Конъюгаты для лечения мезотелиомы

Конъюгаты для лечения мезотелиомы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к терапии злокачественных опухолей, в частности, к применению конъюгатов цитокинов и нацеливающих пептидов для лечения злокачественной мезотелиомы плевры (MPM). Более конкретно, изобретение относится к применению конъюгата, содержащего пептид, содержащий мотив NGR, и TNF (NGR-TNF), для лечения MPM.

Предпосылки изобретения

Злокачественная мезотелиома плевры (MPM) представляет собой редкую агрессивную неоплазию, первоначально возникающую из поверхностных серозных клеток плевральных полостей, как правило, ассоциированную с плохим прогнозом. Заболеваемость MPM в мире увеличивается, и ожидают ее увеличения в следующие 10-20 лет из-за увеличивающегося подвергания воздействию асбеста в последние годы.

Не существует стандарта терапии для лечения MPM, и только небольшое число пациентов допущено к какой-либо потенциально излечивающей терапии. Осложнения цитотоксической химиотерапии сильно влияют на решение лечащего врача при лечении пациентов старшего возраста (в возрасте 65 лет и старше) и/или с плохим общим состоянием (PS≥2) из-за возникновения случаев частых и тяжелых сопутствующих заболеваний, которые могут осложнять терапию (Repetto, J. Support Oncol. 2003, 1(4 Suppl.2):18-24). Общее состояние (PS) согласно Восточной объединенной онкологической группе (ECOG, Robert Comis M.D., Group Chair), представляет собой шкалы и критерии, используемые врачами и исследователями, чтобы оценивать, как прогрессирует заболевание пациента, оценивать, как заболевание влияет на способность пациентов к повседневной деятельности и определять подходящее лечение и прогноз (Oken, et al. 1982 Am J Clin Oncol 5:649-655). Общее состояние 2 обозначает «амбулаторных пациентов, способных к полному самообслуживанию, но неспособных осуществлять какую-либо трудовую деятельность. На ногах более 50% времени бодрствования». Демографические аспекты, как описано выше, необходимо принимать во внимание при лечении пациентов с мезотелиомой, учитывая, что медианный возраст дебюта заболевания составляет 74 лет, и что более 50% пациентов обладают общим состоянием 2 или хуже при диагностике (Chapman et al. Thorax 2008, 63(5):435-439).

В течение последних 20 лет изучали несколько способов, даже если для режима с применением платины показывали большую активность, чем для не содержащей платины комбинации, их эффекты, по-видимому, являются умеренными в отношении свободной от прогрессирования выживаемости (относительно сильный предсказательный параметр выживаемости), выживаемости и токсичности (Fennell et al. Nat. Clin. Pract. Oncol. 2008, 5(3): 136-147).

Обзор современного прогресса и клинических данных по лечению MPM приведен в Ceresoli et al. The Oncologist 2007, 12:850-863. С помощью видов терапии с одним способом лечения (хирургия, радиотерапия и химиотерапия) не удавалось продлить выживаемость пациентов.

Пеметрексед динатрия в сочетании с цисплатиной является первым и единственным химиотерапевтическим средством, получившим разрешение на реализацию для лечения не подвергавшихся химиотерапии пациентов с нерезектабельной злокачественной мезотелиомой плевры. Однако, способом с этим химиотерапевтическим средством достигали только умеренного увеличения в отношении свободной от прогрессирования (5,7 по сравнению с 3,9 месяцами) и общей выживаемости (12,1 по сравнению с 9,3 месяцами) по сравнению с монохимиотерапией цисплатиной. Более того, эта химиотерапевтическая комбинация даже при применении у избранной популяции пациентов (медианный возраст 60 лет, общее состояние по Карновскому по меньшей мере 70, которое обозначает пациента, который обслуживает себя и является неспособным осуществлять нормальную активность или выполнять активную работу; или даже лучшее общее состояние) являлась неожиданно токсичной и привела к нескольким связанным с лечением случаям смерти. Токсичность являлась обусловленной вмешательством в метаболизм гомоцистеина и привела к изменению протокола посредством добавления профилактического применения витамина B12 и фолата, в качестве дополнения к терапии. Частота случаев тяжелой токсичности с использованием пеметрекседа плюс цисплатина с полным дополнением витаминами, в предназначенной для лечения (ITT) популяции, была выше по сравнению с популяцией после лечения одной цисплатиной (Vogelzang et al. J Clin Oncol 2003, 21 (14): 2636-2644).

