2500386 - Противовозрастная или антиоксидантная композиция, содержащая в качестве активного ингредиента линию растительных стволовых клеток, полученных из камбия panax ginseng, включая женьшень дикого типа и женьшень корейский

Противовозрастная или антиоксидантная композиция, содержащая в качестве активного ингредиента линию растительных стволовых клеток, полученных из камбия panax ginseng, включая женьшень дикого типа и женьшень корейский

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к области косметологии. Предложено применение клеточной культуры, полученной из одной или более гомогенной клеточной линии, происходящей из камбия Panax ginseng, или ее экстракта, при приготовлении противовозрастной косметической композиции. Изобретение обеспечивает эффективное средство для предотвращения или подавления старения за счет антиоксидантного эффекта природных материалов, входящих в состав указанной композиции. 6 з.п. ф-лы, 7 ил., 20 табл., 12 пр.

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к противовозрастной или антиоксидантной композиции, содержащей, в качестве активного ингредиента, одну или более клеточную линию, полученную из камбия Panax ginseng, включая дикий женьшень и женьшень корейский, ее экстракт, лизат и культуру.

Предшествующий уровень техники

На сегодняшний день существует около 300000 видов растений и известно, что растения содержат полезные компоненты, обладающие различными физиологическими активностями. Полезными компонентами являются вторичные метаболиты, которые продуцируются вторично в процессе нормальных процессов метаболизма и аккумулируются во внутриклеточных специфических участках. Эти подходящие компоненты приковывают повышенное внимание, поскольку они защищают растения от микроорганизмов или животных с биохимической или экологической точки зрения и являются полезными относительно физиологической активности. Вторичные метаболиты, которые продуцируются растениями, включают алкалоиды, флавоноиды, каротиноиды, гликозиды, терпеноиды и др.

Многие такие вторичные метаболиты проявляют увлажняющее, успокаивающее и смягчающее, защищающее от действия УФ, отбеливающее, очищающее от кератина, противовозрастное, антиоксидантное, снижающее образование морщин, антибактериальное, противовоспалительное и протиоопухолевое действие и др. Соответственно, разрабатываются разные косметические продукты, содержащие полезные компоненты, которые получают из растений. Например, косметические продукты, содержащие полезные компоненты, полученные из растений, включают: отбеливающую косметическую композицию, содержащую мальберрин, выделенный из Morus alba (Патент Кореи №25582), косметическую композицию, содержащую экстракт Alpinia Katsumadai (Патент Кореи №295875), косметическую композицию для предотвращения старения кожи, содержащую экстракт женьшеня (Патент Кореи №361433), и косметическую композицию для уменьшения морщин, содержащую Ecklonia Cava (Патент Кореи №2001-25580). В дополнении, разрабатываются различные косметические продукты, которые содержат экстракты различных растений, включая кору каштана, Xanthii fructus, тыкву, Caesapinia sappan L., гигантский горец, мальву, мяту, Ainus juponica, злаки, березу, Рога cocos, гранат, ивовую кору, маш, розу и др. Такие полезные компоненты, полученные из растений, являются вторичными метаболитами, которые экстрагируют непосредственно из растений, поскольку пути биосинтеза их являются комплексными.

При этом кожа является главным защитным барьером организма человека, чьей функцией является защита разных частей организма от изменений температуры и влажности, и внешних стимулов окружающей среды, таких как УФ и загрязняющие вещества играют важную роль в поддержании гемостаза in vivo. Однако, УФ-свет, чрезмерные физические и химические стимулы от внешних факторов, стрессы, недостаточность питания и подобные ухудшают нормальное функционирование кожи и ускоряют процесс старение кожи, напр., потерю плотности кожи, кератинизацию и образование морщин и подобные. Для предотвращения этих процессов и сохранения кожи более здоровой и эластичной, предприняты усилия применения косметики, содержащей физиологически активные вещества, полученные из различных животных, растений и микроорганизмов, с тем, чтобы поддержать внутренние функции кожи и активировать клетки кожи, которые эффективно подавляют старение кожи. Однако сырье для косметических продуктов согласно уровню техники имеет разные проблемы в том, что они главным образом обладают недостаточными эффектами или вызывают побочные эффекты для кожи.

