Способ определения минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности в сыворотке или плазме крови человека

Способ определения минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности в сыворотке или плазме крови человека

Реферат

Изобретение относится к клинической биохимии, и может быть использовано в лабораторной диагностике для определения атерогенности крови по уровню содержания минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности (ММ-ЛПНП) в сыворотке или плазме крови человека.

ММ-ЛПНП представляют собой слабо модифицированные ЛПНП, отличающиеся от нативных ЛПНП по физико-химическим свойствам, но сохраняющие еще сродство к рецептору ЛПНП и не узнающиеся скавенджер-рецепторами. Физиологическая модификация ЛПНП наблюдается при различных реакциях как ферментативных, так и неферментативных. Продукты всех этих реакций могут быть названы как ММ-ЛПНП, хотя окисление может не быть первичным событием при многих этих модификациях. Липидная пероксидация является первичной реакцией только при липооксигеназном или свободно-радикальном путях окисления ЛПНП. Гидролиз сфингомиелина при помощи секреторной сфингомелиназы (СМ-азы) может наблюдаться при острофазной реакции, когда уровень СМ-азы повышается в плазме или при участии СМ-азы, свойственной для ЛПНП [23, 6]. Гидролиз сфингомиелина до церамида повышает оксидативную чувствительность ЛПНП [16], а также приводит к формированию агрегированного ЛПНП, который превосходит окисленный ЛПНП в способности поглощаться макрофагами с образованием «пенистых» клеток [15]. Действие Фосфолипазы-А2 на ЛПНП продуцирует лизофосфатидилбогатые ЛПНП, которые обладают хемотаксической и провоспалительной активностями. Тертовым В.В. и соавторами (1996) обнаружен в крови десиалированный ЛПНП, который образуется либо при действии фермента сиалидазы, либо в реакциях, опосредованных свободными радикалами. Показано также, что десиалированные ЛПНП запускают образование «пенистых» клеток [18]. Гликирование ЛПНП, наблюдающееся при диабете, также повышает как образование «пенистых» клеток, так и подверженность ЛПНП к окислению [3]. Миелопероксидаза-опосредованное окисление ЛПНП приводит первично к модификации тирозиновых остатков в апоВ белка в составе ЛПНП [5].

Наиболее убедительные доказательства участия окисленных ЛПНП (оЛПНП) в развитии атеросклероза подтверждаются следующими данными:

1) о ЛПНП обнаружены в атеросклеротической бляшке, но не в нормальных артериях [14];

2) аутоантитела, образованные против неоэпитопов о ЛПНП, присутствуют в крови и титр этих антител коррелирует с тяжестью атеросклероза и является маркером заболевания [9, 19];

3) исследования на животных моделях атеросклероза показали протективный эффект антиоксидантов (витамин Е, пробукол, аналоги пробукола и KoQ), хотя клинические испытания на людях с использованием витамина Е потерпели неудачу [22];

4) генетический нокаут различных скавенджер-рецепторов на мышах приводит к значительному подавлению развития атеросклероза [21, 11-13], подтверждая роль этих рецепторов и их лигандов (оЛПНП) в развитии повреждения артерий;

5) истощение 12/15-липооксигеназы, который является физиологическим окисляющим агентом ЛПНП, замедляет развитие атеросклероза [7], в то время как его повышенная экспрессия ускоряет атеросклероз [4], показывая тем самым роль окислительной модификации ЛПНП;

6) исследования Като и соавт.(2009) у апоЕ-дефицитных мышей показали, что повышение плазменного уровня оЛПНП наблюдается до развития повреждений артерий [10];

7) показано, что специфическое снижение плазменного уровня оЛПНП путем экспрессии скавенджер-рецептора (LOX-1) в печени предотвращает прогрессирование атеросклеротического повреждения у апоЕ-дефицитных мышей даже при наличии тяжелой гиперхолестеролемии [8].