К настоящему времени несколько биологических средств оценены в клинических исследованиях фазы II, но ни одно из них в результате не оказалось эффективным, даже при тестировании в терапии первого ряда и в комбинированной терапии, показывая в некоторых условиях небезопасную картину токсичности. Клинические исследования фокусировали на рецепторе эпидермального фактора роста (EGFR), который на высоком уровне экспрессируется при MPM (Destro et al. Lung Cancer 2006; 51:207-215; Edwards et al Lung Cancer, 2006; 54:399-407), и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и тромбоцитарного фактора роста (PDGF), которые являются важными аутокринными факторами роста при этом заболевании. Применение ингибиторов этих рецепторов исследовали для лечения первого ряда для мезотелиомы.

В частности, в клиническом исследовании фазы II ингибитор EGFR гефитиниб (Иресса®), одобренный для лечения немелкоклеточного рака легкого на поздних стадиях и оказывающий заметный антипролиферативный эффект на клетки мезотелиомы in vitro (Janne et al., Cancer Res 2002, 62:5242-5247), в результате оказался неактивным в качестве терапии первого ряда, с медианной свободной от прогрессирования выживаемостью менее трех месяцев, хотя 97% пациентов с мезотелиомой обладали сверхэкспрессией EGFR (Govindan et al. Clin Cancer Res, 2005; 11:2300-2304). В этом исследовании для гефитиниба показали класс-специфический профиль токсичности с наиболее распространенными неблагоприятными эффектами 3 степени (степень 3: тяжелые побочные эффекты), представленными диареей, кожной сыпью и утомляемостью.

Подобным образом, показали, что Иматиниб (Гливек®), 2-фениламинопиримидиновый ингибитор тирозинкиназы, известный, как действующий как на рецепторы c-Kit, так и на рецепторы PDGF альфа и бета, и одобренный для лечения хронического миелоидного лейкоза, не является эффективным в качестве монотерапии первого ряда в отношении времени до прогрессирования опухоли (<3 месяцев). Более того, лечение прервали у 40% пациентов из-за побочных эффектов. Главными побочными эффектами являлись отек (голеностопных суставов, лица, гениталий и легких), иногда вызывающий обострение плевральных или абдоминальных выпотов, тошнота и рвота (Mathy et al. Lung cancer 2005 50:83-86).

Исследовали применение ингибиторов ангиогенеза (Ceresoli et al. The Oncologist 2007, 12:850-863). Опубликована определенная активность для SU5416, высоко избирательного ингибитора тирозинкиназ рецепторов, нацеленного на рецепторы VEGF Flt-1 и KDR/Flk, осложняемая избыточным риском тромбоза.

Для ваталиниба (PTK787), ингибитора тирозинкиназ рецепторов VEGF и PDGF, показали медианную свободную от прогрессирования выживаемость 4 месяца при введении не подвергавшимся химиотерапии пациентам в качестве терапии первого ряда. Токсичность степени 3/4 (степень 3: тяжелые побочные эффекты, степень 4: опасные для жизни или инвалидизирующие побочные эффекты) приводила к желудочно-кишечному кровотечению, нейтропении, лимфопении, тошноте/рвоте, увеличенному уровню ALT/AST, гипертензии (Jahan et al., J. Clin. Oncol., 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol. 24, N° 18S (June supplement), 2006:7081).

Бевацизумаб, рекомбинантное человеческое моноклональное антитело против VEGF, блокирующее связывание VEGF с его рецепторами, оценивали в качестве терапии первого ряда в сочетании с химиотерапией в двойном слепом контролируемом плацебо рандомизированном исследовании фазы II. С комбинацией бевацизумаб плюс цисплатина и гемцитабин (BGC) у пациентов без предшествующего лечения не достигали конечной точки первичного исследования, без какого-либо значительного улучшения медианной свободной от прогрессирования выживаемости (6,9 месяцев для BGC по сравнению с 6,0 месяцами для одной химиотерапии, p=0,88) или медианной общей выживаемости (15,6 месяцев для GCB по сравнению с 14,7 месяцев для одной химиотерапии, p=0,91). Более того, статистически значимую более высокую частоту различных случаев токсичности, состоящей из алопеции, гипертензии, эпистаксиса, протеинурии, стоматита и не нейтропенической инфекции, наблюдали в группе бевацизумаба (Karrison et al., J Clin Oncol. 25 (18S (June 20 Supplement)), 2007: 7526).

