Применение адаптированных рекомбиназ для лечения ретровирусных инфекций

Применение адаптированных рекомбиназ для лечения ретровирусных инфекций

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу получения вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу, где указанная адаптированная рекомбиназа осуществляет рекомбинацию ассиметричных участков-мишеней в LTR провирусной ДНК ретровируса, встроенного в геном клетки-хозяина. Такие адаптированные рекомбиназы, распознающие ассиметричные участки-мишени в LTR провирусной ДНК, представляют собой средства для вырезание провируса из генома клетки-хозяина. Настоящее изобретение, кроме того, относится к использованию адаптированных рекомбиназ для получения фармацевтических композиций для снижения вирусной нагрузки у индивида, инфицированного ретровирусом. Также изобретение относится к способу оптимизации лечения ретровирусной инфекции у индивида in vitro, включающему адаптацию рекомбиназ, специфично распознающих и рекомбинирующих последовательности ассиметричных участков-мишеней в провирусной ДНК ретровируса у инфицированного индивида.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Ретровирусные инфекции такие как, например, инфекции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), до сих пор остаются одними из наиболее важных и наиболее распространенными заболеваниями человека.

Что касается СПИД, то носителем ВИЧ, яляющегося ретровирусом, вызывающим СПИД, по оценкам являются 39,5 миллионов человек. Последние данные указывают, что даже в 2006 году произошло приблизительно 4,3 миллионов новых случаев инфицирования, а в некоторых областях мира скорость распространения инфекции с 2004 года увеличилась более чем на 50%. Кроме того, по данным AIDS Epidemic Update 2006, публикуемого WHO, (декабрь 2006), в 2006 году от связанных со СПИД заболеваний умерли приблизительно 2,9 миллиона человек.

Основными задачами прикладной противоретровирусной терапии являются снижение частоты заболеваемости ВИЧ и смертности, улучшение качества жизни, восстановление и сохранение функционирования иммунной системы и максимальная и длительная супрессия вирусной нагрузки. В настоящее время противоретровирусная терапия, а более точно, схемы лечения против ВИЧ в основном основаны на ингибиторах вирусных ферментов и молекулах, ингибирующих слияние вируса с клеткой.

В этом отношении в настоящее время существуют четыре доступных класса лекарственных средств против ВИЧ, которые используют для лечения СПИД. Эти классы лекарственных средств направлены на конкретные стадии в процессе репликации ВИЧ.

Первым классом активных средств являются ингибиторы слияния (FI), которые работают вне клеток-хозяев с целью предотвращения слияния ВИЧ с этими клетками, его проникновения в эти клетки и инфицирование этих клеток. Соответствующим подходом является предотвращение связывания ВИЧ с клеткой-мишенью посредством CD4-рецепторов и корецепторов, называемых CCR5 или CXCR4, на поверхности клеток-мишеней.

Три других класса активных средств действуют внутри клетки. Так называемые нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NRTI), ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NNRTI) и ингибиторы протеаз (PI) используют для предотвращения репликации вируса внутри клеток-хозяев после их инфицирования ВИЧ.

Примерами NRTI и NNRTI, препятствующих образованию копий генетической информации ВИЧ (продуцирующих, таким образом, так называемую провирусную ДНК), являются 3TC (ламивудин, эпивир), абакавир (зиаген), AZT (зидовудин, ретровир), d4T (ставудин, зерит), ddC (зальцитабин, хивид), ddI (диданозин, видекс/видекс EC), FTC (эмтрицитабин, эмтрива), эфавиренз (сустива) и невирапин (вирамун).

Мишенью PI является фермент ВИЧ протеаза, вовлеченная в сборку вируса. Примерами активных средств являются ампренавир (агенераза), атазанавир (реатаз), фосампренавир (телзир), индинавир (криксиван), лопинавир, нелфинавир (вирасепт), ритонавир (норвир) и саквинавир (инвираза/фортоваза).

Один из типов используемого в настоящее время комбинированного лечения, включающего использование более одного активного средства, представляет собой высокоактивную противоретровирусную терапию (ВААРТ), направленную на вирусную обратную транскриптазу, протеазу и слияние (Gulick et al., 1997; Lalezari et al., 2003). Использование такой терапии привело к преобразованию инфекции ВИЧ-1 в хроническое заболевание, которое снижает смертность инфицированных индивидов.

