Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции

Модифицированная липидами двухцепочечная рнк, обладающая мощным эффектом рнк-интерференции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к модифицированной липидами двухцепочечной РНК, которая может эффективно ингибировать экспрессию целевого гена. Более конкретно, настоящее изобретение относится к модифицированной липидами двухцепочечной РНК, которая обладает высокой устойчивостью к нуклеазе и с высокой эффективностью поглощается клеткой, и которая может производить превосходный эффект РНК-интерференции. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, в которой применяется модифицированная липидом двухцепочечная РНК, а также к способу подавления экспрессии целевого гена с применением модифицированной липидами двухцепочечной РНК.

Уровень техники

Разработка лекарственных средств, с помощью которых можно эффективно лечить такие тяжелые заболевания, как рак и СПИД, является одной из наиболее важных целей в области биологии и медицины. Одним из способов, который обладает высоким потенциалом в качестве решения, является применение генных лекарственных средств, которые действуют только на определенные гены. В частности, недавно привлек внимание метод РНК-интерференции (РНКи), в котором используется короткая, длиной 21 нуклеотид, двухцепочечная РНК (малая интерферирующая РНК: миРНК). О методе РНКи в 1998 году впервые сообщил Fire с сотр. (см. Непатентный документ 1). Согласно методу, о котором сообщил Fire с сотр., двухцепочечную РНК длиной приблизительно 100 пар оснований, которая гомологична определенной области гена, функцию которого нужно ингибировать, вводят в клетку и расщепляют в цитоплазме на фрагменты двухцепочечной РНК размером приблизительно 20-25 пар оснований под действием дайсера. Затем фрагменты РНК взаимодействуют с множеством белков, формируя РНК-белковый комплекс (указанный комплекс называется "RISC": от англ. RNA-induced silencing complex - РНК-индуцированный комплекс сайленсинга). Данный комплекс связывается с гомологичной областью мРНК, синтезированной с целевого гена, эффективно подавляя, таким образом, экспрессию гена. Однако сообщается, что когда двухцепочечную РНК длиной приблизительно 30 пар оснований или больше вводят в клетки млекопитающих, развивается интерфероновый ответ, который представляет собой противовирусный ответ, вызывающий в результате явление апоптоза. Таким образом, считается, что метод РНКи сложно применять к системам клеток млекопитающих. С учетом указанной проблемы, Tuschl с сотр. химически синтезировали двухцепочечную РНК длиной 21 нуклеотид, которая на концах обеих нитей имеет 3'-выступающие концы, и сообщили, что прямое введение двухцепочечной РНК длиной 21 нуклеотид в клетки млекопитающих может сиквенс-специфично и эффективно подавлять экспрессию гена, избегая интерферонового ответа (см. Непатентный документ 2). Tuschl с сотр. также синтезировали короткие двухцепочечные РНК, в которых двухцепочечная область включает 19 пар нуклеотидов, имеющие на 3'-концах или 5'-концах выступающие концы различной длины, и исследовали их эффекты РНК-интерференции. Результаты показали, что миРНК длиной 21 нуклеотид, имеющие выступающие концы длиной 2 нуклеотида на обоих 3'-концах, производят очень мощный эффект РНК-интерференции, тогда как ни один другой тип коротких двухцепочечных РНК не производил заметного эффекта РНК-интерференции. Основываясь на данном сообщении, основной метод, применяемый сегодня, представляет собой метод РНК-интерференции, в котором используется двухцепочечная РНК длиной 21 нуклеотид, имеющая выступающие концы длиной 2 нуклеотида на обоих 3'-концах. Способ ингибирования экспрессии целевого гена с применением короткой двухцепочечной РНК длиной 21 нуклеотид, именуется в настоящей заявке как "миРНК способ", в целях его отличия от метода РНКи.

Поскольку в миРНК способе применяется синтетическая РНК, получение пробы является сравнительно легким, а обращение с ней также является простым. Кроме того, могут быть получены крайне мощные эффекты. Поэтому миРНК способ привлекает все большее внимание не только в области биологии и медицины, но также и в коммерческой биотехнологии.

