Рекомбинантный вирус классической чумы свиней (csfv), содержащий модифицированный белок е2, и способы создания указанного рекомбинантного csfv

Рекомбинантный вирус классической чумы свиней (csfv), содержащий модифицированный белок е2, и способы создания указанного рекомбинантного csfv

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к заболеваниям животных. Более конкретно, изобретение относится к рекомбинантному вирусу классической чумы свиней (CSFV), содержащему модифицированный белок Е2. Кроме того, изобретение относится к вакцине, содержащей указанный рекомбинантный CSFV, который дает возможность дифференцировать зараженное животное от вакцинированного животного, и способам создания указанного рекомбинантного CSFV.

Вирус классической чумы свиней (CSFV) представляет собой покрытый оболочкой, содержащий плюс-цепь РНК вирус, который совместно с вирусом диареи крупного рогатого скота (BVDV) и вирусом пограничной болезни овец (BDV) составляют род Pestivirus семейства Flaviviridae (Pringle, 1998. Arch Virol 143: 203-10). Заражение CSFV поголовья домашних свиней может привести к огромным экономическим потерям (Terpstra and de Smit. 2000. Vet Microbiol 77: 3-15). Вакцинация CSFV, аттенуированным в результате многократных пассажей в кроликах и клеточной культуре, так называемым «Китайским» или «К»-штаммом, дает быстро возникающий и пожизненный иммунитет против вирулентного CSFV. К-штамм вируса успешно используется во всем мире и часто упоминается как наиболее эффективная из когда-либо полученных ветеринарных вакцин. Однако эта вакцина не обеспечивает серологической дифференциации инфицированных и вакцинированных животных (DIVA). Это является крупным недостатком, поскольку невозможность детекции CSF-инфицированных животных в вакцинированной популяции может наложить серьезные торговые ограничения.

На практике CSF можно диагностировать методом ELISA, с помощью которого детектируют антитела к структурному гликопротеину E^rns или E2. Было разработано несколько вакцин-кандидатов, потенциально удовлетворяющих требованиям DIVA при условии проведения соответствующих методов ELISA, которые представляют собой варианты, начиная от субъединичных вакцин (Hulst et al., 1993. J Virol 67: 5435-42) до живых аттенуированных вакцин (van Gennip et al., 2000. Vaccine 19: 447-59; van Zijl et al., 1991. J Virol 65: 2761-2765) и вакцин на основе репликонов (van Gennip et al., 2002. Vaccine 20: 1544-56; Widjojoatmodjo et al., 2000. J Virol 74: 2973-2980).

Коммерчески доступная DIVA-вакцина против CSF основана на продуцируемом в бакуловирусной системе белке E2, которая сопровождается серологическим тестом, детектирующим антитела, направленные против E^rns (Van Aarle, 2003. Dev Biol Stand Basel 114: 193-200). Хотя эта вакцина обеспечивает защиту от CSF, она является менее эффективной, чем вакцина на основе штамма К в отношении как начала, так и продолжительности иммунитета (van Oirschot, 2003. Vet Microbiol 96: 367-84). Более того, ELISA-тесты на E^rns, которые сопровождают эту вакцину, также детектируют другие вирусы из рода Pestivirus (а именно, BVDV и BDV). Поэтому их использование не рекомендуется в регионах, где циркулируют эти вирусы (2003/265/EC; SANCO/10809/2003).

Кроме того, ранее было обнаружено, что чувствительность ELISA-тестов на E^rns является недостаточной для диагностики отдельных животных, и поэтому эти анализы используются только для стада с достаточно большим числом животных (Blome et al., 2006. Rev Sci Tech 25: 1025-38; Floegel-Niesmann, 2003. Dev Biol 114: 185-91). Это объясняет, почему для сопровождения DIVA-вакцины, как правило, ELISA-тесты на Е2 являются более предпочтительными, чем тесты на E^rns.

Белок Е2 содержит два главных антигенных домена, а именно В/С-домен и А-домен (van Rijn et al., 1993. J Gen Virol 74: 2053-60; Wensvoort, 1989. J Gen Virol 70: 2865-76). Домен А, который расположен между аминокислотами 766 и 866 полипротеина CSFV, подразделяется на субдомены А1, А2 и А3 (Wensvoort, 1989. J Gen Virol 70: 2865-76). Несмотря на то что домен А1 является основной мишенью нейтрализующих антител, его структура сохранялась неизменной на протяжении эволюции. Фактически, вследствие консервативности его последовательности и его иммунодоминирования домен А1 является основной мишенью в ELISA-тестах на Е2.