Все клинические исследования, проведенные до настоящего времени, показали, что даже такие лекарственные средства, как иматиниб или гефитиниб, уже одобренные для лечения конкретных типов опухолей, являются не активными при мезотелиоме. Более того, лекарственные средства, эффективные в результате для доклинических моделей мезотелиомы, не обладали активностью у человека. Эти данные подтверждают, что противоопухолевая активность лекарственного средства против определенных типов опухолей не является предсказательной для его противоопухолевой активности для другого типа злокачественной опухоли. Различные типы злокачественных опухолей, поражающие различные органы, обладают различной этиологией, различным лежащим в основе спектром молекулярных взаимодействий и различными способами роста. Специалист в данной области не в состоянии предсказать, является или нет лекарственное средство, эффективное в результате для лечения опухоли, активным против другого типа опухолей.

В настоящее время не существует стандартных способов лечения, доступных для пациентов с прогрессированием после химиотерапии первого ряда при MPM. Эта популяция пациентов обладает очень агрессивным заболеванием с медианной свободной от прогрессирования выживаемости 1,5 месяца, опубликованной при использовании только наилучшей поддерживающей терапии (Jassem et al., J Clin Oncol. 2008; 26(10):1698-704). Рецидивирующая опухоль почти неизменно является более устойчивой к терапии второго ряда, чем она являлась при первом проявлении и лечении (Broxterman et al., Drug Resist Updat. 2003; 6(3):111-27). Более того, переносимость пациентами терапии следующего ряда, как правило, хуже, чем химиотерапии первого ряда (Berthold et al., J Clin Oncol. 2005;23(32):8247-8252).

Целью терапии второго ряда является не только эффективность для терапии злокачественной опухоли, но также относительная безопасность и низкий профиль токсичности для пациентов.

Несколько средств изучали в терапии второго ряда для мезотелиомы, но не наблюдали улучшения эффективности и токсичности.

Недавно опубликовано рандомизированное многоцентровое исследование фазы III, изучающее пеметрексед плюс наилучшую поддерживающую терапию по сравнению только с наилучшей поддерживающей терапией для пациентов с мезотелиомой после предшествующего лечения. Хотя статистически значимо более длительное время до прогрессирования заболевания показали в группе с введением химиотерапии (3,7 месяцев, 95% 2CI: 3,0-4,4) по сравнением с группой наилучшей поддерживающей терапии (1,5 месяца, 95% CI: 1,4-1,7), не показали улучшения общей выживаемости (8,4 по сравнению с 9,7 месяцами, соответственно). Наиболее частая токсичность степени 3/4 преимущественно представляла собой гематологическую и не гематологическую токсичность, такую как фебрильная нейтропения и утомляемость (Jassem et al., J Clin Oncol 2008; 26(10):1698-704).

В несравнительном многоцентровом исследовании фазы II комбинацию бевацизумаб плюс эрлотиниб исследовали на пациентах с нерезектабельной мезотелиомой, ранее подвергавшихся одному предшествующему режиму химиотерапии. К сожалению, в этом клиническом исследовании не было клинических ответов, при времени до прогрессирования опухоли 2,7 месяцев. Профиль токсичности характеризовался несколькими случаями токсичности 3 степени, включая кожную сыпь, диарею, тромбоз (Jackman et al., J Thorac Oncol 2007; 2 (8):S602). В другом несравнительном многоцентровом исследовании фазы II пациентов, либо не подвергавшихся лечению, либо ранее подвергавшихся химиотерапии, лечили с помощью многонаправленного ингибитора тирозинкиназ сорафениба. Среди ранее подвергавшихся лечению пациентов, медианная свободная от прогрессирования выживаемость составляла 3,6 месяцев. Токсичность 3/4 степени приводила к ладонно-подошвенному синдрому и утомляемости (Janne P, et al., J Clin Oncol 2007; 25 (18S): Abstract 7707).

Таким образом, существует необходимость в эффективных лекарственных средствах, обладающих благоприятным профилем токсичности, для лечения мезотелиомы. Настоящее изобретение направлено на эту необходимость. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что конъюгаты, содержащие нацеливающий пептид и цитокин, являются эффективными для лечения злокачественной мезотелиомы плевры, и что такие конъюгаты обладают хорошо переносимым профилем токсичности.