Однако одним из недостатков всех современных подходов лечения является то, что они только подавляют жизненный цикл вируса, не устраняя инфекции. Основным препятствием при таких способах лечения является образование долгоживущих резервуаров ВИЧ-1, в частности в латентно инфицированных покоящихся CD4⁺ T-клетках (Chun et al., 1998; Finzi et al., 1997), что требует пожизненной ВААРТ.

К сожалению, у все более увеличивающегося количества пациентов долговременная ВААРТ сопровождается значительными неблагоприятными побочными эффектами, включая токсичность для митохондрий, липодистрофию, сахарный диабет и остеопороз (Dybul et al., 2002). Значительная токсичность лекарственных средств часто приводит к нечеткому следованию схеме лечения, что приводит к недостаточному ингибированию репликации вируса. Как следствие возникают новые штаммы вируса ВИЧ-1, которые устойчивы к супрессирующей терапии (Little et al., 2002). Вследствие увеличивающегося количества устойчивых штаммов ВИЧ необходимы новые активные средства, которые в настоящее время находятся на стадии разработки. Кроме того, для улучшенного контроля ВИЧ-1 иследуют новые мишени в вирусах и новые подходы ингибирования (Donzella, 1998; Chiu et al., 2005; Hazuda et al., 2004; Hauber et al., 2005).

Обсуждаемый в данной области альтернативный подход заключается в нацеливании на провирус, встроенный в геном клетки-хозяина. Например, вырезание провирусной ДНК из генома хозяина могло бы предотвратить дальнейшую репликацию ВИЧ и такое вырезание отличается от современных способов тем, что обладает возможностью уничтожать даже латентный вирус, присутствующий в геноме хозяина.

Одним из классов белков, которые рассматривают для применения в этом альтернативном подходе, являются сайт-специфические рекомбиназы (Flowers et al., 1997). Сайт-специфические рекомбиназы в природе опосредуют множество функций, начиная от перестановки генов до сегрегации геномов, например, такого как вырезание, инверсия или интеграция определенных сегментов ДНК (обзор представлен в Stark et al., 1992).

Одной из простейших и наиболее исследованных рекомбиназ является рекомбиназа Cre бактериофага P1, которая разделяет геномные димеры до мономеров путем рекомбинации двух идентичных участков двухцепочечной ДНК со специфической последовательностью (Hoess & Abremski, 1985). Рекомбиназа Cre нашла широкое применение в генетических исследованиях на мышах (Nagy, 2000). Рекомбиназа Cre представляет собой белок массой 38 кДа, название которого связано с его функцией, так как он вызывает рекомбинацию (causes recombination) (Sternberg & Hamilton, 1981). Необходимым условием для рекомбинации является расположение двух участков рекомбинации, распознаваемых Cre в антипараллельной ориентации, которые затем связываются четырьмя идентичными субъединицами Cre, связывающимися с образованием кольца, в котором каждая субъединица контактирует с двумя соседними субъединицами и половиной участка в одном участке рекомбинации (Hoess & Abremski, 1985). Участок рекомбинации, распознаваемый Cre, представляет собой последовательность двухцепочечной ДНК длиной 34 п.н., известную как loxP (из участка кроссинговера (locus of crossing over (x)), P1; Sternberg & Hamilton, 1981), которая является палиндромной за исключением восьми центральных пар оснований (называемых спейсером), которые задают направленность участка.

Некоторые системы сайт-специфической рекомбинации, включая систему Cre/loxP, функционируют без вспомогательных белков или кофакторов, в широком спектре условий в клетке. Однако так как сайт-специфические рекомбиназы функционируют на основе специфических взаимодействий субъединиц фермента рекомбиназы с распознаваемыми последовательностями-мишенями ДНК, то использование этих ферментов ограничено необходимостью того, что области-мишени ДНК должны содержать соответствующим образом расположенные участки-мишени (Lewandoski, 2001). До настоящего времени рекомбиназы дикого типа, которая в качестве ее последовательностей-мишеней ДНК распознает природные ретровирусные последовательности, не было найдено.