Хотя вспышки CSF в настоящий момент контролируются карантинными ограничениями и убоем подозрительного поголовья, существует острая необходимость введения более гуманных и более экономичных оперативных стратегий для контроля вспышек CSF в будущем. Поэтому срочно необходима DIVA-вакцина, сопровождаемая надежным и CSFV-специфичным методом ELISA.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу классической чумы свиней (CSFV), содержащему делецию по меньшей мере одной аминокислоты в «TAVSPTTLR»-домене белка Е2, соответствующему положениям 829-837 в родительском полипротеине CSFV.

Под полипротеином понимается примерно 4000-аминокислотный гипотетический полипротеин, который образуется в результате трансляции вирусной РНК. Указанный полипротеин процессируется с образованием конечных продуктов расщепления N^Pro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B.

Белок Е2 CSFV содержит недавно идентифицированный эпитоп, который включает аминокислотную последовательность TAVSPTTLR (остатки 829-837 в полипротеине CSFV; для аминокислот используется однобуквенный код) (Lin et al., 2000. J Virol 74: 11619-25). Этот эпитоп имеет все отличительные признаки А1-домена (являясь иммунодоминантным, эволюционно консервативным, специфичным для CSFV и мишенью для нейтрализующих антител). Сравнение последовательностей в области TAVSPTTLR-домена среди Е2-белков из различных штаммов пестивирусов указывает на то, что последовательность TAVSPTTLR является высококонсервативной среди штаммов CSFV и высоковариабельной среди штаммов BVDV и BDV (Lin et al., 2000. J Virol 74: 11619-25).

Антитела, особенно моноклональные антитела, используемые в специфичных к Е2 методах анализа ELISA, которые узнают TAVSPTTLR-домен, не имеют перекрестной реакции с другими членами рода пестивирусов, и поэтому их можно использовать в областях, где циркулируют эти другие вирусы. Указанные антитела не будут узнавать рекомбинантный CSFV по изобретению, содержащий делецию в указанном домене белка Е2.

Таким образом, указанный рекомбинантный вирус дает возможность дифференциации животных, инфицированных рекомбинантным вирусом, от животных, инфицированных CSFV дикого типа, и от животных, которые не были инфицированы и/или которые не были вакцинированы. Кроме того, использование указанного рекомбинантного вируса позволит использовать пептидный диагностический тест для установления отличий между этими животными.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному вирусу классической чумы свиней (CSFV), содержащему делецию по меньшей мере одной аминокислоты в «TAVSPTTLR»-домене CSFV или его эквиваленте. Эквивалентный домен представляет собой домен в области Е2, в котором одна аминокислота заменена на другую аминокислоту, такую как аминокислота, принадлежащая к той же группе, то есть ароматическая аминокислота, которая заменена другой ароматической аминокислотой, или алифатическая аминокислота, которая заменена другой алифатической аминокислотой.

Указанный родительский геном предпочтительно включает по существу полный вирусный геном из штамма CSFV, предпочтительно природного или рекомбинантного аттенуированного штамма CSFV. Термин родительский геном включает молекулу нуклеиновой кислоты, такую как молекула РНК и/или ее кДНК-копия.

Термин «делеция по меньшей мере одной аминокислоты», используемый в описании, означает удаление по меньшей мере одной аминокислоты. Термин «делеция» не охватывает удаления по меньшей мере одной аминокислоты, за которым следует встраивание другой по меньшей мере одной аминокислоты в то же положение. Поэтому используемый в настоящем описании термин «делеция» не охватывает замену аминокислоты на другую аминокислоту.

Указанная рекомбинантная молекула кДНК предпочтительно содержит по существу полный геном вируса классической чумы свиней (CSFV), при этом указанный геном кодирует белок Е2, содержащий делецию по меньшей мере одной аминокислоты в консервативном «TAVSPTTLR»-домене, соответствующем положениям 829-837 в полипротеине CSFV. Термин «по существу полный» указывает на то, что указанный вирус, получаемый на основе указанного генома, способен инфицировать соответствующую клетку или клеточную линию и может воспроизводиться в соответствующей клетке или клеточной линии. «По существу полный» вирусный геном предпочтительно представляет собой геном, способный к репликации. Более предпочтительным является инфицирующий, способный к репликации и упаковке вирусный геном. Кроме того, также предпочтительно, чтобы рекомбинантный вирус классической чумы свиней (CSFV) содержал «по существу полный» вирусный геном, предпочтительно способный к репликации геном, или, более предпочтительно, инфицирующий, способный к репликации и упаковке вирусный геном.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения делеция по меньшей мере одной аминокислоты в домене TAVSPTTLR рекомбинантного CSFV по изобретению включает делецию центрального пролина указанного «TAVSPTTLR»-домена.