Соответственно, изобретатели настоящего изобретения приложили много усилий для разработки композиции, полученной из природных материалов, которая имеет минимизированное число побочных эффектов по сравнению с существующими противовозрастными агентами и антиоксидантами и обладает отличным противовозрастным и антиоксидантным действием, В итоге, изобретатели данного изобретения обнаружили, что гомогенная клеточная линия, полученная из камбия Panax ginseng, ее лизат, экстракт или культура, имеют отличные ингибирующие эффекты против старения и окисления, тем самым завершая настоящее изобретение.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является получение композиции из природных материалов, которая имеет минимизированные побочные эффекты по сравнению с существующими противовозрастными агентами и антиоксидантами и проявляет противовозрастную и антиоксидантную активность.

Для достижения вышеуказанной цели, настоящее изобретение обеспечивает противовозрастную или антиоксидантную композицию, содержащую любые одну или более клеточную линию (а также ее экстракт, лизат или культуру), которую получают из камбия Panax ginseng и которая имеет следующие характеристики:

(a) она находится в природно недифференцированном состоянии;

(b) она является гомогенной клеточной линией; и

Настоящее изобретение также обеспечивает противовозрастную косметическую композицию, содержащую любые одну или более указанную клеточную линию, ее экстракт, лизат или культуру.

Настоящее изобретение также обеспечивает противовозрастные или антиоксидантные функциональные продукты питания, содержащие любые одну или более указанную клеточную линию, ее экстракт, лизат или культуру.

Другие признаки и воплощения настоящего изобретения будут более понятны из следующего подробного описания и прилагаемой формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 показывает фотографии, демонстрирующие процесс получения клеточной линии согласно настоящему изобретению, и фотографию самой клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа.

Фиг.2 представляет собой графическую диаграмму, показывающую результаты обработки нормальных фибробластов человека (NHF) различными концентрациями экстракта полученной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии настоящего изобретения или культуральной среды клеточной линии и оценку, цитотоксичен ли экстракт или культуральная среда клеточной линии для фибробластов. На Фиг.2, влажные: влажные клетки женьшеня, сухие: сухие клетки женьшеня, среда: культуральная среда клеток женьшеня, Е1: Элиситация-1 стадия, Е2: Элиситация-2 стадия, и G: стадия роста.

Фиг.3 представляет собой графическую диаграмму, показывающую результат обработки нормальных фибробластов человека (NHF) различными концентрациями экстракта полученной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии настоящего изобретения или культуральной среды клеточной линии, культивирования фибробластов в 0,5% FBS минимальной эссенциальной среде, и оценку действия экстракта полученной из камбия женьшеня дикого типа клеточной линии или культуральной среды на пролиферацию фибробластов. На Фиг.3, влажные: влажные клетки женьшеня, сухие: сухие клетки женьшеня, среда: культуральная среда клеток женьшеня, Е1: Элиситация-1 стадия, Е2: Элиситация-2 стадия, и G: стадия роста.

Фиг.4 представляет собой графическую диаграмму, показывающую результат обработки нормальных фибробластов человека (NHF) различными концентрациями экстракта полученной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии настоящего изобретения или культуральной среды клеточной линии, обработки фибробластов УФВ-излучением и оценку, ингибируется ли повышение экспрессии ММР-1, вызванное УФВ-излучением, экстрактом полученной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии или культуральной средой. На Фиг.4, влажные: влажные клетки женьшеня, сухие: сухие клетки женьшеня, среда: культуральная среда клеток женьшеня, Е1: Элиситация-1 стадия, Е2: Элиситация-2 стадия, и G: стадия роста.

Фиг.5 представляет собой графическую диаграмму, показывающую результат обработки нормальных фибробластов человека (NHF) различными концентрациями экстракта полученной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линии или культуральной среды клеточной линии, обработки фибробластов УФВ-излучением и оценку, ингибируется ли увеличение активных форм кислорода, вызванное УФВ-излучением, экстрактом гомогенной клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа, или культуральной средой. На Фиг.5, влажные: влажные клетки женьшеня, сухие: сухие клетки женьшеня, среда: культуральная среда клеток женьшеня, Е1: Элиситация-1 стадия, Е2: Элиситация-2 стадия, и G: стадия роста, и RA: ретиноевая кислота.

Фиг.6 представляет собой графическую диаграмму, показывающую действие экстракта гомогенной клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа, культуральной среды клеточной линии по ингибированию продукции ММР-1, при индуцировании ММР-1 УФ-излучением.