В последние годы был проведен глубокий мутационный и структурный анализ сайт-специфических рекомбиназ с изменением их свойств для достижения лучшего понимания сложных механизмов действия этих ферментов (обзор представлен в van Duyne, 2001; и Coates et al., 2005). Большое число исследований были сосредоточены на рекомбиназе Cre с целью анализа ее способности к эволюции. Несколько исследований показали, что если в участке распознавания рекомбиназы Cre, а именно, loxP, изменены несколько нуклеотидов, то специфичность распознавания мишени Cre может изменяться (Buchholz & Stewart, 2001; Santoro & Schultz, 2002; Rufer & Sauer, 2002). Дополнительные исследования направлены на конструирование мутантных участков-мишеней loxP, содержащих последовательности из LTR ВИЧ-1, с конструированием возможных участков-мишеней для использования Cre в качестве противовирусной стратегии. (Lee & Park, 1998; Lee et al., 2000). До настоящего времени, однако, было невозможно получить рекомбиназу, которая бы распознавала природные ассиметричные последовательности ВИЧ в качестве последовательностей-мишеней ДНК.

Способ направленной эволюции представляет собой мощный способ для выбора ферментов с измененной специфичностью (рассмотрено в Yuan et al., 2005; и Johannes & Zhao, 2006). Сначала этот способ использовали для выделения улучшенных ферментов на основе РНК путем селекции молекулы РНК с измененными субстратными участками. Использование способа на основе ПЦР позволяет скринировать очень большие библиотеки и выделять из совокупности кандидатов удачные кодирующие области. В отличие от этого, при направленной эволюции белков скрининг и выделение улучшенных мутантов, которых идентифицируют по изменениям в свойствах белка, необходим способ восстановления последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок. Связь между белком и его кодирующей последовательностью часто поддерживают посредством компартментализации. Таким образом, скрининг библиотек в направленной эволюции белков был ограничен подходами "один за другим", которые сохраняют компартменты, а преимущества, связанные со скринингом совокупности кандидатов, были недоступны.

Это ограничение было устранено благодаря созданию способов, позволяющих перекрестно сливать белки с соответствующими матричными РНК (мРНК), используя слитые конструкции мРНК-белок и рибосомный дисплей. Таким образом, функциональный скрининг белков с улучшенными свойствами связан с прямым получением соответствующих кодирующих молекул, а скринингу in vitro подвергали большие совокупности (например, смотри Buchholz et al., 1998). Дополнительного улучшения направленной эволюции белков достигли посредством так называемой эволюции на основе сшитых с субстратом белков (SLiPE; Buchholz & Stewart, 2001), где субстрат рекомбиназы помещали на ту же молекулу ДНК, что и кодирующую область белка. Таким образом, если в компартменте экспрессировалась рекомбиназа, ее действие изменяло субстрат ДНК, следующий за ее собственной кодирующей областью. Таким образом, библиотеку можно было скринировать в качестве совокупности с помощью ПЦР с амплификацией только кодирующих областей-кандидатов, которые следовали за измененным субстратом. Это обеспечивает удобный скрининг больших библиотек для быстрого получения удачных кодирующих областей. Этот способ использовали для изменения ДНК-специфичности рекомбиназы Cre и адаптации ее к новому распознаваемому участку-мишени (Buchholz & Stewart, 2001).

Однако основной помехой использования любой рекомбиназы для вырезания ретровирусной ДНК является необходимость симметричных участков-мишеней для рекомбиназы, которые, как правило, не встречаются в провирусной ДНК по меньшей мере дважды, чтобы использовать известные в настоящее время рекомбиназы.