Пролин является уникальным среди 20 стандартных аминокислот в том, что имеет боковую цепь, замкнутую на каркасный атом азота. Это ограничивает конформацию указанного пролина, а также остатка, предшествующего ему. Кроме того, пролин может действовать как конформационный «переключатель», обеспечивая возможность частям белка принимать альтернативные конформации. Замена центрального пролина в домене TAVSPTTLR, по этой причине, не только меняет первичную последовательность, но также изменяет конформацию иммуногенного TAVSPTTLR-домена. Белок Е2, содержащий делецию центрального пролина в TAVSPTTLR-домене, не будет распознаваться антителами, которые узнают указанный домен в белке Е2.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления измененный белок Е2 рекомбинантного CSFV по изобретению содержит делецию по меньшей мере двух аминокислот в домене TAVSPTTLR. Делеция двух аминокислот включает делецию TA, AV, VS, SP, PT, TT, TL и LR соответственно в TAVSPTTLR-домене E2. Наиболее предпочтительной делецией двух аминокислот является делеция остатков PT в положениях 833-834 в домене TAVSPTTLR.

В дополнительном предпочтительном варианте осуществления измененный белок Е2 рекомбинантного CSFV по изобретению содержит делецию по меньшей мере трех аминокислот в указанном TAVSPTTLR-домене, например трех аминокислот, четырех аминокислот, пяти аминокислот, шести аминокислот, семи аминокислот, восьми аминокислот или девяти аминокислот. Еще более предпочтительный белок Е2 содержит делецию аминокислотных последовательностей VSP, SPT, AVSP или SPTTL.

Изобретение дополнительно относится к рекомбинантному CSFV по изобретению, включающему по меньшей мере одно дополнительное изменение генома родительского CSFV. Вирусы, содержащие делецию в указанном консервативном TAVSPTTLR-домене, менее эффективно инфицируют клетки по сравнению с родительским вирусом и/или менее эффективно реплицируются в зараженных клетках, что приводит к более низкому титру по сравнению с родительским вирусом. Продолжительное пассирование клеток, зараженных вирусом, содержащим делецию в консервативном TAVSPTTLR-домене, давало «восстановленный» вирус, который более эффективно инфицировал клетки и/или реплицировался в клетках, приводя к титрам, сравнимым с титрами родительского вируса. В восстановленном вирусе введены одно или более дополнительных изменений относительно родительского генома, которые компенсируют потерю приспособляемости вируса вследствие делеции в консервативном TAVSPTTLR-домене.

В одном варианте осуществления изобретения указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение представляет собой молчащую мутацию, которая меняет геном вируса, но не приводит к изменению аминокислоты. Указанная молчащая мутация присутствует в некодирующей части вирусного генома или кодирующей части вирусного генома, например в части вирусного генома, кодирующей N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2, и/или в части, кодирующей неструктурные белки. Молчащая мутация может вносить вклад в восстановление приспособляемости измененных вирусов в какой-либо момент в процессе биосинтеза этих вирусов. Не касаясь какой-либо определенной теории, авторы предполагают, что молчащая мутация, например, приводит к повышению стабильности вирусного генома и/или усилению репликации, поскольку указанная молчащая мутация изменяет конформацию вирусной геномной нуклеиновой кислоты. Кроме того, указанная молчащая мутация может привести к чаще встречающемуся кодону. Предпочтительной молчащей мутацией является замена U на С в положении 1549 гена E^RNS.

