kodakaraensis KOD1; и hmg_Pfu: ген 3-гидрокси-метилглутарил-кофермент A-редуктазы Pyrococcus furiosus. На фиг.13 (B) проиллюстрирована идентификация нарушения гена с помощью ПЦР. На левой панели проиллюстрирована ПЦР-амплификация с использованием праймеров для области кассеты сверхэкспрессии (P_gdh-hmg_Pfu). На правой панели проиллюстрирована ПЦР-амплификация с использованием праймеров для крупной субъединицы каждой из гидрогеназ mfh1 _TNA1 и mfh2 _TNA1. M: маркер размера (1 т.п.н.-лэддер); W: дикого типа; дорожки 1 и 2: мутантные штаммы.

На фиг.14 проиллюстрирован рост мутантных штаммов ^Δ mch _TNA1, ^Δ mfh1 _TNA1 или ^Δ mfh2 _TNA1 и продуцирование ими водорода в среде, содержащей YPS или формиат. Незаштрихованные кружки: рост; и заштрихованные кружки: продуцирование водорода.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте, настоящее изобретение относится к гидрогеназам, продуцируемым новым гипертермофильным штаммом Thermococcus onnurineus NA1 (рег. №: KCTC 10859BP), который продуцирует водород в анаэробных условиях. Этот штамм был выделен из гидротермальной глубоководной дренажной зоны в регионе островов Манус в Тихом океане, а именно в бассейне восточных островов Манус. Выделенный штамм был депонирован в Корейской коллекции типовых культур (KCTC) при Корейском научно-исследовательском институте биологии и биотехнологии (KRIBB) 7 октября 2005, а 20 октября 2005 ему был присвоен рег. №: KCTC 10859BP. Свойства этого штамма и методы его культивирования описаны в заявке на патент Кореи No. 10-2007-0127255, на основе которой было разработано настоящее изобретение.

T. onnurineus NA1 имеет восемь новых кластеров генов гидрогеназы. Гидрогеназы являются ключевыми ферментами, которые имеют отношение к метаболизму молекулярного водорода (H₂), и действуют как катализаторы в следующей обратимой реакции: 2H⁺ + 2e^- ⇔ H₂. Предпочтительно, гидрогеназы, принадлежащие к вышеописанным кластерам, продуцируют белки и их функциональные эквиваленты, содержащие одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 8. Используемый в настоящем документе термин «функциональный эквивалент» включает варианты аминокислотной последовательности, имеющие аминокислотные замены в некоторых или во всех белках, или аминокислотные добавления или делеции в некоторых из этих белков. Аминокислотными заменами, предпочтительно, являются консервативные замены. Примерами консервативных замен являются замены следующих природных аминокислот, таких как алифатические аминокислоты (Gly, Ala и Pro), гидрофобные аминокислоты (Ile, Leu и Val), ароматические аминокислоты (Phe, Tyr и Trp), кислотные аминокислоты (Asp и Glu), основные аминокислоты (His, Lys, Arg, Gln и Asn) и серусодержащие аминокислоты (Cys и Met). Делеции аминокислот, предпочтительно, присутствуют в области, которая не оказывает непосредственного влияния на активность гидрогеназ.

Во втором аспекте, настоящее изобретение относится к генам, кодирующим вышеописанные аминокислотные последовательности. Такими генами, предпочтительно, являются, но не ограничиваются ими, гены, представленные в SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19 (аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 8 соответствуют генам, представленным в SEQ ID NO: 12 - SEQ ID NO: 19, соответственно).

В третьем аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения водорода путем культивирования Thermococcus spp. Этот способ включает стадии: 1) приготовления среды в сосуде для культивирования; 2) культивирования Thermococcus spp. в сосуде для культивирования; и 3) извлечения водорода из сосуда для культивирования. Микроорганизмом Thermococcus spp., предпочтительно, является Thermococcus onnurineus NA1 (рег. №: КСТС 10859ВР).