Фиг.7 представляет собой графическую диаграмму, показывающую действие гомогенного экстракта клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа, или культуральной среды настоящего изобретения на устранение активных форм кислорода, образующихся при воздействии УФ-излучения.

Подробное описание изобретения

Если не определено иное, то все используемые здесь технические и научные термины имеют общепринятые для специалиста в данной области значения. В целом, используемая в данном документе номенклатура хорошо известна и общепринята в уровне технике.

Основные термины, используемые для подробного описания изобретения, имеют следующие значения.

В используемом здесь значении, термин "камбий" относится к ткани, которая утолщает ствол и корень, что позволяет растению расти объемно. Сообщалось, что при использовании камбия, меристемы, в которой происходит наиболее активное деление клеток, в качестве эксплантата для культуры растительной ткани, то возможно быстрое и массовое размножение клеток (Патент Кореи №10-0533120).

В используемом здесь значении, термин "лизат" относится к клеточному лизату, полученному путем разрушения клеток посредством применения химического метода с использованием, например, детергента, или физического метода. Термин "экстракт" клеточной линии относится к субстанции, полученной путем растворения клеток в растворителе и выделении субстанции, при этом экстракт можно концентрировать посредством дистилляции или выпаривания. Также, термин "культуральная среда" клеточной линии относится к клеточной среде, из которой клетки удалены после их культивирования. В дополнении, термин "культура" клеточной линии, в используемом здесь значении, относится к материалу, содержащему культуральную среду и/или культивируемую клеточную линию, причем понятие "культивируемая клеточная линия" включает клеточную линию, которая дифференцируется в условиях культивирования или которая обладает повышенной способностью к продуцированию и/или секретированию подходящих субстанций.

В используемом здесь значении, термин "природно недифференцированные" не означает, что клетки находятся в недифференцированном состоянии в процессе дедифференцировки, а означает, что клетки исходно сохраняются в предифференцированном состоянии.

В одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает противовозрастную или антиоксидантную клеточную линию, полученную из камбия Panax ginseng, ее экстракт, лизат или культуру. В настоящем изобретении, Panax ginseng включает женьшень дикого типа или женьшень (Lian M.L. et al., J. Plant Biology, 45: 201, 2002; Han J.Y. et al., J. Plant Biology, 49: 26, 2006; Teng W.L. et al., Tissue and Organ Culture, 68: 233, 2002). В настоящем изобретении, женьшень дикого типа или женьшень включает культивированный на открытом воздухе или культивированный из ткани женьшень (придаточный корень и полученная из придаточного корня клеточная линия).

Клеточная линия, полученная из камбия Panax ginseng, согласно настоящему изобретение имеет следующие особенности: (a) она находится в природно недифференцированном состоянии; (b) она является гомогенной клеточной линией; и (c) она морфологически характеризуется множеством вакуолей.

Клеточная линия, полученная из камбия Panax ginseng, согласно настоящему изобретение дополнительно характеризуется следующим: (а) она присутствует в виде отдельных клеток во всей суспензионной культуре; (b) она имеет низкую чувствительность к сдвигу в биореакторе по сравнению с клеточными линиями, полученными из тканей, отличных от камбия Panax ginseng, и (с) она имеет более высокую скорость роста по сравнению с теми клеточными линиями, которые получены из тканей, отличных от камбия Panax ginseng, и стабильна в культуре.

Клеточную линию настоящего изобретения получают, используя способ выделения, который включает следующие стадии: (а) получение запасающей ткани корня, содержащей камбий Panax ginseng; (b) воздействие осмотического стресса на полученную ткань камбий-содержащей запасающей ткани корня, с последующим культивированием полученной камбий-содержащей запасающей ткани корня в среде, содержащей ИУК (Индол-3-уксусная кислота)- или ИМК (Индол-3-масляная кислота), получая тем самым происходящую из камбия клеточную линию; и (с) отбор индуцированной клеточной линии, происходящую из камбия.