В WO 01/61017 описан продукт конъюгации между TNF или IFNг и лигандом рецептора CD13, в частности, пептидом, содержащим мотив NGR. Данные, описанные в патенте, показывают, что конъюгаты TNF являются эффективными для лечения моделей лимфомы и меланомы на мышах. Кроме того, конъюгаты IFNг и пептида, содержащего мотив NGR, оказывают сильный противоопухолевый эффект на моделях лимфомы и фибросаркомы на мышах (Curnis et al., Cancer Res. 2005;65(7):2906-2913). Описаны конъюгаты различных цитокинов и нацеливающих на опухоль групп (WO 03/092737), и показано (WO 03/093478), что фармацевтические композиции, содержащие такие конъюгаты, эффективны в чрезвычайно низких дозах, не индуцирующих активацию механизма отрицательной обратной связи. В WO 2006/067633 описаны пептиды, содержащие продукты деградации мотива NGR, способные нацеливаться на интегрин бvв3, и конъюгаты, содержащие эти пептиды и цитокины. Ни в одном из этих документов не описана эффективность конъюгатов цитокинов для лечения злокачественной мезотелиомы плевры.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к области терапии злокачественных опухолей и, в частности, к лечению злокачественной мезотелиомы плевры.

В настоящее время эталонный режим в качестве терапии первого ряда представляет собой комбинацию цисплатины плюс пеметрексед, агрессивный химиотерапевтический способ с умеренным увеличением по отношению к свободной от прогрессирования выживаемости и медианной выживаемости, и тяжелыми побочными эффектами. Более важно, с учетом естественного анамнеза заболевания, где пациенты умирают в течение одного года после постановки диагноза, доступность новых средств для разработки второго ряда приобретает первостепенную важность. К сожалению, не существует стандартных способов лечения, доступных для пациентов с прогрессированием после химиотерапии первого ряда при MPM, и наилучшая поддерживающая терапия остается эталонным способом для этих пациентов.

Несколько новых лекарственных средств исследовали как отдельные средства или в сочетании, но ни одно из них в результате не оказалось эффективным. В частности, до настоящего времени не опубликовано увеличения свободной от прогрессирования и общей выживаемости, в то время как большое число случаев токсичности степени 3 (тяжелые побочные эффекты) или 4 (опасные для жизни или инвалидизирующие побочные эффекты) наблюдали в клинических исследованиях фазы II и фазы III.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что введение конъюгата, содержащего нацеливающий пептид и цитокин, является эффективным для лечения мезотелиомы, в частности, в отношении увеличения свободной от прогрессирования выживаемости и хорошо переносимого профиля токсичности конъюгата.

В частности, наблюдали, что введение конъюгата, содержащего нацеливающий пептид CNGRC, присоединенный через аминокислоту G (глицин) к TNF человека, приводит к благоприятному клиническому результату у пациентов, невосприимчивых или устойчивых к стандартному режиму химиотерапии первого ряда. Предварительный анализ пациентов, зарегистрированных для первой стадии исследования, показал, что 7 пациентов (44%; 95% доверительный интервал (CI) 20-68%) обладали стабильным заболеванием (SD) в качестве наилучшего ответа, с медианной продолжительностью 4,4 месяца (диапазон 1,6-7,1+ месяцев). Рассчитанная частота свободной от прогрессирования выживаемости 4,5 месяца составляла 37% (95% CI 10-65%), и 3 пациента (19%) являлись свободными от прогрессирования через 6 месяцев.

После окончания исследования, общие результаты, полученные при лечении 57 пациентов, показали, что NGR-hTNF удваивал свободную от прогрессирования выживаемость, наблюдаемую для наилучшей поддерживающей терапии, которая представляет собой эталонное лечение для этой популяции пациентов, для которых нет стандартной терапии. Кроме того, результаты, полученные с помощью NGR-hTNF в отношении свободной от прогрессирования выживаемости, являются сравнимыми с результатами, полученными при комбинированной терапии, такой как гемцитабин плюс винорелбин или бевацизумаб плюс эрлотиниб, с преимуществом введения только одного лекарственного средства, не обладающего токсичностью, ассоциированной с этими лекарственными средствами.

Такие данные показывают, что конъюгаты цитокинов и нацеливающих пептидов можно успешно использовать для лечения мезотелиомы, даже в качестве терапии второго ряда для пациентов, невосприимчивых или устойчивых к режиму химиотерапии, что означает эффективность даже для более устойчивой опухоли, чем при первом проявлении и лечении.

Более того, введение низкой дозы (0,8 мкг/м²) с режимом введения раз в три недели или раз в неделю, являлось ассоциированным с поддающимся коррекции и благоприятным профилем токсичности, только с одним пациентом (2%), испытывающим токсичность 3 степени, и с не сообщенными до настоящего времени ни неблагоприятными событиями 4 степени, ни связанной с лечением смерти. Основными видами токсичности степени 1 (слабые побочные эффекты) или 2 (умеренные побочные эффекты) для пациента являлись преходящие связанные с инфузией системные симптомы, включая озноб (длящийся приблизительно 15-30 минут). Наблюдаемый низкий профиль токсичности является ключевым преимуществом при лечении мезотелиомы, особенно принимая во внимание, что медианный возраст дебюта заболевания составляет 74 года.