Таким образом, учитывая важную патогенетическую роль оЛПНП при атеросклерозе, остается актуальной разработка простых, доступных для клинических лабораторных исследований способов определения ММ-ЛПНП.

В настоящее время в клинической лабораторной практике отсутствуют доступные для рутинных исследований реагенты и методы определения содержания атерогенных минимально модифицированных липопротеинов в сыворотке крови человека.

Известен способ определения атерогенности сыворотки крови по ее способности вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках [17]. Недостатком этого способа являются трудоемкость, высокая себестоимость, сложность и длительность проведения исследования.

Наиболее интенсивно разрабатываемыми методами определения мЛПНП являются иммуноферментные тесты с использованием моноклональных антител к in vitro модифицированным ЛПНП [20]. Многостадийность, трудоемкость и длительность иммуноферментного теста, выявление только эпитопов, характерных для искусственно модифицированных липопротеинах низкой плотности (неспецифичность), а также высокая себестоимость реагентов затрудняет использование их в рутинных исследованиях.

Наиболее близким техническим решением является определение множественно модифицированных липопротеинов низкой плотности (ммЛПНП) в плазме крови человека путем обработки ее буфером, содержащим поливинилпирролидон 12600±2700, и последующей визуальной регистрацией помутнения по сравнению с контрольной пробой. Наличие помутнения, обусловленной агрегацией ммЛПНП, свидетельствует об атерогенности крови [2]. Для инструментального подтверждения наличия атеросклероза были проведены исследования импульсно-волновым доплеровским сканированием сонных артерий у относительно здоровых молодых людей с повышенным уровнем ммЛПНП в возрасте до 40 лет с нормальным уровнем холестерина и триглицеридов. В результате ультразвукового исследования у 57% было выявлено утолщение интимо-медиального слоя сонных артерий и подтвержден инструментально диагноз атеросклероз брахиоцефальных артерий. У остальных (43%) данные параметры оставались в пределах нормальных величин и свидетельствовали о том, что повышение уровня ммЛПНП предшествует морфологическим изменениям (утолщению) интимо-медиального слоя в обследованных артериях. [1].

Недостатком разработанного ранее метода является то, что способ выявляет только ммЛПНП, которые быстро элиминируются из кровотока при взаимодействии со скавенджер-рецепторами. А также ммЛПНП связываются с аутоантителами к ним с образованием иммунных комплексов, которые при условиях 8,9% ПВП не агрегируют и у некоторых больных с тяжелым атеросклерозом данный тест дает отрицательный результат.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала реагентов для определения атерогенности крови по агрегации ММ-ЛПНП, маркера как раннего атеросклероза (до образования ммЛПНП), так и атеросклероза, характеризующегося повышенным уровнем аутоантител к ммЛПНП и наличием клиники атеросклероза у больных, подтвержденых инструментальными методами исследования.

Поставленная задача решается путем добавления к сыворотке крови человека буферного раствора, содержащего поливинилпирролидон 12600±2700 (концентрация в системе от 11,3% до 14,2%, определения степени помутнения турбидиметрическим методом и расчета содержания ММ-ЛПНП по приведенной ниже формуле.

Техническим результатом, получаемым при реализации изобретения, является расширение арсенала реагентов для определения атерогенности крови с целью ранней биохимической диагностики субклинического атеросклероза, а также контроля эффективности терапии клинического атеросклероза.

Этот результат достигается тем, что определение атерогенности сыворотки или плазмы крови человека проводят путем обработки ее буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП), инкубирования пробы в течение 10 мин при комнатной температуре, измерения светопоглощения в опытной и контрольной пробах, вычисления разности между ними, при этом при величине разности более 10 ЕД, констатируют атерогенность крови за счет повышенного уровня ММ-ЛПНП.

Определение атерогенности крови человека по агрегации минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности (ММ-ЛПНП) с использованием поливинилпирролидона (ПВП) 12600±2700 (ООО АК «Синтвита», Россия).