В дополнительном варианте осуществления изобретения указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение находится в области, кодирующей белок Е1, который, как известно, собирается в соединенные дисульфидными связями гетеродимеры с белком Е2. Таким образом, делеция в консервативном TAVSPTTLR-домене Е2, по меньшей мере частично, компенсируется изменением по меньшей мере одной аминокислоты в белке Е1. В дополнительном варианте осуществления изобретения указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение находится в области, кодирующей белок N^pro, C, E^rns, E1 или E2. Указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение предпочтительно включает по меньшей мере два изменения в различных областях, выбранных из областей, кодирующих белки N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2, или в пределах одной области, кодирующей белок N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2. Указанные по меньшей мере два дополнительных изменения предпочтительно включают по меньшей мере одну молчащую мутацию. Предпочтительной молчащей мутацией является замена U на С в положении 1549 гена E^RNS.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение приводит к введению дополнительного сайта N-гликозилирования в белке Е2. Сайт N-гликозилирования по дополнительному положению в белке Е2, вероятно, компенсирует либо напрямую, либо через свою функцию в качестве якорного сайта для углеводной части, потерю приспособляемости, обусловленной указанной делецией в эпитопе TAVSPTTLR. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный сайт N-гликозилирования вводится в результате изменения домена LFDGTNP (аминокислотные положения 772-778), такого как, например, замена D на N в положении 774. В качестве альтернативы или в качестве дополнения сайт N-гликозилирования вводится в результате замены А на N в положении 830 в белке Е2.

В результате указанного дополнительного изменения предпочтительно меняется кодон, занимающий положения 1547-1549, кодирующий V392 в белке E^rns; кодон, занимающий положения 2273-2275, кодирующий E634 в белке Е1; кодон, занимающий положения 2693-2695, кодирующий D774 в белке Е2; и/или кодон, занимающий положения 2864-2866, кодирующий V831 в белке Е2. Указанное изменение кодона в данных положениях включает либо молчащую мутацию либо включает изменение кодируемой аминокислоты. Предпочтительное по меньшей мере одно дополнительное изменение включает замену валина (V) в положении 831 на глицин (G).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное по меньшей мере одно изменение в родительском геноме приводит к замене S на F в положении 789 и/или к замене А на Т в положении 445. Серин в положении 789 и аланин в положении 445 присутствуют во всех вирусах К-штамма и относятся к лапинизированным штаммам CSFV, в то время как фенилаланин в положении 789 и треонин в положении 445 консервативны в вирулентных штаммах CSFV. Хотя история создания К-штамма вируса полностью не известна, ясно, что аттенуированный вирус был получен пассированием в кроликах несколько сотен раз, для чего могли быть выгодными S в положении 789 и A в положении 445. Замена S на F в положении 789 и замена А на Т в положении 445, по-видимому, выгодна для размножения вируса, содержащего делецию в эпитопе TAVSPTTLR, в то время как они могут быть незначащими для вируса, содержащего эпитоп TAVSPTTLR.

В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному CSFV, содержащему делецию Р в положении 883 и молчащую замену. Предпочтительной молчащей заменой является замена U на С в положении 1549 гена E^RNS. Другой предпочтительный рекомбинантный CSFV содержит делецию Р в положении 833 и замену S на F в положении 789 и/или замену А на Т в положении 445; делецию Р в положении 833 и замену D на N в положении 774, замену V на G в положении 831 и делецию T в положении 834 либо в сопровождении, либо без замены U на C в положении 1549. Наиболее предпочтительный рекомбинантный CSFV содержит делецию пролина и треонина в положениях 833 и 834, соответственно, домена «TAVSPTTLR» белка E2, замену U на C в положении 1549, замену глутаминовой кислоты (Е) на аспарагиновую кислоту (D) в положении 634, замену аспарагиновой кислоты (D) на аспарагин (N) в положении 774 белка Е2 и замену валина (V) на глицин (G) в положении 831.

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному вирусу классической чумы свиней (CSFV), включающему изменение по меньшей мере одной аминокислоты в домене «TAVSPTTLR» (положения 829-837) в белке Е2 родительского полипротеина CSFV, в результате чего указанное изменение включает замену центрального пролина в домене TAVSPTTLR на аспарагин. Было обнаружено, что указанная замена минимизирует или даже ингибирует связывание Е2-специфичных моноклональных антител с измененным белком Е2.

Помимо изменения первичной аминокислотной последовательности, введение указанного аспарагина приводит к введению сайта N-гликозилирования, содержащего консенсусную последовательность гликозилирования [N-x-S/T], в которой х обозначает любую аминокислоту, за исключением Р или D (Kornfeld and Kornfeld, 1985. Annu Rev Biochem 54: 631-64). N-гликозилирование вирусных белков отвечает на иммуногенность, в результате чего введение сайта N-гликозилирования может ограничить как клеточный, так и гуморальный ответ на вирусный белок. Поэтому указанную замену можно использовать для получения рекомбинантного вируса, который позволяет дифференцировать животных, инфицированных вирусом дикого типа, от животных, инфицированных указанным рекомбинантным вирусом.