Таким образом, цель терапии второго ряда, т.е. эффективность в отношении свободной от прогрессирования выживаемости и низкий профиль токсичности для пациентов, полностью достигнута посредством применения конъюгатов по настоящему изобретению для лечения мезотелиомы, и ясно указывает на их эффективность в качестве терапии первого ряда.

Изложение сущности изобретения

Согласно одному аспекту изобретения представлен конъюгат, содержащий нацеливающий пептид и цитокин, для применения для лечения мезотелиомы.

Предпочтительно цитокин представляет собой TNFб, TNFв, IFNг, IL12.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения представлен конъюгат, где нацеливающий пептид представляет собой пептид, содержащий мотивы NGR или изоDGR, или RGD.

Предпочтительно, нацеливающий пептид представляет собой пептид, содержащий мотив NGR.

Более предпочтительно, нацеливающий пептид выбран из группы, состоящей из линейных или циклических CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, CVLNGRMEC, CNGRC, CNGRCG, LNGRE, YNGRT LQCICTGNGRGEWKCE, LQCISTGNGRGEWKCE, CICTGNGRGEWKC, CISTGNGRGEWKC, MRCTCVGNGRGEWTCY, MRCTSVGNGRGEWTCY, CTCVGNGRGEWTC и CTSVGNGRGEWTC.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения представлен конъюгат, где цитокин представляет собой TNF, связанный с нацеливающим пептидом CNGRC через спейсер. Предпочтительно, спейсер представляет собой G (глицин).

Согласно следующему аспекту изобретения представлен способ лечения мезотелиомы, включающий введение конъюгата, содержащего нацеливающий пептид и цитокин, для лечения мезотелиомы.

Согласно другому аспекту изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество конъюгата, содержащего нацеливающий пептид и цитокин, вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и разбавителями.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения представлена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество конъюгата, содержащего TNF, связанный с нацеливающим пептидом CNGRC через спейсер G, вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и разбавителями.

Более предпочтительно, фармацевтическая композиция предназначена для лечения мезотелиомы.

Согласно следующему аспекту изобретения представлен фармацевтический состав, содержащий конъюгат, содержащий TNF, связанный с нацеливающим пептидом CNGRC через спейсер G, в концентрации в диапазоне 0,01-10 мг/мл вместе с фармацевтически приемлемыми носителями и разбавителями.

Предпочтительно, фармацевтический состав состоит из 0,150 мг/мл конъюгата, содержащего TNF, связанный с нацеливающим пептидом CNGRC через спейсер G, растворенного в растворе 50 мМ Na₂HPO₄, 150 мМ NaCl.

Подробное описание изобретения

Подробное описание предпочтительных признаков и вариантов осуществления по изобретению описано посредством неограничивающего примера.

Изобретение может осуществлять на практике обычный специалист в данной области, который может применять, если нет иных указаний, общепринятые способы химии, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии. Все такие способы описаны и объяснены в опубликованной литературе. Смотри, например, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 и периодические дополнения; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. Содержание всех этих публикаций приведено в качестве ссылки.

Нацеливающие пептиды

Термин «пептид» в настоящем документе включает полипептиды и белки. Термин «полипептид» включает одноцепочечные полипептидные молекулы, так же как комплексы множества полипептидов, в которых отдельные составляющие полипептиды связаны ковалентными или нековалентными способами. Термин «полипептид» включает пептиды длиной две или более аминокислоты, как правило, обладающие более 5, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 аминокислот.

Пептиды, которые можно применять по изобретению, могут содержать аминокислоты в конфигурации D или L. Более того, можно использовать модифицированные пептиды, например, для уменьшения иммуногенности, для увеличения периода полувыведения из кровотока в организме пациента, для увеличения биодоступности и/или для увеличения эффективности и/или специфичности.

Описан ряд способов модификации пептидов для терапевтического применения. Пептиды можно присоединять ко множеству полимеров, таких как полиэтиленгликоль (PEG) и полипропиленгликоль (PPG) (смотри, например, Патенты США No. 5091176, 5214131 и США 5264209) или к бифункциональным сшивающим средствам, таким как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат, сукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат и сульфосукцинимидил-6-[3-(2-пиридилдитио)пропионамидо]гексаноат (смотри Патент США 5580853).