Впрочем, с подобным превосходным миРНК способом также связаны некоторые сложности, которые необходимо решить. Как описано выше, миРНК состоит из молекул РНК, которые легко расщепляются под действием нуклеазы, содержащейся в клетках или в среде. Хотя двухцепочечная область РНК обладает относительно высокой устойчивостью к нуклеазе по сравнению с одноцепочечной РНК, двухцепочечная РНК длиной 19 пар нуклеотидов практически не проявляет эффекта РНК-интерференции на обычных уровнях. В этой связи сообщалось, что хотя синтетическая миРНК демонстрирует мощный супрессивный эффект в отношении экспрессии генов в течение приблизительно 2-4 дней после введения в клетки, содержащие последовательность целевого гена, в дальнейшем ее эффект РНК-интерференции резко снижался, и практически полностью утрачивался приблизительно через 7 дней.

Недавно были описаны различные химически модифицированные миРНК, направленные на достижение высокой эффективности поглощения клетками и длительного, крайне активного эффекта РНК-интерференции в синтетической РНК. Например, были синтезированы миРНК, модифицированные по концам аминогруппой, тиоловой группой или участком с удаленными основаниями, для повышения устойчивости к расщеплению экзонуклеазой. Однако сообщалось, что концевая модификация миРНК длиной 21 нуклеотид резко снижает эффект РНК-интерференции в большинстве случаев.

В недавнем сообщении J. Rossi с сотр. было описано, что двухцепочечная РНК длиной 27 пар нуклеотидов обладает эффектом РНК-интерференции, который приблизительно в 100 раз выше, чем у миРНК длиной 21 нуклеотид (см. Непатентный документ 3). Описанный мощный эффект, как полагают, достигается по следующей причине: после расщепления РНК длиной 27 пар нуклеотидов дайсером, который является ферментом, подобным РНКазе-III, с образованием миРНК длиной 21 нуклеотид, миРНК узнается белковым комплексом RISC как есть, и при этом эффекты миРНК могут производиться с высокой эффективностью.

Поскольку РНК длиной 27 оснований может производить превосходный эффект РНК-интерференции, как описанный выше, возрастают ожидания от его будущего применения в качестве генного лекарственного средства. Впрочем, то, какой технический способ может применяться для дальнейшего усиления эффекта РНК-интерференции молекул РНК длиной 27 оснований, совершенно неизвестно. Кроме того, также неизвестен технический способ усиления эффекта РНК-интерференции двухцепочечных РНК, имеющих другую длину, нежели 27 нуклеотидов.

Двухцепочечные РНК, которые производят эффект РНК-интерференции, обычно сконструированы так, что они на концах имеют один или более выступающих концов. Эффекты РНК-интерференции двухцепочечных РНК, не имеющих выступающих концов (то есть, с тупыми концами), также были исследованы. Однако результаты указывали на то, что двухцепочечные РНК, имеющие тупые концы на 5'-конце смысловой нити, обладают эффектом РНК-интерференции, который по существу аналогичен или даже ниже, чем у двухцепочечных РНК, имеющих выступающий конец на 5'-конце смысловой нити (см. Непатентный документ 4).

Липиды обладают высоким сродством к мембранам клеток и высокой проницаемостью через мембраны клетки, и, как известно, могут применяться для доставки лекарственных средств в клетки. Связывание подобного липида с двухцепочечной РНК, которая обладает эффектом РНК-интерференции, как можно было бы ожидать, повысит эффективность поглощения клеткой и увеличит эффект РНК-интерференции. Однако, простое связывание липида с двухцепочечной РНК, обладающей эффектом РНК-интерференции, как известно, резко уменьшало эффект РНК-интерференции. В предшествующем уровне техники, модифицированную липидами РНК, которая может производить как превосходный эффект РНК-интерференции, так и полезный эффект, основанный на свойствах липида, все еще требуется сконструировать.

Непатентный документ 1: Fire et al., Nature, 391, 806-811 (1998).

Непатентный документ 2: Tuschl et al., EMBO Journal, 20, 6877-6888 (2001).

Непатентный документ 3: J. Rossi et al., Nature Biotech., 23, 222-226 (2005).

Непатентный документ 4: J.Т. Marques et al., Nature Biotech., 24, 559-565 (2006).

Описание изобретения

Задача, решаемая изобретением

Цель настоящего изобретения состоит в предоставлении новой двухцепочечной РНК, которая обладает высокой устойчивостью к нуклеазе и высокой эффективностью поглощения клеткой, и которая может производить превосходный эффект РНК-интерференции. Другая цель настоящего изобретения состоит в предоставлении фармацевтической композиции, в которой применяется новая двухцепочечная РНК, а также способа подавления экспрессии целевого гена с применением новой двухцепочечной РНК.