В одном варианте осуществления изобретения рекомбинантный CSFV, включающий замену центрального пролина в домене TAVSPTTLR на аспарагин, содержит в геноме по меньшей мере одно дополнительное изменение. Предпочтительное по меньшей мере одно дополнительное изменение приводит к дополнительному сайту N-гликозилирования в N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2, и/или в части, кодирующей неструктурные белки. Предпочтительный дополнительный сайт N-гликозилирования присутствует в Е2, например, в пределах TAVSPTTLR-домена или в пределах эпитопа LFDGTNP белка Е2.

Другим предпочтительным по меньшей мере одним дополнительным изменением является молчащая мутация, присутствующая в некодирующей части вирусного генома или в кодирующей части вирусного генома, например в части вирусного генома, кодирующей N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2, и/или в части, кодирующей неструктурные белки. Предпочтительной молчащей мутацией является замена U на С в положении 1549 гена E^RNS.

Еще одно другое предпочтительное по меньшей мере одно дополнительное изменение включает изменение по меньшей мере одной аминокислоты в N^pro, C, E^rns, E1 и/или E2, и/или в части, кодирующей неструктурные белки. Указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение предпочтительно выбрано из молчащей замены, например замены U на С в положении 1549 гена E^RNS, замены S на F в положении 789, замены А на Т в положении 445, замены D на N в положении 774, замены V на G в положении 831 и/или делеции T в положении 834. Еще более предпочтительно, чтобы указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение включало по меньшей мере два дополнительных изменения, выбранные из молчащей мутации, дополнительного сайта N-гликозилирования и/или изменения аминокислоты, в дополнение к замене центрального пролина в домене TAVSPTTLR на аспарагин. Указанные по меньшей мере два дополнительных изменения присутствуют в том же белке или в других белках, выбранных из N^pro, C, E^rns, E1, E2 и неструктурного белка. Предпочтительно, чтобы указанные по меньшей мере два дополнительных изменения присутствовали в том же белке или в различных белках, выбранных из N^pro, C, E^rns, E1 и E2.

В еще одном дополнительном варианте осуществления изобретение относится к рекомбинантному вирусу классической чумы свиней (CSFV), содержащему вставку по меньшей мере одной аминокислоты в домен TAVSPTTLR (занимающий положения 829-837) в белке Е2, кодируемом геномом родительского CSFV. Указанная вставка будет минимизировать или даже ингибировать связывание специфичных к Е2 моноклональных антител с измененным белком Е2. Вставку по меньшей мере одной аминокислоты в «TAVSPTTLR»-домене предпочтительно объединяют по меньшей мере с одним дополнительным изменением, выбранным из молчащей мутации, дополнительного сайта N-гликозилирования и/или замены аминокислоты, или их комбинации, в N^pro, C, E^rns, E1, E2 и неструктурном белке. Указанное по меньшей мере одно дополнительное изменение предпочтительно выбирать из молчащей замены, например замены U на С в положении 1549 гена E^RNS, замены S на F в положении 789, замены А на Т в положении 445, замены D на N в положении 774 и/или замены V на G в положении 831.

Родительский геном рекомбинантного CSFV по изобретению предпочтительно представляет собой геном аттенуированного штамма CSFV.

Аттенуированные штаммы CSFV можно создать мутацией гена E^rns, кодирующего белок с РНКазной активностью (Mayer et al., 2003. Virus Res. 98: 105-16); делецией N^pro из вирулентных штаммов CSFV (Mayer et al., 2004. Vaccine 22: 317-328); объединением мутаций в E^rns и Е2 (van Gennip et al., 2004. J. Virol. 78: 8812-8823); мутацией гена E1 (Risatti et al., 2005. Virology 343: 116-127); и мутацией гена Е2 (Risatti et al., 2007. Virology 364: 371-82).

Предпочтительный аттенуированный штамм CSFV содержит вставку в 3'-концевой некодирующей области. Например, вставка 12 нуклеотидов в 3'-нетранслируемую область приводит к аттенуации CSFV (Wang et al., 2008. Virology 374: 390-8). Указанная вставка предпочтительно содержит последовательность из 12 нуклеотидов, состоящую из 5'-CUUUUUUCUUUU.