Буфер-1 для агрегации ММ-ЛПНП готовят растворением 15 г ПВП 12600±2700 в 100 мл 0,01М Трис-HCl-буфера, рН 7,4, содержащего 0,15 М NaCl. Буфер-К в отличие от Буфера-1 не содержит ПВП. К буферу-1 добавляют сыворотку крови, тщательно перемешивают, инкубируют, измеряют степень помутнения спетрофотометрически и рассчитывают уровень содержания [ММ-ЛПНП] по формуле:

[ММ-ЛПНП], ЕД=[E_O-Е_К]×100,

где:

[ММ-ЛПНП] - уровень содержания минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности в опытной пробе в единицах (ЕД);

Е_О - оптическая плотность опытной пробы, сыворотки с соответствующим количеством Буфера-1, при длине волны 450 нм, ед. опт.пл.;

Е_K - оптическая плотность контрольной пробы при длине волны 450 нм, сыворотки с соответствующим количеством Буфера-К, ед. опт.пл.;

100 - коэффициент перерасчета в единицы ЕД.

Пример 1. Определение оптимальной концентрации ПВП 12600±2700 (ООО АК «Синтвита», Россия) для агрегации ММ-ЛПНП в пулированной сыворотке крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. К 50 мкл пулированной сыворотки крови от 10 больных сердечно-сосудистыми заболеваниями добавляют 100-900 мкл Буфера-1, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин в 9 луночных кюветах биохимического анализатора FP-901 ("Labsystem", Финляндия). Степень помутнения определяют турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка используют пробы сыворотки с соответствующим количеством Буфера-К. Рассчитывают уровень содержания ММ-ЛПНП по формуле, приведенной выше. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, с увеличением концентрации ПВП 12600±2700 в инкубационной системе с 11,3% до 14,2% наблюдается агрегация MM-ЛПНП и помутнение раствора. Максимальная агрегация ММ-ЛПНП достигается при концентрации 12,5%, т.е. при объемном соотношении сыворотка:Буфер-1 (1:5). При дальнейшем увеличении концентрации ПВП свыше 12,5% наблюдается снижение степени агрегации.

Пример 2. Определение агрегации нашивных липопротеинов низкой и очень низкой плотности в пулированной сыворотке здоровых доноров в зависимости от концентрации ПВП 12600±2700 (ООО АК «Синтвита», Россия).

Для подтверждения агрегации именно ММ-ЛПНП сыворотки больных атеросклерозом в 12,5% растворе ПВП 12600±2700 нами была исследована пулированная сыворотка от 10 здоровых доноров при условиях, описанных выше. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Добавление к пулированной сыворотке крови здоровых доноров возрастающих концентрации Буфера-1, содержащего 15% ПВП 12600±2700, приводит к агрегации нативных липопротеинов низкой и очень низкой плотности при конечной концентрации ПВП в системе до 12,0%. При дальнейшем увеличении концентрации ПВП свыше 12,5% в системе наблюдается диссоциация образовавшихся агрегатов нативных липопротеинов низкой и очень низкой плотности и характеризуется снижением мутности раствора сыворотки. При концентрации ПВП от 12,5% и до 14,2% в системе оптическая плотность раствора сыворотки практически не меняется. Полученные данные свидетельствуют о том, что при концентрации ПВП 12600±2700 выше 12,5% в системе (от 12,5% до 14,2%) в пулированной сыворотке крови здоровых доноров агрегации нативных липопротеинов низкой и очень низкой плотности практически не наблюдается.