В настоящем документе термин нацеливающий пептид обозначает пептид, как определено ранее, способный связываться с рецептором, экспрессированным на ассоциированных с опухолью сосудах, или с компонентом внеклеточного матрикса, ассоциированным с сосудами опухоли.

Нацеливающий пептид из конъюгата может являться нацеленным на следующие рецепторы: CD13/Аминопептидаза N или интегрины.

Аминопептидазы представляют собой большую группу ферментов, вовлеченных в ряд биологических процессов, таких как созревание, регуляция и деградация белков и полипептидов. В частности, в исследованиях in vitro и in vivo недавно показали, что аминопептидаза N (CD13/APN), рецептор для аминокислотной последовательности NGR, играет множество ролей в ангиогенезе и является критическим для развития новых кровеносных сосудов из существующих сосудов при патологических состояниях, в то время как не является необходимым для образования кровеносных сосудов de novo при эмбрионально-плодовом развитии и нормальном функционировании взрослого (Pasgualini, Koivunen et al. 2000; Arap, Kolonin et al. 2002 Bhagwat, Lahderanta et al. 2001; Bhagwat, Petrovic et al. 2003; Fukasawa, Fujii et al. 2006; Rangel, Sun et al. 2007).

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления нацеливающий пептид представляет собой пептид, содержащий мотив NGR. Пептид, содержащий мотив NGR, и способ идентификации таких пептидов описаны в WO 98/10795 и WO 99/13329, содержание которых приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

В особенно предпочтительном варианте осуществления нацеливающий пептид выбран из группы, состоящей из линейных или циклических CNGRCVSGCAGRC, NGRAHA, GNGRG, CVLNGRMEC, CNGRC, CNGRCG, LNGRE, YNGRT LQCICTGNGRGEWKCE, LQCISTGNGRGEWKCE, CICTGNGRGEWKC, CISTGNGRGEWKC, MRCTCVGNGRGEWTCY, MRCTSVGNGRGEWTCY, CTCVGNGRGEWTC и CTSVGNGRGEWTC.

Молекула интегрина состоит из двух нековалентно связанных трансмембранных гликопротеиновых субъединиц, называемых б и в. Поскольку одна и та же молекула интегрина на различных типах клеток может обладать различной лиганд-связывающей специфичностью, по-видимому, дополнительные специфические для типа клеток факторы могут взаимодействовать с интегрином и модулировать его активность связывания. Субъединицы б и в могут объединяться различными способами для формирования интегриновых рецепторов. Природными лигандами интегрина являются белки адгезии внеклеточного матрикса, такие как фибронектин, витронектин, коллагены, ламинин.

Многие интегрины, в частности, интегрин бvв3, узнают аминокислотную последовательность RGD (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота). В следующем варианте осуществления нацеливающий пептид представляет собой пептид, способный связывать интегрин бvв3, в частности, пептид, содержащий мотив RDG.

Другими лигандами интегрина бvв3 являются пептиды, содержащие продукты деградации мотива NGR. Подробно эти пептиды описаны в WO 2006/067633, содержание которой приведено в настоящем документе в качестве ссылки. В следующем варианте осуществления нацеливающие пептиды представляют собой пептиды, содержащие продукт деградации мотива NGR, в частности, пептиды, содержащие мотив изоDGR.

В особенно предпочтительном варианте осуществления нацеливающие пептиды выбраны из группы, состоящей из линейных или циклических CизоDGRCVSGCAGRC, изоDGRAHA, GизоDGRG, CVLизоDGRMEC, CизоDGRC, CизоDGRCG, LизоDGRE, YизоDGRT, LQCICTGизоDGRGEWKCE, LQCISTGизоDGRGEWKCE, CICTGизоDGRGEWKC, CISTGизоDGRGEWKC, MRCTCVGизоDGRGEWTCY, MRCTSVGизоDGRGEWTCY, CTCVGизоDGRGEWTC или CTSVGизоDGRGEWTC.

Конъюгаты

Настоящее изобретение относится к применению конъюгата, содержащего нацеливающий пептид, связанный с цитокином, для лечения мезотелиомы. Неограничивающий перечень цитокинов, которые можно использовать в конъюгате по настоящему изобретению, представляет собой TNFб, TNFв, IFNб, IFNв, IFNг, IL-I, 2, 4, 6, 7, 12, 15, EMAP II, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), PDGF, PD-ECGF или хемокин.

Предпочтительно, цитокин представляет собой TNFб, TNFв, IFNг, IL12.