Таким образом, учитывая возможность сайт-специфических рекомбиназ и необходимость создания терапевтического подхода для лечения СПИД, при котором устранялся бы провирус ВИЧ-1 из генома клетки-хозяина, задача настоящего изобретения состоит в создании способа получения адаптированной рекомбиназы, которая осуществляет рекомбинацию ассиметричных участков-мишеней в LTR провирусной ДНК ретровируса, встроенного в геном клетки-хозяина, таким образом, вырезая провирус из генома клетки-хозяина.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с первым аспектом настоящее изобретение относится к способу получения вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу, которая осуществляет рекомбинацию ассиметричных участков-мишеней в LTR провирусной ДНК, введенной в геном клетки-хозяина, причем способ включает стадии:

(a) определения последовательности LTR провирусной ДНК путем идентификации в ней последовательностей, гомологичных с последовательностями левой половины участка и правой половины участка известных участков-мишеней рекомбиназ по меньшей мере на 30%, причем гомологичные последовательности разделены спейсером из 5-12 нуклеотидов, и гомологичные последовательности LTR с наибольшей гомологией с известным участком-мишенью представляют ассиметричную последовательность-мишень;

(b) получения двух синтетических последовательностей, в которых первая синтетическая последовательность соответствует последовательности асимметричной последовательности-мишени стадии (а), гомологичной левой половине участка указанного известного участка-мишени плюс последовательность спейсера, и обозначена как "последовательность половины участка 1", а вторая синтетическая последовательность соответствует последовательности спейсера плюс последовательность ассиметричной последовательности-мишени стадии (а), гомологичная правой половине участка, и обозначена как "последовательность половины участка 2";

(c) определения нуклеотидов в синтетических последовательностях стадии (b), которые отличаются от соответствующих гомологичных последовательностей левой половины участка и правой половины участка известного гомологичного участка-мишени стадии (а);

(d) получения первой подгруппы двух последовательностей-мишеней на основе синтетических последовательностей стадии (b), в которой первая последовательность-мишень в первой подгруппе содержит инвертированный повтор, состоящий из последовательности половины участка 1 стадии (а) и последовательности половины участка 1', разделенных последовательностью спейсера, а вторая последовательность-мишень в первой подгруппе содержит инвертированный повтор, состоящий из последовательности половины участка 2' и последовательности половины участка 2 стадии (b), разделенных последовательностью спейсера, при этом последовательности половины участка 1' и 2' представляют инвертированные повторы соответствующих последовательностей половины участка 1 и 2 стадии (b);

(e) получение второй подгруппы последовательностей-мишеней на основе последовательностей-мишеней первой подгруппы стадии (d), в которой каждую последовательность половин участков вместе с соответствующей последовательностью спейсера последовательностей-мишеней первой подгруппы стадии (d) используют для получения независимой последовательности-мишени второй подгруппы, формируя инвертированный повтор на основании выбранной последовательности половины участка так, чтобы последовательность спейсера разделяла обе последовательности, образуя инвертированный повтор, где последовательности обеих последовательностей половин участков, происходящие от одной последовательности-мишени первой подгруппы стадии (d) при синтезе и до их использования изменяют с получением инвертированного повтора, образующего полную последовательность-мишень так, что в последовательности левой половины участка часть нуклеотидов, отличающихся от соответствующей гомологичной последовательности половины участка известного участка-мишени стадии (а), замещена природными нуклеотидами, находящимися в известном участке-мишени, а в последовательности правой половины участка оставшиеся нуклеотиды, отличающиеся от соответствующей гомологичной левой половины участка, замещены природными нуклеотидами, находящимися в известном участке-мишени так, что в обеих последовательностях половин участков, происходящей из одной из последовательностей-мишеней первой подгруппы стадии (d), взятых вместе, можно найти все отличающиеся нуклеотиды, тогда как ни одна из указанных последовательностей половин участков отдельно не содержит всех отличающихся нуклеотидов;

(f) получения дополнительных подгрупп последовательностей-мишеней на основе последовательностей-мишеней из второй подгруппы, полученных на стадии (e), посредством пошагового повторения процесса стадии (e), каждый раз получая новую подгруппу последовательностей-мишеней до тех пор, пока последовательности половин участков, образующие инвертированные повторы в каждой полученной последовательности-мишени содержат один, два или три нуклеотида, отличающихся от соответствующей гомологичной последовательности половины участка известного участка-мишени;

(g) использования направленной молекулярной эволюции для рекомбиназы, распознающей известный гомологичный участок-мишень, выбранный на стадии (a), с использованием в качестве субстрата последовательностей-мишеней из конечной подгруппы, полученной на стадии (f), содержащих один, два или три нуклеотида, отличающихся от соответствующей гомологичной последовательности половины участка указанного известного гомологичного участка-мишени;