Кроме того, указанной средой может быть среда, в которую были добавлены один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из монооксида углерода, формиата и крахмала. Культивирование может быть также осуществлено при высокой температуре 80°С в анаэробных условиях.

В четвертом аспекте, настоящее изобретение относится к дегидрогеназе, содержащей по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 11. Дегидрогеназы Fdh1 (SEQ ID NO: 20), Fdh2 (SEQ ID NO: 22) и CODH(SEQ ID NO: 21), соответственно, могут образовывать кластеры с гидрогеназами MFH1, MFH2 и MCH.

В пятом аспекте, настоящее изобретение относится к гену, кодирующему указанную дегидрогеназу. Предпочтительно, указанный ген выбран из генов, представленных в SEQ ID NO: 20 - SEQ ID NO: 22 (аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 9-11 соответствуют SEQ ID NO: 20-22, соответственно).

В шестом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в гидрогеназные кластеры CODH-MCH-MNH3 в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительными генами являются, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO:21 (CODH-дегидрогеназы) и SEQ ID NO:16 (MCH-гидрогеназы). Используемый в настоящем документе термин «вектор» означает молекулу нуклеиновой кислоты, которая может иметь другую присоединенную к ней молекулу нуклеиновой кислоты.

В качестве экспрессионного вектора, который может синтезировать белок, кодируемый рекомбинантным геном, присутствующим в указанном векторе, могут быть использованы плазмида, космида или фаг. Предпочтительным вектором является вектор, который может самореплицироваться и экспрессировать нуклеиновую кислоту, связанную с этим вектором.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным рекомбинантным вектором. Рекомбинантный вектор может быть использован для трансформации клеток, таких как прокариотические клетки, клетки грибов, клетки растений и клетки животных, в целях получения трансформированных клеток, которые могут продуцировать водород с высокой эффективностью. Используемый в настоящем документе термин «трансформация» означает абсорбцию чужеродной ДНК или РНК в клетки для изменения их генотипа. Для получения такой клетки-хозяина может быть использован общеизвестный метод трансформации каждой из указанных клеток.

Настоящее изобретение также относится к способу получения водорода с использованием указанных трансформантов, включающему стадии: приготовления среды в сосуде для культивирования; подачи монооксида углерода в газовую фазу, присутствующую в среде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

В седьмом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в гидрогеназные кластеры FDH2-MFH2-MNH2 в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительными генами являются, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO:22 (FDH2-дегидрогеназы) и SEQ ID NO:18 (MFH2-гидрогеназы). Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному рекомбинантным вектором.

Подробное описание «вектора», «трансформации» и «клеток-хозяев» приводится выше в шестом аспекте.

Настоящее изобретение также относится к способу получения водорода с использованием указанного трансформанта, включающему стадии: приготовления формиатсодержащей среды в сосуде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

В восьмом аспекте, настоящее изобретение относится к рекомбинантному вектору, содержащему гены, организованные в FDH1-MFH1-MNH1-гидрогеназные кластеры в T. onnurineus NA1, где все указанные гены являются функционально связанными. Предпочтительными генами являются, но не ограничиваются ими, гены SEQ ID NO:20 (FDH1-дегидрогеназы) и SEQ ID NO:13 (MFH1-гидрогеназы). Кроме того, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, трансформированному рекомбинантным вектором.

Подробное описание «вектора», «трансформации» и «клеток-хозяев» приводится выше в шестом аспекте.

Настоящее изобретение также относится к способу получения водорода с использованием указанного трансформанта, включающему стадии: приготовления крахмалсодержащей среды в сосуде для культивирования; культивирования указанного трансформанта в сосуде для культивирования; и извлечения водорода из сосуда для культивирования.

Ниже приводится более подробное описание настоящего изобретения со ссылкой на примеры. В этой связи следует отметить, что эти примеры приводятся лишь в иллюстративных целях и не ограничивают объема настоящего изобретения.