Способы решения задачи

Авторы настоящего изобретения провели обширное исследование, чтобы достичь вышеуказанных целей, и обнаружили, что когда двухцепочечный липид связан напрямую или через линкер, по меньшей мере, с одним из первых шести нуклеотидов на 5′-конце смысловой нити двухцепочечной РНК, которая включает антисмысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности в целевом гене, и смысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную антисмысловой нити, и которая может подавлять экспрессию целевого гена, то получаемая в результате двухцепочечная РНК обладает высокой устойчивостью к нуклеазе и высокой эффективностью поглощения клеткой, и может производить превосходный эффект РНК-интерференции. Настоящее изобретение было осуществлено в результате дальнейшего исследования, основанного на описанном открытии.

Более конкретно, настоящее изобретение обеспечивает следующие модифицированные липидами двухцепочечные РНК, фармацевтические композиции, в которых они применяются, а также способ подавления экспрессии целевого гена.

Пункт 1. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК, включающая антисмысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную к целевой последовательности в целевом гене, и смысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную антисмысловой нити, способная подавлять экспрессию целевого гена, и двухцепочечный липид, связанный напрямую или через линкер, по меньшей мере, с одной из первых шести нуклеотидов на 5'-конце смысловой нити.

Пункт 2. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 1, которая имеет тупой конец на 5'-конце смысловой нити, и тупой конец или выступающий конец на 3'-конце смысловой нити.

Пункт 3. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 1, которая имеет выступающие концы и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити.

Пункт 4. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно любому из Пунктов 1-3, где смысловая нить состоит из 21-27 нуклеотидов.

Пункт 5. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 2, которая имеет тупые концы и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити, причем и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 27 нуклеотидов.

Пункт 6. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 2, которая имеет тупые концы и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити, причем и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 23 нуклеотидов.

Пункт 7. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 2, которая имеет тупой конец на 5'-конце смысловой нити, причем смысловая нить состоит из 25 нуклеотидов, а антисмысловая нить состоит из 23 нуклеотидов.

Пункт 8. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 3, где и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 21 нуклеотида.

Пункт 9. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно любому из Пунктов 1-8, где две гидрофобных группы двухцепочечного липида являются одинаковыми или различными, при этом каждый представляет собой остаток насыщенной или ненасыщенной жирной кислоты, содержащий 6-50 атомов углерода.

Пункт 10. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно любому из Пунктов 1-9, где двухцепочечный липид является глицерофосфолипидом, глицерогликолипидом, диацилглицерином или церамидом.

Пункт 11. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно любому из Пунктов 1-9, где двухцепочечный липид является глицерофосфолипидом.

Пункт 12. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно Пункту 11, где двухцепочечный липид является фосфатидилэтаноламином.

Пункт 13. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно пункту 12, где двухцепочечный липид является, по меньшей мере, одним представителем, выбранным из группы, состоящей из димиристоилфосфатидилэтаноламина, дипальмитоилфосфатидилэтаноламина, 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилэтаноламина и диолеоилфосфатидилэтаноламина.

Пункт 14. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК согласно любому из Пунктов 1-13, где липид связан, по меньшей мере, с одним из первых шести нуклеотидов на 5'-конце смысловой нити через линкер, представленный формулой (L-27)

в которой n3 и n4 являются одинаковыми или различными, и обозначают целое число 1-20.

Пункт 15. Фармацевтическая композиция, включающая модифицированную липидом двухцепочечную РНК согласно любому из Пунктов 1-14, и фармацевтически приемлемый носитель.

Пункт 16. Применение модифицированной липидом двухцепочечной РНК согласно любому из Пунктов 1-14 для приготовления фармацевтической композиции, направленной на подавление экспрессии целевого гена.

Пункт 17. Способ подавления экспрессии целевого гена, включающий стадию введения модифицированной липидом двухцепочечной РНК согласно любому из Пунктов 1-14 в клетку.