В стадии (b) способа изобретения, применение осмотического стресса осуществляют для индукции клеточной линии, в особенности в камбии. Предпочтительно, его применяют перед культивированием ткани в среде, содержащей ИУК или ИМК, так что основные ткани (напр., кора, флоэма, ксилема и сердцевина), отличные от камбия, теряют способность к делению, и, следовательно, становятся некротическими, если их обрабатывают гормоном, специфичным к камбиальному делению, таким как ИУК или ИМК. Здесь, предпочтительно, осмотический агент используется в количестве 0,5-2М, и осмотический стресс применяется в условиях холода или при комнатной температуре в течение 16-24 часов, и затем агент удаляют. Однако объем настоящего изобретения этим не ограничивается, поскольку концентрация, время обработки и температура осмотического агента могут варьировать в зависимости от вида растения и состояния ткани. В стадии (b), ИУК или ИМК предпочтительно содержатся в количестве 0,1-5 мг/л.

Предпочтительно, стадия (с) осуществляется путем пролиферации индуцированной клеточной линии, происходящей из камбия, в среде, содержащей одно или более соединений, выбранных из 2,4-D (2,4-дихлофеноксиуксусной кислоты), пиклорама и ИМК, с последующим отбором полученной из камбия клеточной линии. Здесь, любое соединение, выбранное из 2,4-D, пиклорама и ИМК, предпочтительно содержится в количестве 1-5 мг/л, и более предпочтительно 2 мг/л.

В настоящем изобретении, культуру клеточной линии предпочтительно получают путем дополнительного культивирования клеточной линии в среде, которая, как элиситоры, содержит 3-5 вес.% сахара-сырца или сахара, и/или любой один или более метилжасмонат, хитозан, фенилаланин, бензойную кислоту, АВА, салициловую кислоту и ацетат натрия. Здесь, среда предпочтительно содержит 3-5 вес.% сахара-сырца или сахара; и по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из метилжасмоната, грибкового экстракта, бактериального экстракта, дрожжевого экстракта, хитозана, глюкоманнана, глюкана, фенилаланина, бензойной кислоты, салициловой кислоты, арахидоновой кислоты, STS, мевалоналонат N-бензоилглицина, АВА, SNP, IPP, ВНТ, ССС, этефона, гиппуровой кислоты, цериевого нитрата аммония, AgNO₃, ванадилсульфата, p-аминобензойной кислоты, брассиностероидов, альгината натрия и ацетата натрия.

Также, в настоящем изобретении, возможно использовать культуру, полученную путем обработки клеточной линии элиситорами, включая УФ-излучение, нагревание, этилен, антигрибковый агент, антибиотик, соль тяжелых металлов и высококонцентрированную соль, для воздействия на нее физического и химического стресса.

Используемой в настоящем изобретении средой является традиционная среда для культуры растительной ткани, и ее примеры включают, но не ограничиваются, N6 среду, SH среду, MS среду, АА среду, LS среду, В5 среду, WPM среду, LP среду. White среду, GD среду, DKW среду, DCR среду и др.

В настоящем изобретении, экстракт предпочтительно получают, используя растворитель, выбранный из группы, состоящей из дистиллированной воды, спирта, ацетона, DMSO (диметилсульфоксида), и смеси растворителей. Здесь, примеры спирта включают спирты, имеющие 1-5 атомов углерода, такие как метанол и этанол.

В настоящем изобретении, экстракт может быть получен путем последовательного фракционирования клеточной линии дистиллированной водой, метанолом и ацетоном.

В одном примере настоящего изобретения, фибробласты, которые синтезируют коллаген (главный компонент кожи), обрабатывали указанным экстрактом клеточной линии или культуральной средой и, в итоге, обнаружили, что экстракт клеточной линии и культуральная среда оказывают отличный эффект на пролиферацию фибробластов, из чего можно сделать вывод, что экстракт клеточной линии и культуральная среда настоящего изобретения повышают упругость кожи. В другом примере настоящего изобретения, показано, что экстракт клеточной линии и культуральная среда настоящего изобретения ингибируют экспрессию ММР-1, которая разрушает коллаген с формированием морщинок на коже, из чего следует, что они предохраняют от и снижают образование морщин. В еще другом примере настоящего изобретения, обнаружили, что экстракт клеточной линии и культуральная среда настоящего изобретения ингибируют активные формы кислорода, образование которых вызвано воздействием УФ-излучения, из чего можно сделать вывод, что они обладают антиоксидантным действием. Поскольку для специалиста в данной области известно, что композиции, обладающие антиоксидантной активностью оказывают противовозрастное действие, то очевидно, что композиция настоящего изобретения обладает противовозрастным действием.