(h) перестановки в библиотеках рекомбиназ, полученных на стадии (g);

(i) использования направленной молекулярной эволюции для библиотеки с перестановками, полученной на стадии (h), с использованием последовательностей-мишеней следующей подгруппы более высокого порядка в соответствии со стадией (f);

(j) повторения стадий (h) и (i) по меньшей мере до тех пор, пока не будет получена посредством направленной молекулярной эволюции одна рекомбиназа, активная в отношении асимметричной последовательности-мишени в LTR ретровирусной ДНК стадии (а);

(k) выделения из библиотеки нуклеиновой кислоты по меньшей мере одной рекомбиназы, полученной на стадии (j); и

(l) клонирования нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (k) в подходящем векторе экспрессии.

В предпочтительном варианте осуществления рекомбиназа, к которой на стадиях (g) и (i) применяют направленную молекулярную эволюцию, происходит из семейства сериновых интеграз или из семейства тирозиновых интеграз, и, предпочтительно, рекомбиназа представляет собой модифицированную рекомбиназу Cre фага P1, модифицированную рекомбиназу FLP дрожжей или модифицированную рекомбиназу Dre фага D6. Предпочтительно, направленная молекулярная эволюция представляет собой эволюцию на основе сшитых с субстратом белков (SLiPE). Вектор экспрессии, кодирующий адаптированную рекомбиназу, предпочтительно, представляет собой ретровирусный вектор, лентивирусный вектор, спумавирусный вектор или аденовирусный вектор.

Во втором аспекте настоящее изобретение относится к медицинскому применению вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу, или к взрослой стволовой клетке, содержащей указанный вектор экспрессии, для получения фармацевтической композиции, снижающей вирусную нагрузку у индивида, инфицированного ретровирусом. Фармацевтическую композицию можно вводить индивиду для лечения инфекции, вызванной широким спектром ретровирусов, например, таких как ВИЧ. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, предпочтительно, используют вместе с сопутствующим введением другого активного средства для высокоактивной противоретровирусной терапии (ВААРТ) или для сопутствующего или дополнительного введения при терапии с целью общей активации иммунитета или специфической активации экспрессии генов провируса.

В соответствии с третьим аспектом настоящее изобретение относится к способу оптимизации лечения ретровирусной инфекции у индивида in vitro, причем способ включает стадии:

(a) определения последовательности нуклеиновой кислоты ретровирусной ДНК, находящейся в образце крови пациента;

(b) сканирования последовательности LTR в последовательности стадии (а) на известные последовательности рекомбинации, для которых получены специфические адаптированные рекомбиназы;

(c) в случае если по меньшей мере одна из указанных известных последовательностей рекомбинации существует, то получения соединения, выбранного из группы, состоящей из вектора экспрессии, содержащего нуклеиновую кислоту адаптированной рекомбиназы, специфически распознающей указанную известную последовательность рекомбинации, указанной адаптированной рекомбиназы, слитого белка, содержащего аминокислотную последовательность указанной адаптированной рекомбиназы, или взрослой стволовой клетки, содержащей указанный вектор экспрессии, в виде фармацевтической композиции для снижения вирусной нагрузки у индивида; в противном случае идентификации последовательностей, гомологичных последовательностям левой половины участка и правой половины участка известных участков-мишеней рекомбиназ по меньшей мере на 30%, причем гомологичные последовательности разделены спейсером из 5-12 нуклеотидов, которые обозначают как "ассиметричные последовательности-мишени";

(d) проведение стадий (b)-(l) указанного выше способа получения вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу, осуществляющую специфическую рекомбинацию асимметричной последовательности-мишени, идентифицированной в LTR провирусной ДНК; и

(e) получения вектора экспрессии, полученного на стадии (d), белка или слитого белка, экспрессированных с указанного вектора экспрессии, или стволовой клетки, трансфицированной или инфицированной указанным вектором экспрессии в виде фармацевтической композиции, снижающей вирусную нагрузку у индивида.

В предпочтительном варианте осуществления направленную молекулярную эволюцию, используемую на стадии (d), применяют для адаптированной рекомбиназы, уже распознающей участок-мишень, отличающийся от участка-мишени рекомбиназы дикого типа.