Технический результат изобретения

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК настоящего изобретения модифицирована двухцепочечным липидом на 5'-конце смысловой нити. На основании данной структурной особенности, модифицированная липидом двухцепочечная РНК обладает значительно усиленным эффектом РНК-интерференции. В частности, поскольку в модифицированной липидом двухцепочечной РНК настоящего изобретения двухцепочечный липид связан с ее определенным участком, обеспечиваются существенно повышенная устойчивость к нуклеазе и эффект РНК-интерференции, без нарушения процессинга Дайсера или способности РНК формировать комплекс с RISC, что вносит, таким образом, существенный вклад в ее применение в медицине.

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения обладает поразительно высокой способностью к внутриклеточной доставке, даже когда она применяется в отдельности. Таким образом, модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения может быть введена в клетку без использования каких-либо известных реактивов для генной трансфекции, или при использовании известного реактива для генной трансфекции в уменьшенном количестве. Таким образом, модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения может подавлять развитие цитотоксичности, являющейся проблемой при использовании обычных реактивов для генной трансфекции, гарантируя, таким образом, высокую безопасность при клиническом применении.

Таким образом, в случае применения фармацевтической композиции или способа подавления экспрессии целевого гена, в которых применяется модифицированная липидами двухцепочечная РНК изобретения, клинически возможно более эффективно подавлять или ингибировать экспрессию целевого гена.

Краткое описание Фигур

На Фиг. 1 показаны результаты ВЭЖХ анализа, выполненного на модифицированных двухцепочечным липидом смысловых нитях в Примере 1.

На Фиг. 2 показаны результаты подтверждения образования двухцепочечных РНК модифицированных липидом двухцепочечных РНК в Примере 1;

На Фиг. 2A дорожка (1) соответствует 21nt миРНК, дорожка (2) соответствует РНК DPPE L21A/L21B, дорожка (3) соответствует РНК POPE L21A/L21B, дорожка (4) соответствует РНК DOPE L21A/L21B и дорожка (5) соответствует РНК DMPE L21A/L21B; и

На Фиг. 2B дорожка (1) соответствует 27nt днРНК, дорожка (2) соответствует РНК DPPE L27A/L27B, дорожка (3) соответствует РНК POPE L27A/L27B, дорожка (4) соответствует РНК DOPE L27A/L27B и дорожка (5) соответствует РНК DMPE L27A/L27B.

На Фиг. 3 показаны результаты исследования устойчивости к нуклеазе модифицированных липидом двухцепочечных РНК в Примере 1.

На Фиг. 4 показаны результаты исследования процессирования Дайсером модифицированных липидом двухцепочечных РНК в Примере 1.

На Фиг. 5 показаны результаты исследования эффектов РНК-интерференции модифицированных липидом двухцепочечных 27nt днРНК при концентрации 2 нМ в Примере 1.

На Фиг. 6 показаны результаты ВЭЖХ анализа, выполненного на модифицированных двухцепочечным липидом смысловых нитях в Примере 2.

На Фиг. 7 показаны результаты подтверждения образования двойных нитей модифицированных липидом двухцепочечных РНК в Примере 2;

На Фиг. 7A дорожки (1) и (2) A-1 соответствуют 21nt миРНК и РНК DPPE v21A/v21B, соответственно; и дорожки (1), (2), (3) и (4) A-2 соответствуют 21nt миРНК, РНК POPE v27A/v27B, РНК DOPE v27A/v27B и РНК DMPE v27A/v27B, соответственно; и

На Фиг. 7B, дорожки (1), (2), (3), (4) и (5) соответствуют 27nt днРНК, РНК DPPE v27A/v27B, РНК POPE v27A/v27B, РНК DOPE v27A/v27B и РНК DMPE v27A/v27B, соответственно.

На Фиг. 8 показаны результаты исследования устойчивости к нуклеазе двухцепочечных модифицированных липидом РНК в Примере 2.

На Фиг. 9 показаны результаты исследования процессирования Дайсером двухцепочечных модифицированных липидом РНК в Примере 2.

На Фиг. 10 показаны результаты исследования эффектов РНК-интерференции двухцепочечных модифицированных липидом РНК в отношении гена VEGF в клетках HeLa и клетках A549 в Примере 2.

На Фиг. 11-1 показаны результаты исследования эффективности поглощения клеткой двухцепочечных модифицированных липидами РНК, направленных на ген VEGF, в клетках HeLa;

где "FL" обозначает изображения, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа; "Trans" обозначает изображения, полученные с помощью фазовоконтрастного микроскопа в том же поле зрения, как в изображениях FL; и "Merge" обозначает изображения, полученные в результате наложения изображений Trans и FL.