В еще другом примере настоящего изобретения, для обеспечения объективности, выполняли тестирование экстракта клеточной линии и культуральной среды настоящего изобретения относительно их противовозрастного и антиоксидантного действия с использованием метода наружного применения. В итоге, обнаружили, что экстракт клеточной линии и культуральная среда настоящего изобретения обладают более превосходным противовозрастным эффектом по сравнению с RA, которые как известно обладают отличным противовозрастным действием, и экстрактом женьшеня дикого типа. В дополнении, можно видеть, что экстракт клеточной линии и культуральная среда настоящего изобретения обладает более значимым антиоксидантным действием по сравнению с экстрактом женьшеня дикого типа, культивированным на открытом пространстве.

Соответственно, было обнаружено, как описано выше, что экстракт клеточной линии обладал противовозрастным действием и антиоксидантной активностью. Так, даже если в настоящем изобретении не приведены специфические примеры, показывающие, что композиция, содержащая клеточную линию, обладает противовозрастным действием и антиоксидантной активностью, то для специалиста в данной области очевидно, что композиция, содержащая клеточную линию согласно настоящему изобретение или ее лизат, также может обладать противовозрастным действием и антиоксидантной активностью.

Противовозрастная или антиоксидантная композиция, содержащая любые одну или более клеточную линию настоящего изобретения, ее экстракт, лизат или культуру, может быть обеспечена в виде фармацевтической композиции, содержащей любые одну или более указанную клеточную линию (ее экстракт, лизат или культуру) саму по себе или в сочетании с, по меньшей мере, одним фармацевтически подходящим носителем, эксципиентом или разбавителем. Клеточная линия, ее лизат, экстракт или культуральная среда может содержаться в фармацевтической композиции в фармацевтически эффективном количестве в зависимости от заболевания и его тяжести, возраста пациента, веса, состояния здоровья и пола, пути применения и периода лечения.

В используемом здесь значении, термин "фармацевтически подходящая композиция" относится к композиции, которая физиологически пригодна и не вызывает аллергические реакции или аналогичные реакции, такие как нарушения функции желудочно-кишечного тракта или головокружение, при применении для людей. Примеры указанного носителя, эксципиента или разбавителя могут включать лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннитол, кислит, эритрит, мальтит, крахмал, камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, стеарат магния и минеральные масла.

Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать наполнители, агнеты, не вызывающие агрегацию, смазывающие агенты, увлажнители, ароматизаторы, эмульгаторы и консерванты. Также, фармацевтическая композиция настоящего изобретения может быть составлена с использованием способа, хорошо известного из уровня техники, такого, который обеспечивает быстрое, длительное или замедленное высвобождение активного ингредиента после применения млекопитающим. Композиция может быть в виде порошков, гранул, таблеток, эмульсий, сиропов, аэрозолей, мягких и твердых желатиновых капсул, стерильных растворов для инъекций, стерильных порошков и др.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к противовозрастной косметической композиции, содержащей, в качестве активного ингредиента, любые одну или более указанную клеточную линию, происходящую из камбия PAnax ginseng, ее экстракт, лизат или культуру.

В используемом здесь значении, термин "функциональная косметическая продукция" относится к косметической продукции, функциональность которой повышается при добавлении в нее любой одной или более клеточной линии настоящего изобретения, ее экстракта, лизата и культуральной среды. Например, противовозрастная косметическая композиция, содержащая клеточную линию настоящего изобретения, ее лизат, экстракт или культуральную среду, может использоваться для приготовления функциональной косметической продукции.

Косметическая композиция настоящего изобретения может содержать традиционные ингредиенты для косметических средств, дополнительно к клеточной линии или ее лизату, экстракту или культуральной среде, в качестве активного ингредиента. Например, косметическая композиция может содержать традиционные вспомогательные агенты, такие как антиоксиданты, стабилизаторы, солюбилизирующие агенты, витамины, пигменты и ароматизаторы, а также носители.

Косметическая композиция настоящего изобретения может быть составлена в виде любых составов, которые общеприняты в уровне техники. Предпочтительно, косметическая композиция составлена в виде состава, выбранного из группы, состоящей из лосьона для кожи, молочка для кожи, питательного крема, массажного крема, маски, основы для макияжа, тонального крема, масла для тела, масла для головы, шампуня и ополаскивателя.