Пример 3. Определение уровня содержания ММ-ЛПНП в сыворотке крови у больных с атеросклерозом каротидных артерий, подтвержденных инструментальными методами. Проведены исследования содержания ММ-ЛПНП предлагаемым способом и прототипом в сыворотке 60 неврологических больных с атеросклерозом каротидных артерий, подтвержденных инструментальными методами. По предлагаемому способу к 50 мкл исследуемой сыворотки добавляли 275 мкл Буфера-1, тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин в 9-ти луночных кюветах биохимического анализатора FP-901 (Labsystem, Финляндия). В прототипе использовали 10% ПВП 12600 (ООО АК «Синтвита», Россия) в 0,01 М Трис-HCl-буфере, содержащем 0,15 М NaCl, рН 7,4, как описано в работе [2]. Степень помутнения определяли турбидиметрически при длине волны 450 нм. В качестве бланка использовали пробы сыворотки с соответствующим количеством Буфера-К. Рассчитывали уровень содержания ММ-ЛПНП и ммЛПНП по формуле, приведенной выше. Полученные результаты по определению ММ-ЛПНП и ммЛПНП приведены в таблице 3.

Таким образом, из приведенных в таблице 3 данных видно, что только у 43% обследованных больных с атеросклерозом каротидных артерий, подтвержденных инструментальными методами выявлен повышенный уровень ммЛПНП. В то время как определение атерогенности крови путем агрегации ММ-ЛПНП у этих же больных в 93% случаев дает положительный результат. Нормальный уровень ММ-ЛПНП у 4 больных, возможно, связано с приемом препаратов снижающих уровень холестерина и в конечном итоге с низким уровнем ЛПНП. Сравнительное исследование содержания ММ-ЛПНП в сыворотке и в плазме крови показало, что ММ-ЛПНП агрегируют как из сыворотки, так и из плазмы больных, что свидетельствует о специфичности процесса агрегации минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности. Причем процент выявления ММ-ЛПНП как в сыворотке, так и в плазме крови одинаков, соответственно 93% и 95%.

Предлагаемый способ отличается простотой, включает всего 2 операции: смешивание сыворотки или плазмы крови человека с раствором ПВП и регистрацию мутности. Для приготовления среды необходимы широко распространенные реактивы: ПВП, NaCl и трис-HCl. Способ позволяет регистрировать наличие ММ-ЛПНП непосредственно в сыворотке или плазме без предварительного ее фракционирования. Способ быстр (10 мин на 1 анализ), легко может быть адаптирован для биохимических автоматических анализаторов. Использование простого и быстрого в осуществлении способа определения атерогенности крови позволяет проводить скрининговые обследования с целью выявления наличия атеросклеротического процесса на доклинической стадии и диспансеризации населения. Формирование группы риска по атеросклерозу (повышенный уровень ММ-ЛПНП) позволит установить индивидуальную причину патологического процесса и проводить этиотропную терапию. Исследования уровня содержания ММ-ЛПНП в крови больного с атеросклерозом в условиях клиники позволит контролировать эффективность проводимой терапии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Шойбонов Б.Б. Экспресс-определение модифицированных липопротеинов // Кардиология Беларуси. - 2011. - Т.5, №18. - С.49-50.

2. Шойбонов Б.Б., Баронец В.Ю., Панченко Л.Ф., Кубатиев А.А. Способ экспресс-определения атерогенности крови // Патент РФ №2437098 от 20Л2.2011 г.Бюл.№35.

3. Graier W.F. and Kostner G.M. Glycated low-density lipoprotein and atherogenesis: the missing link between diabetes mellitus and hypercholesterolaemia? // Eur J Clin Invest. - 1997. - V.27. - P.457-459.

4. Harats D., Shaish A., Geoege J., at al. Overexpression of 15-lipooxygenase in vascular endothelium accelerates early atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2000. - V.20. - P.2100-2105.

5. Heinecke J.W. Oxidized amino acids: Culprits in human atherosclerosis and indicators of oxidative stress //Free Radical Biol Med. - 2002. - V.32. - P. 1090-1101.

6. Holopainen J.M., Medina O.P., Metso A.J., and Kinnunen P.K. Sphingomyelinase activity associated with human plasma low density lipoprotein. Possible functional implications // J Biol Chem. - 2000. - V. 275.-P.16484-16489.