Пример 1: Анализ генов гидрогеназы штамма Thermococcus onnurineus NA1

(1) Тест-методы

1) Условия культивирования

Для осуществления рутинного культивирования клетки выращивали в анаэробных условиях при 80°С в среде, содержащей дрожжевой экстракт-пептон-серу (YPS) (Holden et al. 2001). Физиологические тесты осуществляли с использованием модифицированной среды 1 (Sokolova, T. G., C. Jeanthon, N. A Kostrikina, N. A. Chernyh, A. V. Lebedinsky, E. Stackebrandt and E. A. Bonch-Osmolovskaya. 2004. «The first evidence of anaerobic CO oxidation coupled with H₂ production by a hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent». Extremophiles 8:317-323), в которую было добавлено 1 мл смеси микроэлементов, 1 мл раствора витамина (Balch, W. E., G. E. Fox, L. J. Magrum, C. R. Woese, and R. S. Wolfe. 1979. Methanogens: reevaluation of a unique biological group. Microbio 1. Rev. 43:260-296), NaCl (30 г/л), и дрожжевой экстракт (0,5 г/л). pH доводили до 8,0 с использованием NaOH. Среду, полученную в анаэробных условиях, распределяли по 25-миллилитровым бутылям с сывороткой, и газовую фазу (15 мл) заменяли на N₂/CO₂ (80:20; 1 бар) или 100% CO. Если клетки культивировали в присутствии формиата или крахмала, то в среду добавляли 10 г/л формиата натрия (Sigma) или 5 г/л растворимого крахмала (Sigma), а затем автоклавировали. Все культуры для проведения физиологических тестов выращивали при 80°С в течение 2 дней.

2) Секвенирование генов

Последовательность генома T. onnurineus NA1 определяли путем секвенирования всего генома методом «дробового ружья» (shotgun) и пиросеквенирования. Для капиллярного секвенирования конструировали библиотеку со вставками размером 2 т.п.н.-3 т.п.н. (11028 клонов), библиотеку со вставкой размером 40 т.п.н. (1870 клонов) и библиотеку со вставкой размером 35 т.п.н. (288 клонов), и эти библиотеки секвенировали на секвенаторе ABI 3730XL (Applied Biosystems, CA). Для осуществления пиросеквенирования, 581990 фрагментов ДНК секвенировали на секвенаторе GS-20 (454 Life Sciences). Контиги, полученные на обоих секвенаторах, объединяли, и «закрытие» пропусков секвенирования осуществляли методом «прогулки по клонам» и методом ПЦР-секвенирования. Гены ОРС и РНК определяли с использованием комбинации программ Glimmer 3.0 (Универистет в шт. Мэриленд), GSFinder и RBSFinder, с последующей подгонкой ОРС вручную. После определения всех ОРС проводили дополнительный анализ последовательности белка с помощью поисковой программы BLASTP на последовательности белка в неизбыточных базах данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI), в энциклопедии генов и геномов Киото (KEGG) и COG (базе данных кластеров ортологичных групп белков) (Tatusova, R. L., D. A. Natale, I. V. Garkavtsev, T. A. Tatusova, U. T. Shankavaram, B. S. Rao, B. Kiryutin, M. Y. Galperin, N. D. Fedorova and E. V. Koonin. 2001. The COG database: new developments in phylogenetic classification of proteins from complete genomes. Nucleic Acids Res. 29:22-28). Для определения тРНК использовали программу tRNAScan-SE (Lowe, Т. М., and S. R. Eddy. 1997. tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25:955-964).