Косметическая композиция настоящего изобретения, которая содержит любые одну или более клеточную линию настоящего изобретения, ее экстракт, лизат или культуру, обладает антиоксидантным действием и, следовательно, обладает эффектом элиминирования свободных радикалов, образующихся в коже, и защиты внутриклеточных антиоксидантных систем. Соответственно, косметическая композиция настоящего изобретения может проявлять эффекты предотвращения и замедления старения кожи вследствие окисления, что происходит за счет воздействия, например, свободных радикалов.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к противовозрастным или антиоксидантным функциональным продуктам питания, содержащим, в качестве активного ингредиента, любые одну или более клеточную линию, происходящую из камбия Panax ginseng, ее экстракт, лизат или культуру.

В используемом здесь значении, термин "функциональные продукты питания" относится к продуктам питания, функциональность которых повышается за счет добавления в них клеточной линии настоящего изобретения, ее лизата, экстракта или культуральной среды.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

В дальнейшем, настоящее изобретение будет описано более подробно посредством примеров. Необходимо понимать, что эти примеры представлены только в целях иллюстрации и не ограничивают объем настоящего изобретения.

В частности, хотя в следующих примерах приведены подтверждения эффектов омоложения кожи при применении экстракта и культуральной среды клеточной линии, полученной из камбия Panax ginseng, для специалиста в данной области техники очевидно, что применение клеточной линии или ее лизата может обеспечивать такие же результаты, что и при применении экстракта и культуральной среды клеточной линии.

Пример 1: Получение клеточной линии, происходящей из камбия женьшеня дикого типа

1-1: Подготовка растительного материала

"А" Фиг.1(а) показывает типичную часть, используемую в настоящем изобретении. Для использования стержневого корня приобретенного женьшеня дикого типа, приобретали стержневой корень и затем промывали его под проточной водой для удаления земли или других загрязнений с его поверхности и промывали поверхность стержневого корня жидким моющим средством. Затем, стержневой корень промывали под проточной водой. Промытую ткань корня помещали в стерилизованную колбу в боксе и дезинфицировали 70% этанолом в течение от около 30 секунд до около 1 минуты. Затем, ополаскивали стерильной водой и обрабатывали дезинфицирующим раствором, содержащим 1-1,5% гипохлорит натрия (Junsei, Japan), в течение около 5-15 минут. В это время, для эффективного проникновения дезинфицирующего раствора в ткань, к ткани добавляли несколько капель TWEEN 20 (монолаурата полиоксиэтиленсорбита, Junsei, Japan). После этого, ткань ополаскивали 3-5 раз стерильной водой. Для предотвращения потемнения дезинфицированной ткани, дезинфицированный стержневой корень помещали в содержащую антиоксиданты BIM (среду, ингибирующую потемнение) и культивировали с использованием перемешивания в течение от около 30 минут до 1 часа. Культивированную ткань помещали на стерильную фильтровальную бумагу для удаления воды.

Состав применяемой BIM и содержание ее компонентов приведены в Таблице 1 ниже.

Таблица 1.
Состав BIM и содержание ее компонентов
Состав	Содержание
Соль WPM (McCown)	1/4 крепости
Сахароза	1%(в/об)
PVP (поливинилпирролидон)	0,5%(в/об)
Аскорбиновая кислота	100 мг/л
Лимонная кислота	150 мг/л
Регулируют до рН 5,8

В Таблице 1 соль добавляют в количестве, равному общему объему BIM. Для предотвращения вышеуказанного обработанного материала от потемнения, материал помещали в сосуд, содержащий раствор CS (разделяющий раствор, Таблица 2), содержащий антиоксиданты, и очищали. Затем, материал разрезали на две равные части и каждую часть разрезали по размеру 0,5-0,7 см (ширина) × 0,5-0,7 см (длина) × 0,2-0,5 мм (толщина) таким образом, что каждый отрезанный элемент содержал часть камбия, имеющую способность активного деления. "В" на Фиг.1(а) показывает эксплантат, полученный путем разрезания стержневого корня женьшеня дикого типа на вышеуказанный размер таким образом, что эксплантат содержит камбий.