На Фиг. 11-2 показаны результаты исследования эффективности поглощения клеткой двухцепочечных модифицированных липидами РНК, направленных на ген VEGF, в клетках A549;

где "FL" обозначает изображения, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа; "Trans" обозначает изображения, полученные с помощью фазовоконтрастного микроскопа в том же поле зрения, как в изображениях FL; и "Merge" обозначает изображения, полученные в результате наложения изображений Trans и FL.

На Фиг. 12 показаны результаты ВЭЖХ анализа, выполненного на двухцепочечной модифицированной липидами РНК в Примере 3.

На Фиг. 13 показаны результаты подтверждения синтеза модифицированной липидами двухцепочечной РНК в Примере 3.

Наилучший вариант осуществления изобретения

В настоящем описании "тупой конец" или "с тупым концом" относится к концевой структуре двухцепочечной РНК, в которой основания в концевой области смысловой нити и основания в концевой области антисмысловой нити, комплементарной смысловой нити, гибридизуются без образования одноцепочечной части (то есть, без образования выступа). "Выступающий конец" также называют "оверхэнгом" или "липким концом". Данный термин относится к концевой структуре нуклеотидной последовательности (выступу), в которой присутствует одиночная нить, без образования двойной нити, потому что комплементарные основания не присутствуют в концевой области смысловой нити двухцепочечной РНК, или в концевой области антисмысловой нити, комплементарной смысловой нити. В настоящем описании "модифицированная липидом двухцепочечная РНК" относится к двухцепочечным молекулам РНК, с которыми связан двухцепочечный липид.

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения включает антисмысловую нить, которая имеет нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности в целевом гене.

Целевой ген, используемый в настоящем описании, относится к гену, экспрессия которого подавляется эффектом РНК-интерференции. В модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения, целевой ген конкретно не ограничивается, и может быть соответственно выбран в зависимости от предполагаемого применения модифицированной липидами двухцепочечной РНК.

Целевая последовательность целевого гена конкретно не ограничивается, при условии, что экспрессия гена может быть подавлена эффектом РНК-интерференции. Целевая последовательность может быть соответственно определена согласно известному способу, например, при использовании поиска NCBI BLAST, и т.д. Например, целевая последовательность может являться областью, которая состоит из 19-30 оснований после оснований "АА" в области экзона, которая расположена через 50-100 оснований после старткодона кодирующей области (ORF) целевого гена, и имеет содержание GC приблизительно 50%. В данной области техники опытным путем известно, что превосходный эффект РНК-интерференции может быть получен при использовании цепи, комплементарной подобной целевой последовательности. Целевая последовательность может быть также определена, например, в соответствии с инструкциями IDT (Integrated DNA Technologies, Inc; Dicer Substrate RNAi Design). Кроме того, в недавнем сообщении было показано, что двухцепочечная РНК, обладающая мощным эффектом РНК-интерференции, может быть получена при конструировании двухцепочечной РНК, которая удовлетворяет следующим структурным признакам: (i) имеет пару A/U на 5′-конце антисмысловой нити, (ii) имеет пару G/C на 5′-конце смысловой нити и (iii) имеет приблизительно пять пар A/U, которые присутствуют в 5′-концевой области антисмысловой нити; (iv) и двухцепочечная РНК не содержит девяти или более пар G/C (Ui-Tei et al., Nucleic Acids Res., 32, 936-948 (2004)).

В тех случаях, когда модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения не имеет выступающих концов на антисмысловой нити, антисмысловая нить состоит из нуклеотидной последовательности, комплементарной целевой последовательности. Если выступающий конец присутствует на 5′-конце и/или 3′-конце антисмысловой нити, антисмысловая нить состоит из нуклеотидной последовательности, имеющей нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности, а также нуклеотидной последовательности выступающего конца, которая присоединена к 5′-концу и/или 3′-концу комплементарной нуклеотидной последовательности.