3) Анализ белков

Клетки Т. onnurineus NA1 суспендировали в 100 мМ трис-HCl-буфере (pH 6,8), содержащем 4% додецилсульфат натрия (ДСН) и 4 мМ EDTA, и кипятили в течение 10 минут, после чего центрифугировали при 22000g в течение 20 минут. Клеточный лизат отделяли с помощью электрофореза в 12% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ), и получали 30 фракций исходя из размера их молекул. Затем эти фракции гидролизовали в геле с использованием трипсина (Promega, USA) (Kim, Y. H., K. Cho, S. H. Yun, J. Y. Kim, K. H. Kwon, J. S. Yoo, and S. I. Kim. 2006. Analysis of aromatic catabolic pathways in Pseudomonas putida KT 2440 by combined proteomic approach: 2-DE/MS and cleavable ICAT analysis. Proteomics 6:1301-1318), и трипсиновые гидролизаты растворяли в 0,5% растворе трифторуксусной кислоты для проведения масс-спектрометрического анализа (Thermo Finnigan LTQ IT). Идентичность пептидов определяли с помощью программы Sequest (Thermo Finnigan, San Jose, CA).

4) Выделение всей РНК и ОТ-ПЦР-анализ

50-миллилитровую культуру Т. onnurineus NA1 выращивали до средней экспоненциальной фазы роста в модифицированной среде 1, в которую были добавлены различные концентрации дрожжевого экстракта в газовой фазе, состоящей из N₂/CO₂ (80:20, 1 бар) или 100% CO. Клетки собирали путем центрифугирования при 6000g в течение 30 минут. Осадок ресуспендировали в 50 мкл 50 мМ трис-HCl-буфера (pH 7,5), в который было добавлено 500 мкл реагента тризола (Invitrogen, Carlsbad, CA). Клетки подвергали лизису путем замораживания и оттаивания, а затем образцы экстрагировали 200 мкл хлороформа. Водную фазу, содержащую всю РНК, дополнительно обрабатывали путем преципитации этанолом, а затем ресуспендировали в дистиллированной воде. Концентрацию и целостность РНК определяли путем измерения оптической плотности на 260 и 280 нм, а также с помощью анализа в 0,8% агарозном геле. Обратную транскрипцию и ПЦР-амплификацию осуществляли с использованием обратной транскриптазы Superscript™ II (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителей. Для амплификации CODH (окись углерода-дегидрогеназы) и Hsp60 (шаперонина), используемого в качестве контроля, применяли два набора нижеследующих праймеров:

Ген CODH (прямой праймер: 5'-GGACCATGTAGAATCGAYCCGTTY-3' (SEQ ID NO: 23) и обратный праймер 5'-TTCRTTTCCGGTACAGCA-3' (SEQ ID NO: 24)); и ген Hsp60 (прямой праймер: 5'-ATGGCACAGCTTAGTGGACAG-3' (SEQ ID NO: 25) и обратный праймер, 5'-CAAGGATTTCCTGGGCTTTCTC-3' (SEQ ID NO: 26)).

5) Компьютерный анализ

Поиск гомологии аминокислотных последовательностей осуществляли с использованием программы BLAST в не-избыточной базе данных белков NCBI. Поиск мотива белков, имеющих сигнал L1 (C[GS][ILV]C[AGNS]xxH, где x означает любую аминокислоту) в гидрогеназах группы 4, осуществляли с использованием программы ProteinFinder (Ensoltek, Korea) в не-избыточной базе данных белков NCBI. Выравнивание множества последовательностей белков осуществляли с использованием программы ClustalW (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680), и конструировали филогенетическое дерево с использованием компьютерной программы для молекулярно-эволюционного генетического анализа (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)(Mega 4.1) (Tamura, K., Dudley, J., Nei, M. and Kumar, S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24, 1596-1599). Филогенетическое дерево для последовательностей рРНК 16S строили на основе последовательностей, подвергнутых предварительному выравниванию и взятых из базы данных для рибосом на сайте (http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp).