Таблица 2.
CS (разделяющий раствор)
Компонент	Содержание
PVP (поливинилпирролидон)	0,5% (в/об)
Аскорбиновая кислота	100 мг/л
Лимонная кислота	150 мг/л

1-2: Обработка эксплантата, содержащего камбий стержневого корня женьшеня дикого типа. осмотическим агентом

Эксплантат, полученный в Примере 1-1, подвергали осмотическому стрессу для некроза дифференцированных тканей (т.е., лубяной, ксилемной, сердцевидной, и др.) и сохраняли только меристему-камбий. Содержащий камбий эксплантат промокали прекультуральной средой (среда 1, Таблица 3), содержащей фильтровальную бумагу, покрывающую ее, и помещали в колбу, содержащую 1М раствор сахарозы (Duchefa, Netherland) и подвергали осмотическому стрессу в состоянии холода в течение 16-24 часов. Затем, эксплантат обрабатывали 0,05М раствором сахарозы в течение 5 минут и 0,1М раствором сахарозы в течение 5 минут для устранения стресса, вызванного высококонцентрированной сахарозой. Содержащий камбий эксплантат, у которого устранен осмотический стресс, помещали на прекультуральную среду (среду 1), содержащую покрывающую ее фильтровальную бумагу, для удаления влаги.

Таблица 3.
Состав прекультуральной среды (среда 1)
Состав	мМ	мг/л
Макроэлементы	Ca(NO₃)₂	2,35	471,26
NH₄NO₃	5	400
MgSO₄.7H₂O	1,5	180,54
K₂SO₄	5,68	990
CaCl₂.2H₂O	0,65	72,5
KH₂PO₄	1,25	170
Состав	мкМ	мг/л
Микроэлементы	MnSO₄.4H₂O	131,94	22,3
ZnSO₄.7H₂O	29,91	8,6
Na₂MoO₄.2H₂O	1,03	0,25
H₃BO₃	100,27	6,2
CuSO₄.5H₂O	1,0	0,25
FeNa-EDTA	100	36,7
Витамин	Глицин	26,64	2,0
мио-Инозитол	554,94	100
Никотиновая кислота	4,06	0,5
Пиридоксин-HCl	2,43	0,5
Тиамин-HCl	2,96	1,0

1-3: Индукция выделенной из камбия гомогенной клеточной линии в эксплантат, содержащий камбий женьшеня дикого типа

Для индукции выделенной из камбия гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к клеточному делению, эксплантат, подвергнутый осмотическому стрессу в Примере 1-2, переносили в среду для индукции клеточной линии (среда 2, Таблица 4). Состав используемой среды представлен в Таблице 4 ниже. Перенесенный эксплантат культивировали в условиях темноты при температуре 22±1°С.

Таблица 4.
Состав среды (среда 2), используемой для индукции выделенной из камбия гомогенной клеточной линии,
Компонент	Содержание и состояние
Соль	концентрированная WPM
Сахароза	3% (в/об)
IAA (индол-3-уксусная кислота)	2 мг/л
рН	5,8
Гельрит	0,3%(в/об)
Аскорбиновая кислота	100 мг/л
Лимонная кислота	150 мг/л

Как показано в Таблице 5 ниже, в эксплантатах, перенесенных непосредственно в гомогенную среду, индуцирующую клеточную линию без применения осмотической обработки, реакция окрашивания желтым цветом показывала, что, относительно камбия на начальной стадии (2-3 суток) после переноса и затем с течением времени, внесенный эксплантат окрасился желтым. Эксплантат, который окрасился в желтый цвет относительно камбия, пересевали в оптимальную среду (среда 3) для выделения и пролиферации происходящей из камбия клеточной линии для индукции и пролиферации полученной из камбия клеточной линии, при этом феномен окрашивания в коричневый цвет становился более выраженным, и любая реакция, отличная от коричневого окрашивания, не наблюдалась с течением времени.

Однако, после применения осмотического стресса и удаления, наблюдалось, как показано в Таблице 5, что, в эксплантате, инокулированном в среду, индуцирующую гомогенную клеточную линию, гомогенная клеточная линия была специфично индуцирована только в камбии, без индукции в других тканях. Специфично, наблюдалось, что перенесенный эксплантат, который обработан осмотическим стрессом и из которого осмотический стресс был высвобожден, эксплантат камбия начинал окрашиваться в желтый цвет через 3-7 суток культивирования, и через около 7-14 суток, круг клеточной линии был индуцирован в части, где изменилась окраска до желтого цвета. "С" на Фиг.1(а) показывает, что гомогенная клеточная линия, имеющая камбий-специфичную способность к делению, была индуцирована в эксплантате, содержащем камбий женьшеня дикого типа.