В другом предпочтительном варианте осуществления адаптированную рекомбиназу, полученную указанными выше способами, включают в коллекцию специфически адаптированных рекомбиназ.

Изобретение также относится к коллекции адаптированных рекомбиназ, в которой каждая распознает особые участки-мишени в геноме провируса.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторами настоящего изобретения впервые предлагается способ, в котором используется подход комбинаторной эволюции на основе сшитых с субстратом белков для получения адаптированной рекомбиназы, распознающей ассиметричную последовательность в последовательности провируса, интегрированного в геном клеток-хозяев.

Направленная эволюция представляет собой лабораторный способ, используемый для выбранных молекул с получением мутаций и идентификации последующих адаптаций к новым свойствам. Таким образом, этот способ является мощным способом отбора ферментов с измененной специфичностью (Yuan et al., 2005, Johannes & Zhao, 2006). Одним из необходимых условий направленной эволюции является наличие исходного фермента, который обладает остаточной активностью для успешной эволюционной стратегии (Bloom et al., 2005). Маловероятно, что на основании неактивного в отношении субстрата фермента могут быть получены варианты, которые будут активны в отношении мишени с минимальным родством.

Способ по настоящему изобретению также можно использовать для адаптации модифицирующих ДНК белков в целом. Однако рекомбиназы являются предпочтительными. Под термином "белок, модифицирующий ДНК" подразумевают любой белок, активность которого приводит к изменению последовательности или структуры нуклеиновой кислоты. Примеры модифицирующих ДНК белков, подходящих для адаптации способом по настоящему изобретению включают белки, вовлеченные в гомологичную рекомбинацию, экзонуклеазы, ДНК-метилазы, ДНК-лигазы, рестрикционные эндонуклеазы, топоизомеразы, транспозазы и резолвазы.

Хотя возможность адаптированных рекомбиназ, полученных посредством направленной эволюции хорошо известна (например, смотри Collins et al., 2003), однако ни один из способов до настоящего времени не привел к успешному применению свойств рекомбиназы для рекомбинации природной ретровирусной последовательности. В статье Flowers et al. (1997) указано, что Cre может снижать вирусную нагрузку в клетках, если вирус содержит участки loxP дикого типа. В статье Lee et al. (2000) дополнительно показано, что Cre может рекомбинировать последовательность спейсера, выбранную из генома ВИЧ-1. Основной проблемой этих подходов являлось, как правило, отсутствие в LTR ВИЧ-1 симметричных участков-мишеней, которые распознаются природными рекомбиназами, например, такими как рекомбиназа Cre, распознающая симметричный инвертированный повтор длиной 13 п.н. со спейсером 8 п.н. Это ограничение описано в статье авторов Saraf-Levy et al. (2006), которые разработали гетероспецифические рекомбиназы, каждая из которых связывалась с одной половиной последовательности-мишени, отличающейся по последовательности. Авторы показали, что при таких условиях две различные рекомбиназы вместе могут рекомбинировать асимметричный участок-мишень. Однако основным недостатком этого подхода является необходимость наличия в клетке-мишени двух различных рекомбиназ. В совокупности ни один из разработанных до настоящего времени в уровне техники подходов не смог дать одну рекомбиназу, которая могла бы рекомбинировать природную последовательность ретровирусного генома.

Авторы настоящего изобретения были первыми, кто понял, что рекомбиназы можно адаптировать к распознаванию ассиметричных участков-мишеней, отличающихся от природных симметричных участков-мишеней, разделяя субстрат на ряд новых подгрупп с меньшими различиями по сравнению с исходной мишенью и постадийно адаптируя рекомбиназы для распознавания этих подгрупп (смотри фиг.1). Кроме того, в дальнейшем, комбинаторный подход позволит отбирать функциональные молекулы, распознающие в данной последовательности асимметричный участок-мишень. Таким образом, используя новый подход прохождения при направленной молекулярной эволюции через промежуточные субстраты, авторы изобретения могут получать ферменты с сильно отличающейся новой специфичностью к ассиметричным мишеням.