6) Создание сигнатур logo-данных

Logo-представления данных использовали для визуализации объема информации, ассоциированного с каждым положением данного мотива, который является общим для родственных последовательностей. В графическом представлении, общая высота для каждого положения коррелирует с консервативностью в данном положении (выражено в битах), где относительные размеры символов в данном положении указывают на их относительную частоту. Logo-анализы осуществляли в Центре структурной геномики Беркли (http://weblogo.berkeley.edu/).

(2) Результат анализов

1) Общие признаки генов T. onnurineus NA1

Для получения какого-либо представления относительно факторов, которые вносят свой вклад в явно успешную конкуренцию Thermococcus spp. с другими микроорганизмами, обитающими в гидротермальной дренажной зоне, геномную последовательность T. onnurineus NA1 определяли комбинированным методом рандомизированного секвенирования всего генома, проводимым методом «дробовика» и пиросеквенирования. В результате было обнаружено, что T. onnurineus NA1 имеет одну кольцевую хромосому (1847607 п.н.), не содержащую каких-либо внехромосомных элементов, и было идентифицировано всего 1976 кодирующих последовательностей ДНК (CDS) (Таблица 1 и фиг.1). Из них 1104 CDS (55,8%) было выявлено путем поиска гомологии и доменов, но функция остальных 872 CDS не могла быть предсказана исходя из их первичной структуры. При поиске сходства белков в масштабе всего генома 82,7% белков T. onnurineus NA1 обнаруживали сходство с другими членами Thermococcales.

Таблица 1
Общие признаки генома T. onnurineus NA1 и штаммов T. kodakaraensis KOD1 и Pyrococcus
	NA1	KOD1	P.abyssi	P.horikoshii	P.furiosus
Размер генома (п.н.)	1847607	2088737	1765118	1738505	1908256
Белоккодирующие области	90,1%	92,1%	91,1%	91,2%	92,5%
Содержание GC	51,0%	52,0%	44,7%	41,9%	40,8%
CDSa	1976	2306	1784	2064	2065
тРНК	46	46	46	46	46
рРНК	5S(x2), 7S,16S,32S	5S(x2),7S,16S,32S	5S(x2), 7S,16S,32S	5S(x2),7S,16S,32S	5S(x2),7S,16S,32S
a: Наборы белков для этих штаммов были получены из коллекции RefSeq в NCBI.

2) Кластеры гидрогеназ

В геноме T. onnurineus NA1 было обнаружено очень высокое содержание гидрогеназ и родственных белков (5,5%), что указывает на повышенную консервативность или рециклизацию восстановительного потенциала в отношении оксидоредуктаз, включая CO-дегидрогеназу и формиатдегидрогеназу.

Гидрогеназы могут быть разделены на следующие три основные группы, исходя из их каталитического металлического центра: [NiFe]-гидрогеназы, [FeFe]-гидрогеназы и [Fe]-гидрогеназы. На основании уникального функционального центра, который является консервативным для каждой из групп гидрогеназ, был сделан вывод, что все гидрогеназы в T. onnurineus NA1, за исключением одной гидрогеназы, принадлежат к [NiFe]-гидрогеназам. В соответствии с системой классификации гидрогеназ Vignais et al., [NiFe]-гидрогеназы в T. onnurineus NA1 принадлежат к группе 3 (одна F420-восстанавливающая гидрогеназа и две NADP-восстанавливающие гидрогеназы) или к группе 4 (четыре мембраносвязанные гидрогеназы) (Silva, P.J., van den Ban, E.C., Wassink, H., Haaker, H., de Castro, В., Robb, F.T. and Hagen, W.R. (2000) Enzymes of hydrogen metabolism in Pyrococcus furiosus. Eur. J. Biochem. 267, 6541-6551). Гидрогеназы, принадлежащие к группе 4, называются преобразующими энергию гидрогеназами (Ech), и такие гидрогеназы широко распространены в бактериях и архебактериях.

Для выявления молекулярной основы метаболизма гидрогеназ генные кластеры гидрогеназ подвергали сравнительному анализу. Указан