При этом эксплантат культивировали в 2,4-D-содержащей среде, которая не являлась средой, индуцирующей гомогенную клеточную линию, и которая использовалась в традиционной культуре Panax ginseng, включая женьшень и женьшень дикого типа. В этом случае, наблюдали, что весь эксплантат начинал изменять цвет на желтый на 7-10 сутки культивирования и через около 7-14 после этого клетки были индуцированы на всем протяжении среза.

1-4: Пролиферация изолированной гомогенной клеточной линии, полученной из камбия женьшеня дикого типа

Выделенная из камбия гомогенная клеточная линия, обладающая способностью к делению, индуцированная в Примере 1-3, подвергалась пролиферации. Используемая в пролиферации среда являлась оптимальной средой (Таблица 7) для пролиферации полученной из камбия гомогенной линии клеток, обладающей способностью к делению, причем среда содержала основной состав солей (Таблица 6).

Таблица 6.
основной состав солей оптимальной среды для выделения и пролиферации выделенной из камбия гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к делению
Состав	мМ	мг/л
Макроэлементы	CaCl₂.2H₂O	2,99	332,02
KH₂PO₄	1,25	170
KNO₃	18,79	1900
MgSO₄	1,5	180,54
	NH₄NO₃	20,61	1650
Состав	uM	МГ/Л
Микроэлементы	CoCl₂.6H₂O	0,11	0,025
CuSO₄.5H₂O	0,1	0,025
FeNa-EDTA	100	36,7
H₃BO₃	100,27	6,2
Kl	5,0	0.83
MnSO₄.4H₂O	100	16,9
Na₂MoO₄.2H₂O	1,03	0,25
ZnSO₄.7H₂O	29,91	8,6
Витамины	Глицин	26,64	2,0
мио-Инозитол	554,94	100
Никотиновая кислота	4,06	0,5
Пиридоксин-HCl	2,43	0,5
Тиамин-HCl	0,3	0,1

Таблица 7.
Состав оптимальной среды (среда) для выделения и пролиферации выделенной из камбия гомогенной клеточной линии, обладающей способностью к делению
Компонент	Содержание и состояние
Соль	Концентрированная MS
Сахароза	3% (в/об)
2,4-D(2,4-дихлофеноксиуксусная кислота)	2 мг/л
рН	5,8
Гельрит	0,3% (в/об)
Аскорбиновая кислота	100 мг/л
Лимонная кислота	150 мг/л

Как показано в "C" на Фиг.1(а), после того как гомогенная клеточная линия была специфично индуцирована только в камбии путем воздействия осмотического стресса и среды 2, гомогенную клеточную линию пересевали в среду 3, состав которой приведен в Таблице 7. В результате, выделенная из камбия гомогенная клеточная линия, обладающая способностью к делению, постоянно делилась и пролиферировала, и через около 10-20 суток культивирования, выделенную из камбия гомогенную клеточную линию, обладающую способностью к делению, можно было изолировать. Изолированную таким образом гомогенную клеточную линию, выделенную из камбия женьшеня дикого типа, снова подвергали пролиферации путем культивирования в той же среде. "D" на Фиг.1(а) показывает, что выделенная камбий-специфичная гомогенная клеточная линия подверглась пролиферации в среде 3.

1-5: Изучение характеристик изолированной клеточной линии

Гомогенную клеточную линию, выделенную из камбия женьшеня дикого типа, помещали в колбу, содержащую жидкую среду, представленную в Таблице 8. Затем, клеточную линию культивировали в ротационном шейкере при 100 rpm в условиях темноты при температуре 25±1°С. В данном документе, интервал между пересевами составлял 2 недели, при котором культивируемые клетки всегда сохраняли высокую жизнеспособность в экспоненциальной фазе роста. При этом каллус, полученный из котиледона женьшеня, также культивировали в среде 4, представленной в Таблице 8, и культивированный каллус сравнивали с выделенной из камбия женьшеня дикого типа гомогенной клеточной линией настоящего изобретения.

Таблица 8.

Суспензионная среда для Panax ginseng (среда 4)

Компон

Патент 2500386