Способ по настоящему изобретению, заключающийся в получении вектора экспрессии, кодирующего адаптированную рекомбиназу, которая осуществляет рекомбинацию асимметричных участков-мишеней в LTR провирусной ДНК, встроенной в геном клетки-хозяина, позволяет получать векторы экспрессии, кодирующие адаптированные рекомбиназы, которые рекомбинируют асимметричные участки-мишени, отличающиеся от участка-мишени рекомбиназы дикого типа. Способ по изобретению включает стадии:

(a) определения последовательности LTR провирусной ДНК путем идентификации в ней последовательностей, гомологичных последовательностям левой половины участка и правой половины участка известных участков-мишеней рекомбиназ по меньшей мере на 30%, при этом гомологичные последовательности разделены спейсером из 5-12 нуклеотидов, а гомологичные последовательности LTR, которые наиболее гомологичны известному участку-мишени, представляют собой ассиметричную последовательность-мишень;

(b) получения двух синтетических последовательностей, где первая синтетическая последовательность соответствует последовательности ассиметричной последовательности-мишени стадии (а), которая гомологична левой половине участка указанного известного участка-мишени плюс последовательность спейсера, и ее обозначают как "последовательность половины участка 1", и где вторая синтетическая последовательность соответствует последовательности спейсера плюс последовательность асимметричной последовательности-мишени стадии (а), которая гомологична правой половине участка, и ее обозначают как "последовательность половины участка 2";

(c) определения нуклеотидов в синтетических последовательностях стадии (b), отличающихся от соответствующих гомологичных последовательностей левой половины участка и правой половины участка известного гомологичного участка-мишени стадии (а);

(d) получения первой подгруппы из двух последовательностей-мишеней на основе синтетических последовательностей стадии (b), где первая последовательность-мишень в первой подгруппе содержит инвертированный повтор, состоящий из последовательности половины участка 1 стадии (а) и последовательность половины участка 1', разделенных последовательностью спейсера, и где вторая последовательность-мишень в первой подгруппе содержит инвертированный повтор, состоящий из последовательности половины участка 2' и последовательность половины участка 2 стадии (b), разделенных последовательностью спейсера, где последовательности половин участков 1' и 2' представляют инвертированные повторы соответствующих последовательностей половин участков 1 и 2 стадии (b);

(e) получение второй подгруппы последовательностей-мишеней на основе последовательностей-мишеней из первой подгруппы стадии (d), где каждую из последовательностей половин участков вместе с соответствующей последовательностью спейсера последовательностей-мишеней в первой подгруппе стадии (d) используют для получения независимой последовательности-мишени второй подгруппы, формируя инвертированный повтор на основании выбранной последовательности половины участка так, что последовательность спейсера разделяет обе последовательности, формируя инвертированный повтор, где последовательности обеих половин участков, полученные из одной из последовательностей-мишеней первой подгруппы стадии (d) при синтезе и до их использования изменяют с получением инвертированного повтора, формирующего полную последовательность-мишень так, что в последовательности левой половины участка часть нуклеотидов, отличающихся от соответствующей гомологичной последовательности половины участка известного участка-мишени стадии (а), замещена природными нуклеотидами, находящимися в известном участке-мишени, а в последовательности правой половины участка оставшиеся нуклеотиды, отличающиеся от соответствующей гомологичной левой половины участка, замещены природными нуклеотидами, находящимися в известном участке-мишени так, что в обеих последовательностях половин участков, происходящей из одной из последовательностей-мишеней первой подгруппы стадии (d), взятых вместе, можно найти все отличающиеся нуклеотиды, тогда как ни одна из указанных последовательностей половин участков отдельно не содержит всех отличающихся нуклеотидов;

(f) получения дополнительных подгрупп последовательностей-мишеней на основе последовательностей-мишеней из второй подгруппы, полученных на стадии (e), посредством пошагового повторения процесса стадии (e), каждый раз получая новую подгруппу последовательностей-мишеней, до тех пор пока последовательности половин участков, формирующие инвертированные повторы в каждой полученной последовательности-мишени содержат один, два или три нуклеотида, отличающихся от соответствующей гомологичной последовательности половины участка известного участка-мишени;