При условии, что эффект РНК-интерференции может быть произведен, количество нуклеотидов, которые составляют антисмысловую нить модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения, конкретно не ограничено, и может быть соответственно выбрано в зависимости от желаемой структуры модифицированной липидами двухцепочечной РНК, и т.д. Количество нуклеотидов обычно составляет 21-27, предпочтительно 21, 23, 25 или 27, и более предпочтительно 21 или 27. В тех случаях, когда на антисмысловой нити выступающие концы не присутствуют, количество нуклеотидов, которые составляют антисмысловую нить, в рамках настоящего описания, относится к общему количеству нуклеотидов, составляющих нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности. Если на антисмысловой нити присутствует выступающий конец, количество нуклеотидов, которые составляют антисмысловую нить, относится к сумме количества нуклеотидов, составляющих выступающий конец, и количества нуклеотидов, составляющих нуклеотидную последовательность, комплементарную целевой последовательности.

Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения включает смысловую нить, имеющую нуклеотидную последовательность, комплементарную антисмысловой нити.

В тех случаях, когда модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения не имеет выступающих концов на смысловой нити, смысловая нить состоит из нуклеотидной последовательности, комплементарной части или всей "нуклеотидной последовательности, комплементарной целевой последовательности" антисмысловой нити. Если выступающий конец присутствует на 5′-конце и/или в 3′-конце смысловой нити, смысловая нить состоит из нуклеотидной последовательности, комплементарной части или всей "нуклеотидной последовательности, комплементарной целевой последовательности" антисмысловой нити, а также нуклеотидной последовательности выступающего конца, которая присоединена к 5′-концу и/или 3′-концу комплементарной нуклеотидной последовательности антисмысловой нити.

При условии, что эффект РНК-интерференции может быть произведен, количество нуклеотидов, которые составляют смысловую нить в модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения, конкретно не ограничено, и может быть соответственно выбрано в зависимости от желаемой структуры двухцепочечной РНК, и т.д. Количество нуклеотидов обычно составляет 21-27, предпочтительно 21, 23, 25 или 27, и более предпочтительно 21, 23 или 27. В тех случаях, когда на смысловой нити выступающие концы не присутствуют, количество нуклеотидов, которые составляют смысловую нить, в рамках настоящего описания, относится к общему количеству нуклеотидов, составляющих нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой последовательности. Если выступающий конец присутствует на смысловой нити, количество нуклеотидов, которые составляют смысловую нить, относится к сумме количества нуклеотидов, составляющих выступающий конец, и количества нуклеотидов, составляющих нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевой последовательности.

Нуклеотиды, которые составляют смысловую нить и антисмысловую нить модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения, главным образом являются рибонуклеотидами. В целях повышения устойчивости к ферментативному расщеплению, последовательность РНК может дополнительно включить различные химически модифицированные нуклеотиды, такие как 2'-O-метил-модифицированные нуклеотиды, 2'-F-модифицированные нуклеотиды, LNA (Закрытая нуклеиновая кислота) нуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. В частности, когда модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения имеет выступающий конец, выступающий конец смысловой нити и/или антисмысловой нити может состоять из дезоксирибонуклеотидов. Примеры таких химически модифицированных нуклеотидов включают нуклеотиды, модифицированные по фосфатному скелету, такие как фосфоротиоат-модифицированная ДНК/РНК и боранофосфат-модифицированная ДНК/РНК; 2'-модифицированные нуклеотиды, такие как 2'-OMe-модифицированная РНК и 2'-F-модифицированная РНК; модифицированные нуклеотиды, полученные путем сшивания молекулы сахара нуклеотида, такие как LNA (Закрытая нуклеиновая кислота) и ENA (2'-O,4'-C-этилен-мостиковые нуклеиновые кислоты); модифицированные нуклеотиды, имеющие различные скелеты, такие как ПНК (Пептид-нуклеиновая кислота) и морфолин-нуклеотид; нуклеотиды с модифицированным основанием, такие как 5-фторуридин и 5-пропилуридин; и т.п.