Наиболее предпочтительным родительским геномом является геном К-штамма (китайского). Еще более предпочтительным в качестве родительского генома является геном К-штамма Cedipest, который представляет собой вирус К-штамма, адаптированный к суспензионным культурам клеточной линии SK6 почки свиньи (Terpstra et al., 1990. Dtsch Tierarztl Wochenschr. 97:77-9). Свиньи, вакцинированные 400-600 TCID50 штамма Cedipest, полностью защищены от заражения более чем 100 LD50 (для свиней) вирулентного штамма CSFV через 7 дней и через 6 месяцев после вакцинации. Следовательно, изобретение также относится к молекуле кДНК, содержащей копию генома рекомбинантного вируса классической чумы свиней (CSFV), кодирующей измененный «TAVSPTTLR»-домен (положения 829-837) в Е2. Указанная молекула кДНК предпочтительно содержит по существу полный рекомбинантный родительский вирусный геном CSFV по изобретению, причем указанный родительский геном получен из К-штамма (китайского) или, более предпочтительно, из штамма Cedipest. Предпочтительная молекула кДНК содержит копию генома рекомбинантного CSFV, кодирующего белок Е2, содержащий делецию по меньшей мере одной аминокислоты в «TAVSPTTLR»-домене. Изобретение также относится к антителу, предпочтительно моноклональному антителу, которое специфично узнает указанный измененный «TAVSPTTLR»-домен. Изобретение дополнительно относится к конструкции, кодирующей белок, содержащий указанный измененный «TAVSPTTLR»-домен. Изобретение дополнительно относится к белку, содержащему указанный измененный «TAVSPTTLR»-домен, и к пептиду, содержащему указанный измененный «TAVSPTTLR»-домен, и к применению указанных белка или пептида в иммунологическом методе анализа, таком как, например, метод ELISA.

В дополнительном аспекте изобретение относится к живой CSF-вакцине, содержащей рекомбинантный CSFV по изобретению.

Вакцина или иммуноактивная композиция, содержащая рекомбинантный CSFV по изобретению, объединяет быстрое возбуждение иммунного ответа и продолжительность защиты, индуцируемые живым аттенуированным вирусом, с возможностью дифференциации вакцинированных животных и животных, которые заражены вирусом дикого типа, благодаря присутствию отличия, такого как делеция, в консервативном домене TAVSPTTLR белка Е2, который представляет собой важный иммунодоминантный эпитоп белка Е2.

Было разработано несколько вакцин, которые приводят к значительному снижению уровня циркулирующего вируса и последующему снижению количества клинических случаев. Например, была разработана субъединичная вакцина против CSFV на основе гликопротеина Е2 оболочки вируса. Эта субъединичная вакцина позволяет отличать вакцинированных и зараженных свиней на основе детекции антителами к E^RNS (Van Aarle, 2003. Dev Biol Stand (Basel) 114: 193-200). Однако эта вакцина уступает вакцине на основе К-штамма как в отношении индукции, так и в отношении длительности иммунитета. Более того, ELISA-тесты на E^rns, которые сопровождают эту вакцину, также детектируют другие члены рода пестивирусов (а именно, BVDV и BDV). Поэтому их использование не рекомендуется в регионах, где циркулируют эти вирусы (2003/265/EC; SANCO/10809/2003).

Еще одна вакцина получена на основе так называемых вирусных репликонных частиц (VRP). VRP-частица содержит мутантную геномную РНК, которая способна реплицироваться и экспрессировать кодируемые вирусные белки, но которая не содержит полную информацию, необходимую для образования частиц, вследствие делеций по меньшей мере в одном из генов, кодирующих вирусные структурные белки. Эти вирусные частицы не передаются от животного к животному и поэтому удовлетворяют одному из требований к безопасной вакцине. Однако VRP с частичной или полной делецией гена Е2 обеспечивают только частичную защиту против смертельного заражения высоковирулентным CSFV (Maurer et al., 2005. Vaccine 23: 3318-28).

Изобретение дополнительно относится к способу защиты животного от CSF, включающему введение указанному животному эффективного количества вакцины по изобретению.

Эффективное количество определяют как количество указанной вакцины, которое будет вызывать иммунный ответ у индивидуума, которому ее вводят, приводя к развитию у индивидуума секреторного, клеточного и/или гуморального иммунного ответа на вакцину. Указанный секреторный, клеточный и/или гуморальный иммунный ответ на вакцину также эффективен против заражения вирулентным штаммом CSFV.

Указанное эффективное количество предпочтительно вводят перорально, или ороназально, или внутримышечно. Иммуногенную композицию против классической чумы свиней, содержащую рекомбинантный CSFV по изобретению, предпочтительно вводить совместно с фармацевтически приемлемым носителем.

Дополнительный способ защиты животных от CSF включает обеспечение эффективного количества вакцины по изобретению в виде вакцины в приманке, в частности, для защиты диких животных, таких как кабаны.