(g) применения направленной молекулярной эволюции для рекомбиназы, распознающей известный гомологичный участок-мишень, выбранный на стадии (a), с использованием в качестве субстрата последовательностей-мишеней из конечной подгруппы, полученной на стадии (f), содержащих один, два или три нуклеотида, отличающихся от соответствующей гомологичной последовательности половины участка указанного известного гомологичного участка-мишени;

(h) перестановки в библиотеках рекомбиназ, полученных на стадии (g);

(i) применения направленной молекулярной эволюции для библиотеки с перестановками, полученной на стадии (h), с использованием последовательностей-мишеней следующей подгруппы более высокого порядка в соответствии со стадией (f);

(j) повторения стадий (h) и (i) по меньшей мере до получения посредством направленной молекулярной эволюции одной рекомбиназы, которая активна в отношении ассиметричной последовательности-мишени в LTR ретровирусной ДНК стадии (а);

(k) выделения из библиотеки нуклеиновой кислоты по меньшей мере одной рекомбиназы, полученной на стадии (j); и

(l) клонирования нуклеиновой кислоты, полученной на стадии (k) в подходящем векторе экспрессии.

На стадии (a) способа по настоящему изобретению определяют последовательность LTR провирусной ДНК, например, посредством секвенирования ДНК с использованием терминирующих цепь ингибиторов (Sanger et al., 1977). Однако если последовательность LTR ретровирусной ДНК, встроенной в геном хозяина, уже определена, то эту стадию можно пропустить. Кроме того, можно использовать известные последовательности, доступные в базах данных последовательностей. На основе информации последовательности проводят компьютерный анализ информации последовательности с идентификацией в ней последовательностей, которые гомологичны по меньшей мере на 30%, соответственно, последовательностям левой половины участка и правой половины участка известных участков-мишеней известных рекомбиназ, которые разделены подходящим спейсером из 5-12 нуклеотидов.

Как используют в настоящем документе термин "рекомбиназа" относится к белку, вовлеченному в рекомбинацию. По существу рекомбиназы распознают и связывают две специфические последовательности ДНК, обозначенные как "участки рекомбинации" или "участки-мишени " и опосредуют рекомбинацию между этими двумя участками-мишенями. Таким образом, под термином "рекомбиназа" понимают любой белковый компонент любой системы рекомбинации, которая опосредует перестановку ДНК в конкретном локусе ДНК. Природные рекомбиназы распознают симметричные участки-мишени, состоящие из двух идентичных последовательностей, обозначенных как "половина участка" приблизительно из 9-20 п.н., формирующих инвертированный повтор, где последовательности половин участков разделены последовательностью спейсера из 5-12 п.н.

Следует отметить, что в настоящем изобретении, а также в данной области термины "последовательность-мишень", "участок-мишень" и "участок рекомбинации" используют взаимозаменяемо.

В отличие от природных рекомбиназ, распознающих симметричные участки-мишени, способ по настоящему изобретению относится к адаптированным рекомбиназам, распознающим непалиндромные участки-мишени, разделенных спейсером. В отличие от природных в последовательностях ассиметричных участков-мишеней не формируется инвертированный повтор. Таким образом, адаптированная рекомбиназа, способная распознавать ассиметричный участок-мишень, может распознавать и рекомбинировать участки-мишени, состоящие из половин участков различной последовательности.

В асимметричном участке-мишени последовательности, обозначаемые как "левая половина участка" и "правая половина участка", соответственно, определены по их гомологии с левой и правой половинами участка известного участка-мишени. Последовательность, расположенную между последовательностями, гомологичными левой и правой половинам участка известного участка-мишени, обозначают как спейсер.

Однако если последовательности расположены в LTR, который гомологичен только последовательности левой или правой половины участка известного участка-мишени, тем не менее эти последовательности можно использовать в практическом осуществлении настоящего изобретения. Размер участка-мишени, с которым взаимодействует рекомбиназа, природная последовательность-мишень которой демонстрирует гомологию с последовательностями в LTR, известна специалисту. Например, если гомология с последовательностью-мишенью, распознаваемой рекомбиназой Cre, находится в последовательности LTR, асимметричный участок-мишень для распознавания рекомбиназой Cre должен состоять из 34 нуклеотидов с двумя последовательностями половин участков из 13 нуклеотидов каждый, разделенных спейсер