Структура двухцепочечной модифицированной липидами РНК изобретения конкретно не ограничивается, при условии что смысловая и антисмысловая нити гибридизуются с формированием двойной нити. В качестве примеров предпочтительными являются следующие структуры: структура (A), в которой двухцепочечная РНК имеет тупой конец на 5'-конце смысловой нити, а также имеет тупой конец или выступающий конец (одноцепочечную область или выступ) на 3'-конце смысловой нити; и структура (B), в которой двухцепочечная РНК имеет выступающие концы и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити. На основе вышеуказанной структуры (A) или (B), модифицированная липидом двухцепочечная РНК может сохранять свой эффект РНК-интерференции, несмотря на то, что она модифицирована двухцепочечным липидом, и при этом также имеет существенно повышенную эффективность поглощения клеткой. Структура, которая включает "выступающий конец на 3'-конце смысловой нити", используемая в настоящем описании, включает два следующих случая: случай, в котором 3'-концевая область смысловой нити формирует выступающий конец; и случай, в котором 5'-концевая область антисмысловой нити формирует выступающий конец. Структура, которая включает "выступающий конец на 5'-конце смысловой нити", используемая в настоящем описании, включает два следующих случая: случай, в котором 5'-концевая область смысловой нити формирует выступающий конец; и случай, в котором 3'-концевая область антисмысловой нити формирует выступающий конец.

В целях обеспечения превосходного эффекта РНК-интерференции, например, из вышеуказанных структур (A) и (B) наиболее предпочтительными являются следующие структуры двухцепочечной РНК модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения: структура (A-1), в которой двухцепочечная РНК имеет тупой конец и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити, причем и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 27 нуклеотидов; структура (A-2), в которой двухцепочечная РНК имеет тупой конец и на 5'-, и на 3'-конце смысловой нити, причем и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 23 нуклеотидов; структура (A-3), в которой двухцепочечная РНК имеет тупой конец на 5'-конце смысловой нити, причем смысловая нить состоит из 25 нуклеотидов, а антисмысловая нить состоит из 23 нуклеотидов; и структура (B-1), в которой двухцепочечная РНК имеет выступающие концы, которые состоят из двух нуклеотидов, на 3'-конце и смысловой, и антисмысловой нитей, причем и смысловая, и антисмысловая нити состоят из 21 нуклеотида.

Более конкретно, в структурах (A-1) и (A-2), смысловая и антисмысловая нити гибридизованы без формирования на концах каких-либо выступающих концов. В структуре (A-3) смысловая и антисмысловая нити гибридизуются таким образом, что двухцепочечная РНК имеет тупой конец на 5'-конце смысловой нити, при этом выступающий конец формируют первый и второй нуклеотиды с 3'-конца смысловой нити. В структуре (B-1) с первого по 19-ый нуклеотиды с 5'-конца смысловой нити и с третьего по 21-ый нуклеотиды с 3'-конца антисмысловой нити гибридизуются таким образом, что первый и второй нуклеотиды с 3'-конца смысловой нити формируют выступающий конец, и первый и второй нуклеотиды с 3'-конца антисмысловой нити формируют выступающий конец.

Согласно модифицированной липидом двухцепочечной РНК изобретения, липид связан, по меньшей мере, с одним из первых шести нуклеотидов на 5'-конце смысловой нити. Модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения не имеет заместителей в каком-либо положении за исключением 5'-концевой области смысловой нити. Более конкретно, ни одна часть смысловой нити, за исключением 5'-концевой области, и антисмысловой нити не имеет заместителей, причем указанные части состоят только из нуклеотидов. Связывание липида только с 5'-концевой областью смысловой нити повышает эффективность поглощения клеткой, а также может существенно усилить эффект РНК-интерференции. Более конкретно, в модифицированной липидом двухцепочечной РНК настоящего изобретения, двухцепочечной РНК-структуре, применение двухцепочечного липида для модификации двухцепочечной РНК и участок связывания двухцепочечного липида являются неразрывно связанными структурными признаками. Благодаря указанным структурным признакам модифицированная липидом двухцепочечная РНК изобретения обладает превосходной эффективностью поглощения клеткой и устойчивостью к нуклеазе, а также может производить существенно усиленный эффект РНК-интерференции.

В модифицированной липидом двухцепочечной РНК изобретения, двухцепочечный липид, связанный со смысловой нитью, конкретно не ограничен, при условии, что липид имеет две гидрофобных группы. Примеры двухцепочечного липида включают липиды, имеющие, по меньшей мере, две гидрофобных группы, которые выбраны из группы, состоящей из остатков C_6-50 насыщенных жирных кислот и остатков C_6-50 ненасыщенных жирных кислот. Каждый остаток насыщенной жирной кислоты и остаток ненасыщенной жирной кислоты предпочтительно содержит 8-30 атомов углерода, и более предпочтительно 10-24 атома углерода. Более конкретно, примеры гидрофобных групп липида включают остатки жирных кислот, таких как каприновая кислота, лауриновая кислота, миристиновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, арахиновая кислота, бегеновая кислота, лигноцериновая кислота, миристоленовая кислота, пальмитолеиновая кислота, олеиновая кислота, элаидиновая кислота, вакценовая кислота, эруковая кислота, гадолиновая кислота, линоленовая кислота, линолевая кислота, и арахидоновая кислота. В целях более эффективного осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, один остаток жирной кислоты, выбранный из миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты и олеиновой кислоты, предпочтительно используются в качестве двух гидрофобных групп двухцепочечного липида в настоящем изобретении.