Эффективные вакцины снижают или предупреждают клинические признаки заболевания путем предотвращения репликации вируса и/или уменьшения передачи вируса. Термин DIVA (дифференциация инфицированных от вакцинированных животных) используют для вакцин и сопровождающих их диагностических тестов, основой которых являются мутантные вирусы и вирусы дикого типа совместно с диагностическим тестом для их дифференциации. Эта система делает возможной массовую вакцинацию восприимчивой популяции животных, не мешая серологической идентификации выздоравливающих животных.

Кроме того, изобретение относится к способу дифференциации животных, инфицированных CSFV, от неинфицированных животных и животных, вакцинированных CSF-вакциной по изобретению, включающему анализ сыворотки животного в серологическом тесте. Предпочтительно, чтобы указанная вакцина против CSFV включала изменение TAVSPTTLR-домена по изобретению и, более предпочтительно, по меньшей мере одно дополнительное изменение в белке Е2, такое как, например, изменение в домене LFDGTNP по аминокислотным положениям 772-778.

Указанный серологический тест предпочтительно включает одно или более антител, таких как моноклональные антитела, узнающие белок Е2, содержащий интактный TAVSPTTLR-домен, и одно или более антител, таких как моноклональные антитела, которые узнают дополнительный эпитоп, кодируемый CSFV, такой как дополнительный эпитоп в белке Е2, например эпитоп LFDGTNP.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные методы твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) дают возможность диагностики CSF у живых свиней. Предпочтительным типом ELISA является «сэндвич»-ELISA. Предпочтительным ELISA является конкурентный метод ELISA на основе Е2, такой как, например, Ceditest 2.0 ELISA. Путем предварительной инкубации сыворотки животного с мутантным белком Е2, содержащим измененный домен TAVSPTTLR, либо отдельно, либо в комбинации с измененным доменом LFDGTNP, можно истощить указанную сыворотку по антителам, которые направлены против указанных измененного домена TAVSPTTLR и измененного домена LFDGTNP.

Наиболее предпочтительным методом ELISA является пептидный метод ELISA, в котором пептиды сшиты с поверхностью лунок аналитических микропланшетов. Указанную сшивку предпочтительно осуществлять через якорный белок, такой как, например, поли-L-лизин. Методы ELISA, в которых используют сшитые пептиды, обычно являются более чувствительными по сравнению с методами ELISA, в которых используют пассивное нанесение пептидов на лунки. Эта методика относительно проста в исполнении, не требует специального оборудования для тканевой культуры, подходит для автоматизации и может давать результаты за полдня. Можно использовать моноклональные и/или поликлональные антитела, которые однозначно различают полевые и вакцинные штаммы CSFV, с одной стороны, а также CSFV и другие пестивирусы, с другой стороны. Пептид можно использовать для блокирования неспецифичной перекрестной реактивности.

Указанный пептидный метод ELISA предпочтительно представляет собой жидкофазный пептидный ELISA (lp-ELISA). В указанном lp-ELISA для детекции антител против CSFV тестируемую сыворотку инкубируют со смесью модифицированного CSFV-пептида и гетерологичного контрольного пептида, например BVDV-пептида. Указанный модифицированный CSFV-пептид предпочтительно является биотинилированным, в то время как контрольный пептид является небиотинилированным. Специфичные к CSFV антитела будут связывать указанный CSFV-пептид и будут захватываться с помощью указанной модификации, например, в результате связывания авидином или стрептавидином биотинилированного CSFV-пептида. Можно детектировать антитела, которые образуют комплексы с модифицированным CSFV-пептидом, например, образующие комплексы свиные антитела можно детектировать с помощью пероксидазного конъюгата вторичных антител к свиным антителам и последующей инкубации с подходящим субстратом.

Альтернативным тестом для дифференциации животного, инфицированного полевым CSFV или вакцинированного рекомбинантным вирусом по изобретению, является тест с использованием флуоресцентных антител (FAT) и тест, в котором проводят реакцию обратной транскрипции с последующими амплификацией кДНК, например, с помощью ПЦР, и анализом последовательности амплифицированной ДНК. FAT используют для детекции CSFV-антигена в замороженных срезах миндалин, селезенки, почек, лимфатических узлов или дистальных участков подвздошной кишки, полученных от свиньи, которая предположительно инфицирована CSFV или которая привита вакциной по изобретению. В альтернативном тесте CSFV выделяют из, например, миндалин животного, которое инфицировано или предположительно инфицировано полевым CSFV, и инкубируют с клетками РК-15. Затем реплицированный вирус детектируют в клетках РК-15 с использованием антител, которые позволяют отличать полевой вирус от рекомбинантного вируса по изобретению.