В настоящем документе термин «связанный» обозначает, что нацеливающий пептид соединен с цитокином посредством химического соединения, так чтобы формировать слитый белок, где первая последовательность (нацеливающий пептид) способна транспортировать вторую последовательность к клетке-мишени. Таким образом, нацеливающий пептид из конъюгата связан с цитокином через их полипептидный остов, и получившийся слитый белок получают посредством генетической экспрессии в клетках-хозяевах последовательности ДНК, кодирующей этот белок, или прямого синтеза белков, или объединения предварительно полученных последовательностей, соединенных посредством сшивающего средства.

Нацеливающий пептид можно связывать с цитокином непосредственно или опосредованно через спейсер. Спейсер может представлять собой отдельную аминокислоту или аминокислотную последовательность, или органический остаток, например 6-аминокаприл-N-гидроксисукцинимид.

В одном варианте осуществления нацеливающий пептид предпочтительно связан с N-концом или C-концом цитокина, чтобы избежать каких-либо помех для связывания цитокина с его рецептором. Альтернативно, пептид можно связывать с аминокислотными остатками, являющимися акцепторами амидных или карбоксильных связей, естественно встречающимися в молекуле или искусственно вставленными способами генетической инженерии. Конъюгат получают с использованием кДНК, содержащей 5'-примыкающую или 3'-примыкающую последовательность, кодирующую пептид.

TNF-б

TNF-б: TNF-б человека представляет собой негликозилированный полипептид из 233 ак остатков, существующий либо как трансмембранный, либо как растворимый белок. При экспрессии в форме связанного с мембраной белка 26 кДа TNF-б состоит из цитоплазматического домена из 29 ак остатков, трансмембранного участка из 28 ак остатков и внеклеточной области из 176 ак остатков. Растворимый белок образуется при событии протеолитического расщепления посредством TNF-альфа-превращающего фермента (TACE) 85 кДа, который отщепляет фрагмент из 76 ак (остатки 1-76 из последовательности 233 ак) и образует остаточную молекулу 17 кДа, 157 ак, в норме циркулирующую в виде гомотримера. Последовательность трансмембранного и растворимого белка TNF-б можно найти на сервере протеомики ExPASy (Expert Protein Analysis System) Швейцарского Института биоинформатики, www.expasy.com, база данных UniProtKB/Swiss-Prot, запись P01375.

TNF-б представляет собой плейотропный трансмембранный белок, с широким спектром клеточной и тканевой биологической активности, лежащей в диапазоне от усиления пролиферации до направления цитотоксичности на клетки опухоли, активации врожденного и адаптивного иммунного ответа и действия на эндотелий (Watanabe, Niitsu et al. 1988; Fajardo, Kwan et al. 1992).

Согласно предпочтительному аспекту изобретения представлен продукт конъюгации между TNF и пептидом CNGRC, в котором, предпочтительно, N-конец TNF связан с пептидом, предпочтительно, посредством спейсера, для применения для лечения мезотелиомы. Предпочтительно, спейсер представляет собой G (глицин).

IFNг

Интерферон-г (IFN-г), представляет собой плейотропный цитокин, который в основном продуцируют T-лимфоциты и клетки натуральные киллеры (Farrar, et al., 1993; Boehm et al., 1997), стимулирует противоопухолевые ответы. IFN-г существует в виде гомодимера двух нековалентно связанных полипептидных субъединиц. Последовательность IFN-г человека можно найти на интернет-сайте NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), база данных белков, инвентарный номер AAB59534.

IFN-г способен стимулировать противоопухолевый ответ посредством индукции антипролиферативных и проапоптотических эффектов на множество типов клеток опухолей, посредством ингибирования ангиогенеза опухолей и активации клеток натуральных киллеров и макрофагов против клеток опухолей.

Согласно предпочтительному аспекту изобретения, представлено применение продукта конъюгации между IFNг и пептидом CNGRC, в котором, предпочтительно, N-конец IFNг связан с пептидом, предпочтительно, посредством спейсера, где, предпочтительно, спейсер представляет собой G (глицин), для лечения мезотелиомы.

IL12

IL12 (p70) представляет собой гликозилированный гетеродимер, состоящий из связанных дисульфидными мостиками субъединиц p40 и p35, кодируемых двумя отдельными генами. Правильная сборка гетеродимера происходит внутри продуцирующих клеток. IL12 индуцирует IFNг и другие нижестоящие белки, включая индуцируемый IFNг белок-10 (IP10) и индуцируемый IFNг монокин (Mig), активирует иммунные ответы и ингибирует ангиогенез. Противоопухолевую активность наблюдали после перитуморального введения IL12 или при использовании клеток опухолей, генетически модифицированных для продукции IL12. Последовательность IL12 человека можно получить с интернет-сайта NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), база данных белков, инвентарные номера M65271 (субъединица p35 человека) и M65272 человека (субъединица p40).