Примеры двухцепочечных липидов, которые могут применяться в настоящем изобретении, включают глицерофосфолипид, глицерогликолипид, диацилглицерин, церамид и т.п. Чтобы дополнительно повысить устойчивость к нуклеазе, эффективность поглощения клеткой и эффект РНК-интерференции, предпочтительно может применяться глицерофосфолипид.

Глицерофосфолипид, который может применяться в настоящем изобретении, конкретно не ограничивается. Примеры глицерофосфолипида, который может применяться, включают фосфатидилэтаноламин, фосфатидилглицерин, фосфатидилсерин, фосфатидную кислоту, а также фосфатидилинозит, и т.д.

Примеры фосфолипидов, которые могут применяться в настоящем изобретении, включают фосфатидилэтаноламины, такие как дилауроилфосфатидилэтаноламин, димиристоилфосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилэтаноламин, дистеароилфосфатидилэтаноламин, диолеоилфосфатидилэтаноламин, 1-пальмитоил-2-олеилфосфатидилэтаноламин, 1-олеил-2-пальмитоилфосфатидилэтаноламин и диэрукоилфосфатидилэтаноламин; фосфатидилглицерины, такие как дилауроилфосфатидилглицерин, димиристоилфосфатидилглицерин, дипальмитоилфосфатидилглицерин, дистеароилфосфатидилглицерин, диолеоилфосфатидилглицерин, 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилглицерин, 1-олеил-2-пальмитоил-фосфатидилглицерин и диэрукоилфосфатидилглицерин; фосфатидилсерины, такие как дилауроилфосфатидилсерин, димиристоилфосфатидилсерин, дипальмитоилфосфатидилсерин, дистеароилфосфатидилсерин, диолеоилфосфатидилсерин, 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилсерин, 1-олеил-2-пальмитоил-фосфатидилсерин и диэрукоилфосфатидилсерин; фосфатидные кислоты, такие как дилауроилфосфатидная кислота, димиристоилфосфатидная кислота, дипальмитоилфосфатидная кислота, дистеароилфосфатидная кислота, диолеоилфосфатидная кислота, 1-пальмитоил-2-олеилфосфатидная кислота, 1-олеил-2-пальмитоил-фосфатидная кислота, и диэрукоилфосфатидная кислота; и фосфатидилинозиты, такие как дилауроилфосфатидилинозит, димиристоилфосфатидилинозит, дипальмитоилфосфатидилинозит, дистеароилфосфатидилинозит, диолеоилфосфатидилинозит, 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилинозит, 1-олеил-2-пальмитоил-фосфатидилинозит, и диэрукоилфосфатидилинозит. Для обеспечения более существенной устойчивости нуклеазы, эффективности поглощения клеткой и более существенного эффекта РНК-интерференции, предпочтительно могут применяться фосфатидилэтаноламины. Более предпочтительно, могут применяться димиристоилфосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилэтаноламин, 1-пальмитоил-2-олеил-фосфатидилэтаноламин и диолеоилфосфатидилэтаноламин.

Способ связывания двухцепочечного липида со смысловой нитью в модифицированной липидами двухцепочечной РНК изобретения конкретно не ограничивается. Липид и смысловая нить могут быть связаны напрямую или через линкер (связывающую область). Линкер, используемый для связывания липида со смысловой нитью, не включает нуклеиновую кислоту.

Линкер, который может применяться, конкретно не ограничивается, при условии, что с его помощью связываются липид и смысловая нить. Примеры линкеров, которые могут применяться, включают линкеры следующих структур:

-O-CO-O-	(L-1)
-NH-CO-O-	(L-2)
-NH-CO-NH-	(L-3)
-NH-(CH2)n1-	(L-4)
-S-(CH2)n1-	(L-5)
-CO-(CH2)n1-CO-	(L-6)