Другой предпочтительный серологический тест включает конкурентный метод ELISA для определения того, содержит ли указанная сыворотка антитела, которые ингибируют связывание антитела к белку Е2 с интактным доменом TAVSPTTLR, или содержит ли указанная сыворотка антитела, которые ингибируют связывание антител к белку Е2 с измененным доменом TAVSPTTLR.

Еще другой предпочтительный серологический тест включает одно или более антител, предпочтительно моноклональных антител, которые специфично узнают белок Е2, содержащий измененный домен TAVSPTTLR по изобретению. В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный серологический тест включает одно или более антител, таких как моноклональные антитела, которые специфично узнают белок Е2, содержащий измененный домен TAVSPTTLR по изобретению и дополнительный измененный иммуногенный домен указанного белка Е2. Указанная маркерная вакцина требует надежной индукции и детекции (чувствительной и специфичной) антител, используемых для установления отличий, после вакцинации животных. Присутствие указанных антител, используемых для проведения отличий, детектируют с помощью указанного серологического теста, который предпочтительно выбирают из теста нейтрализации вируса флуоресцентными антителами, анализа нейтрализации антителами, конъюгированными с пероксидазой, и метода ELISA с использованием антител.

Изобретение дополнительно относится к способу выделения инфекционного рекомбинантного вируса, который можно использовать в маркерной вакцине, позволяющей дифференцировать инфицированных животных от вакцинированных животных, причем способ включает отбор иммунодоминантного домена белка, кодируемого указанным вирусом, и который является консервативным по меньшей мере у 90% вирусов, предпочтительно по меньшей мере у 95% вирусов, более предпочтительно по меньшей мере у 99% вирусов; введение изменения, предпочтительно делеции, в область генома указанного вируса, которая кодирует указанный иммунодоминантный домен, так чтобы получить начальный вирус; приведение измененного генома в контакт с подходящей клеткой или клеточной линией; пассирование подходящей клетки или клеточной линии для размножения вируса; и выделение инфекционного вируса из указанной подходящей клетки или клеточной линии, который содержит одно или более дополнительных изменений в геноме, компенсирующих потерю приспособляемости начального вируса.

Указанное изменение в консервативном иммунодоминантном домене белка позволяет получить антитела, такие как моноклональные и поликлональные антитела, которые позволяют отличать вирус, экспрессирующий иммунодоминантный домен дикого типа, от вируса, который экспрессирует измененный иммунодоминантный домен. Следовательно, изобретение также относится к антителу, предпочтительно моноклональному антителу, которое специфично узнает указанный измененный консервативный иммунодоминантный домен.

Изобретение дополнительно относится к конструкции, кодирующей белок, содержащий указанный измененный консервативный иммунодоминантный домен. Изобретение дополнительно относится к белку, содержащему указанный измененный консервативный иммунодоминантный домен, и к пептиду, содержащему указанный измененный консервативный иммунодоминантный домен.

Кроме того, вакцина, включающая изменение в консервативном иммунодоминантном домене, не вызывает у вакцинированного индивидуума синтеза антител, которые узнают неизмененный иммунодоминантный домен. Диагностический тест, направленный на распознавание указанного неизмененного консервативного иммунодоминантного домена, позволяет отличать животное, инфицированное вирусом, который экспрессирует иммунодоминантный домен дикого типа, от вакцинированного животного.

Указанное изменение в консервативном иммунодоминантном домене может привести к вирусу, который менее эффективно инфицирует клетки по сравнению с вирусом дикого типа и/или менее эффективно реплицируется в инфицированных клетках. Пассирование инфицированной клетки или клеточной линии дает возможность введения одного или более вторичных изменений в геном, которые восстанавливают исходные свойства вируса. Указанный восстановленный вирус более эффективно инфицирует и/или реплицируется в клетках по сравнению с измененным вирусом, или восполняет какой-либо другой недостаток, коррелирующий с изменением консервативного иммунодоминантного домена. Поэтому восстановленный вирус содержит одно или более дополнительных изменений в родительском геноме, которые компенсируют потерю приспособляемости вируса, возникающую в результате изменения в консервативном иммунодоминантном домене. Дополнительным преимуществом способа по изобретению является то, что одно или более дополнительных изменений в родительском геноме будут затруднять возникновение ревертанта виру