Фармацевтический состав

Следующей целью настоящего изобретения является фармацевтический состав для лечения индивидуума, где состав содержит терапевтически эффективное количество конъюгата, содержащего нацеливающий пептид и цитокин. В предпочтительном аспекте фармацевтический состав содержит конъюгат цитокина TNF, связанного с нацеливающим пептидом CNGRC посредством спейсера G (глицин), в особенно предпочтительном аспекте состав предназначен для лечения мезотелиомы.

Необязательно, состав может содержать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, наполнитель или адъювант. Выбор фармацевтического носителя, наполнителя или разбавителя можно осуществлять на основании предполагаемого способа введения и общепринятой фармацевтической практики. Фармацевтический состав может содержать в качестве - или помимо - носителя, наполнителя или разбавителя любое пригодное связывающее средство(средства), смазывающее средство(средства), суспендирующее средство(средства), покрывающее средство(средства), солюбилизирующее средство(средства) и другие средства - носители, которые могут облегчать или увеличивать вхождение вируса в участок-мишень (например, такие как липидная система доставки). Пригодные носители и разбавители включают в себя изотонические солевые растворы, например, фосфатно-солевой буфер. Описание наполнителей, которые можно использовать по изобретению, можно найти в The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edn, Eds Wade & Weller, American Pharmaceutical Association. Состав по изобретению может являться предназначенным для парентерального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, внутриглазного, перорального или чрескожного введения. В предпочтительном аспекте изобретения состав предназначен для парентерального введения, в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, достаточно солей или моносахаридов, чтобы сделать раствор изотоническим с кровью. Составы для парентерального введения включают в себя пригодные для инъекции растворы или суспензии и жидкости для инфузии. Для получения парентеральных форм эффективное количество активного ингредиента можно растворять или суспендировать в стерильном носителе, необязательно, добавляя наполнители, такие как солюбилизаторы, средства для изотоничности, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы или диспергирующие средства, и затем можно распространять его в герметически закрытых флаконах или ампулах.

Фармацевтические составы можно получать для введения ежесуточно, еженедельно или ежемесячно для получения желаемой дозы. Составы можно получать для введения через каждые 2, 4, 6, 8, 10 или 12 часов.

Описанные способы введения и режимы дозирования предназначены только в качестве руководства, поскольку опытный практикующий специалист в данной области способен определять фактическую дозу, которая может являться наиболее подходящей для индивидуального субъекта, на основании возраста, массы и ответа конкретного индивидуума.

Лечение

Конъюгаты, композиции и составы по настоящему изобретению можно использовать для терапевтического лечения мезотелиомы. Как применяют в настоящем документе, слово лечение включает в себя излечивающее, паллиативное и профилактическое лечение.

Пример 1

Получение NGR-hTNF

Человеческий рекомбинантный NGR-TNF, состоящий из человеческого растворимого TNFб1-157, связанного с C-концом нацеливающего пептида CNGRCG, получали способом рекомбинантной ДНК и очищали, как описано в WO01/61017, содержание которой приведено в настоящем документе в качестве ссылки.

Составление NGR-TNF

Очищенный человеческий рекомбинантный NGR-TNF составляли для получения лекарственного средства для введения пациентам. Фармацевтический состав состоит из рекомбинантного человеческого NGR-TNF в концентрации в диапазоне 0,01-10 мг/мл, растворенного в фосфатно-солевом буфере в 3 мл стеклянных флаконах типа I по 1 мл/флакон.

Предпочтительный состав концентрата для раствора для инфузии показан в Таблице 1.

Таблица 1состав NGR-hTNF
Ингредиент	Концентрация	Функция
NGR-hTNF	приблизительно 0,15 мг/мл	Активный ингредиент
PBS	Na2HPO4	50 мМ	Разбавитель
NaCl	150 мМ
вода для иньекций	//

Лекарственное средство хранят при -80°C.

Перед инфузией пациентам NGR-hTNF в фосфатно-солевом буфере (PBS) разводят до подходящей концентрации с помощью 0,9% NaCl, содержащего 1 мг/мл человеческого сывороточного альбумина (HSA). Присутствие HSA необходимо, чтобы избежать потерь NGR-hTNF при присутствии в очень низких концентрациях, из-за абсорбции на флаконах и трубках.

Пример II

NGR-hTNF для лечения мезотелиомы

Выбор пациентов

Давших информированное согласие пациентов (pts) включали в исследование