7. HuoY., Zhao L., Hyman M.C., at al. Critical role of macrophage 12/15-lipooxygenese for atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice // Circulation. - 2004. - V. 110. - P.2024-2031.

8. Ishigaki Y., Katagiri H., Gao J., at al. Impact of plasma oxidized low-density lipoprotein removal on atherosclerosis // Circulation. - 2008. - V. 118. - P.75-83.

9. Itabe H., Mori M., Higashi Y., and Takano T. Minimally modified LDL is an oxidized LDL enriched with oxidized phosphatidylcholines // J Biochem. - 2003. - V.134. - P.459-465.

10. Kato R., Mori C, Kitazato K., at al. Transient increase in plasma oxidized LDL during the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2009. - V.29. - P.33-39.

11. Kuchibhotla S., Vanegas D., Kennedy D.J., at al. Absence of CD36 protects against atherosclerosis in ApoE knock-aut mice with no additional protection provided by absence of scavenger receptor AI/II // Cardiovasc Res. - 2008. - V.78. - P.185-196.

12. Manning-Tobin J.J., Moore K.J., Seimon T.A., at al. Loss of SA-A and CD36 activity reduces atherosclerotic lesion complexity without abrogating foam cell formation in hyperlipidemic mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2009. - V.29. - P.19-26.

13. Mehta J.L., Sanada N., Ни C.P., at al. Deletion of LOX-1 reduces atherogenesis in LDLR knockout mice fed high cholesterol diet // Circ Res. - 2007. - V.100. - P.1634-1642.

14. Rosenfeld M.E., Palinski W., Yla-Herttuala S. et al. Distribution of oxidation specific lipid-protein adducts and apolipoprotein В in atherosclerotic lesions of varying severity from WHHL rabbits // Atherosclerosis. - 1990. - V.10. -P.336-349.

15. Schissel S.L., Tweedie-Hardman J., Rapp J.H., et al. Rabbit aorta and human atherosclerostic lesions hydrolyze the sphingomyelin of retained low-density lipoprotein. Proposed role for arterial wall sphingomyelinase in subendothelial retention and aggregation of atherogenic lipoproteins // J Clin Invest. - 1996. - V.98. - P. 1455-1464.

16. Subbaiah P.V., Subramanian V.S., and Wang K. Novel physiological functions jf sphingomyelin in plasma. Inhibition of lipid peroxidation in low density lipoproteins // J Biol Chem. - 1999. - V. 274. - P.36409-36414.

17. Tertov V.V., Orekhov A.N., Nikitina N.A. et al. Peritoneal macrophages: a model for detecting atherogenic potential in patiens' blood serum // Ann. Med. - 1989. - V. 21(6). - P.455-459.

18. Tertov V.V., Sobenin I.A., and Orekhov A.N. Similarity between naturally occurring modified desialated, electronegatine and aortic low density lipoprotein // Free Radic Res. - 1996. - V.25. - P.313-319.

19. Tsimikas S. Oxidative biomarkers in the diagnosis and prognosis of cardiovascular disease //Am J Cardiol. - 2006. - V.98. - P. 9P-17P.

20. Virella G., Derrick MB., Pate V. et al. Development of capture assay for different modification of human low-density lipoprotein // Clinical and Diagnostic Lab. Immunol. - 2005. - V. 12, №1. - P.68-75.

21. de Winther M.P.J., van Dijk K.W., Havekes L.M., and Hofker M.H. Macrophage scavenger receptor Class A: A multifunctional receptor in a Atherosclerosis // Artherioscler Thromb Vase Biol. - 2000. - V.20. - P.290-297.

22. Witztum J.L. and Steinberg D. The oxidative modification hypothesis of atherosclerosis: Does it hold for humans? // Trends Cardiovasc Med. - 2001. - V.ll. - P. 93-102.

23. Wong M-L., Xie В., Beatini N et al. Acute systemic inflammation up-regulates secretory sphingomyelinase in vivo: A possible link between inflammatory cytokines and atherogenesis // Proc Natl Acad Sci. - 2000. - V. 97. - P. 8681-8686.

Таблица 1
Влияние ПВП 12600±2700 на агрегацию ММ-ЛПНП в пулированной сыворотке крови больных с атеросклерозом коронарных сосудов
№	Серии экспер.	Сыв., мкл	Буфер-1, мкл	Буфер-К, мкл	%ПВП в системе	А450	[ММ-ЛПНП], ЕД.
1	Опыт Бланк	5050	100	100	11,30%	0,6430,1	54,3
2	Опыт Бланк	5050	200	200	12,00%	0,7560,1	65,6
3	Опыт Бланк	5050	250	250	12,50%	0,8020,1	70,2
4	Опыт Бланк	5050	300	300	12,90%	0,7750,1	67,5
5	Опыт Бланк	5050	400	400	13,30%	0,5470,1	44,7
6	Опыт Бланк	5050	500	500	13,60%	0,4370,1	33,7
7	Опыт Бланк	5050	600	600	13,90%	0,4030,1	30,3
8	Опыт Бланк	5050	700	700	14,00%	0,3790,100	27,9
9	Опыт Бланк	5050	800	800	14,10%	0,3770,100	27,7
10	Опыт Бланк	5050	900	900	14,20%	0,3620,100	26,2

Таблица 2
Влияние ПВП 12600 на агрегацию нативных липопротеинов в пулированной сыворотке крови здоровых доноров
№	Серии экспер.	Сыв., мкл	Буфер-1, мкл	Буфер К	% ПВП в системе	А450	[ММ-ЛПНП], ЕД.
1	Опыт	50	100	-	11,3	0,412	21,1
	Бланк	50	-	100	0%	0,099
2	Опыт	50	200	-	12,0	0,438	16,2
	Бланк	50	-	200	0%	0,096
3	Опыт	50	250	-	12,5	0,232	9,8
	Бланк	50	-	250	0%	0,092
4	Опыт	50	300	-	12,9	0,232	9,8
	Бланк	50	-	300	0%	0,092
5	Опыт	50	400	-	13,3	0,192	9,1
	Бланк	50	-	400	0%	0,101
6	Опыт	50	500	-	13,6	0,19	9,0
	Бланк	50	-	500	0%	0,100
7	Опыт	50	600	-	13,9	0,2	9,2
	Бланк	50	-	600	0%	0,100
8	Опыт	50	700	-	14,0	0,2	9,2
	Бланк	50	-	700	0%	0,100
9	Опыт	50	800	-	14,1	0,203	9,7
	Бланк	50	-	800	0%	0,100
10	Опыт	50	900	-	14,2	0,205	9,8
	Бланк	50	-	900	0%	0,100

Таблица 3
Определение уровня ммЛПНП и ММ-ЛПНП в сыворотке или в плазме крови больных с инструментально подтвержденным атеросклерозомкаротидных артерий
Сыворотки	n	ммЛП (>10ЕД)	ММ-ЛПНП, (>10ЕД)
больных с атеросклерозом каротидных артерий	60	26	56
Плазма крови больных с атеросклерозом каротидных артерий	20	8	19

Способ определения минимально модифицированных липопротеинов низкой плотности (ММ-ЛПНП) в сыворотке (плазме) крови человека путем обработки буфером, содержащим поливинилпирролидон (ПВП) с последующей турбидиметрической регистрацией смеси, отличающийся тем, что обработку сыворотки или плазмы крови человека ведут раствором ПВП-12600 в 0,01М Трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15М NaCl, при концентрации ПВП-12600 в пробе от 11,3% до 14,2%, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, измеряют светопоглощение в опытной и контрольной пробах, вычисляют разность между ними и при величине разности более 10ЕД. констатируют атерогенность крови у обследуемого человека за счет повышенного уровня ММ-ЛПНП.