Антитела против pdgfrα для лечения вторичной опухоли кости

Антитела против pdgfrα для лечения вторичной опухоли кости

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США № 60/691920.

Область изобретения

Данное изобретение относится к способам лечения рака костей, в частности метастатического рака костей, путем введения антагониста IGF-IR и/или PDGFRα. Изобретение также относится к антителам, которые связываются с PDGFRα человека и нейтрализуют активацию рецептора. Дополнительно изобретение относится к способам нейтрализации активации PDGFRα и к способам лечения млекопитающего с неопластическими заболеваниями с использованием антител по отдельности или в сочетании с другими агентами.

Предпосылки создания изобретения

Рак предстательной железы представляет собой наиболее распространенный вид рака среди мужчин, при этом ежегодно в Соединенных Штатах Америки появляется около 220000 новых случаев заболевания и 29000 смертей. Существенная часть мужчин, у которых диагностирован рак предстательной железы, имеет метастатическое заболевание. В дальнейшем метастазы, в конечном счете, развиваются у множества других пациентов с раком предстательной железы, несмотря на хирургическое лечение и лучевую терапию. Кости являются наиболее обычным местом появления метастазов при раке предстательной железы, а также часто местом метастазов при раке молочной железы и раке легких. Большинство метастазов при раке предстательной железы является андроген-зависимыми, так что имеется быстрая ответная реакция на хирургическую или медицинскую кастрацию, но фактически у всех пациентов опухоль в конечном счете становится андроген-независимой, приводя к значительной заболеваемости и смертности. При появлении метастазов в костях доступная в настоящее время терапия имеет ограниченное действие. Наиболее эффективная одобренная терапия, описанная для метастатического рака предстательной железы (введение доцетаксела) увеличивает среднее время жизни приблизительно на три месяца (Petrylak e al., 2004, N.Engl. J.Med. 351:1513; Tannock et al., 2004, N.Engl. J.Med. 351: 1502). Соответственно срочно требуется новая терапия для метастатического рака костей.

Рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-IR) представляет собой повсеместный трансмембранный рецептор тирозинкиназы, который является неотъемлемым для нормального эмбрионального и постнатального роста и развития. IGF-IR располагается на поверхности клетки большинства клеточных типов и служит в качестве сигнальной молекулы для факторов роста IGF-I и IGF-II (обобщенно называемые далее IGFs). IGF-IR может стимулировать пролиферацию клеток, дифференциацию клеток, изменения размера клеток и защищать клетки от апоптоза. Также рассматривалось, что он является квази-обязательным для трансформации клетки (обзор Adamd et al., Cell. Moll.Life. Sci. 57:1050-93 (2000); Baserga Oncogene 19: 5574-81 (2000)). Сообщалось о высоких уровнях экспрессии IGF-IR в образцах тканей в костных метастазах при раке предстательной железы. Кости содержат наиболее большой запас IGFs в организме.

IGF-IR представляет собой предварительно сформированный гетеротетрамер, содержащий две альфа и две бета цепи, связанные дисульфидными связями. Субъединицы рецептора синтезируются как часть единой полипептидной цепи в 180 кДа, которая затем протеолитически перерабатывается в альфа (130 кДа) и бета (95 кДа) субъединицы. Полная альфа-цепь является внеклеточной и содержит сайт для лигандного связывания. Бета-цепь содержит тренсмембранный домен, домен тирозинкиназы и С-концевое удлинение, которое необходимо для дифференциации и трансформации клеток, но несущественно для митогенной передачи сигнала и защиты от апоптоза.

IGF-IR чрезвычайно схож с рецептором инсулина (IR), в частности в рамках последовательности бета-цепи (70% гомологичность). Вследствие такой гомологии недавние исследования продемонстрировали, что данные рецепторы могут образовывать гибриды, содержащие один димер IR и один димер IGF-IR (Pandini et al., Clin.Canc.Res. 5:1935-19 (1999)). Образование гибридов происходит как в нормальных, так и в трансформированных клетках, и содержание гибрида зависит от концентрации двух гомодимерных рецепторов (IR и IGF-IR) внутри клетки. Хотя гибридные рецепторы состоят из пар IR и IGF-IR, гибриды связываются селективно с IGF с аффинностью, подобной аффиности для IGF-IR, и лишь слабо связывают инсулин (Siddle and Sons, The IGF System. Humana Press, pp. 199-225, 1999). Следовательно, данные гибриды могут связывать IGF и преобразовывать сигналы, как в нормальных, так и в трансформированных клетках.

Второй рецептор IGF, IGF-IIR, или манноза-6-фосфатный (М6Р) рецептор, также связывает лиганд IGF-II с высокой аффинностью, но не имеет тирозинкиназной активности. Поскольку он приводит к деградации IGF-II, то рассматривается как агент, ослабляющий IGF-II, антагонизируя действие данного лиганда, промотирующее рост. Потеря IGF-II в опухолевых клетках может усиливать потенциал роста за счет высвобождения его антагонизирующего действия на связывание IGF-II с IGF-IR (Byrd et al., J.Biol.Chem. 274:24408-16 (1999)).

Альфа и бета рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGFRα и PDGFRβ) представляют собой рецепторы тирозинкиназ типа III. PDGFRα является решающим для развития и осуществления важных функций в период полового созревания. Например, мыши, гомозиготные в отношении нулевой мутации, умирают в процессе эмбриогенеза. На более поздних стадиях развития PDGFRα экспрессируется во многих мезинхимальных структурах, где смежные эпителиальные клетки продуцируют тромбоцитарные факторы роста (PDGFRs). Образцы тканей нормальной и гиперплазированной предстательной железы дают отрицательный тест в отношении PDGFRα, тогда как первичные опухоли предстательной железы и скелетная масса от подходящих субъектов экспрессируют PDGFRα. Кроме того, для линий клеток предстательной железы, полученных из разных мест метастазов, PDGFRα обнаруживается в полученных из костных метастазов клетках РС3, но не в клеточных линиях, полученных из метастазов в лимфатические узлы (LNCaP) и мозг (DU-145).

Семейство тромбоцитарных факторов роста состоит из пяти различных дисульфидно-связанных димеров PDGF-AA, -BB, -AB, -CC и -DD, которые действуют посредством PDGFRα и PDGFRβ. Данные факторы роста представляют собой димерные молекулы, состоящие из дисульфидно-связанных полипептидных цепей, которые связываются с двумя рецепторными белками одновременно и индуцируют димеризацию рецептора, автофосфорилирование и внутриклеточную передачу сигнала. PDGFRα и PDGFRβ являются структурно подобными и могут образовывать гетеродимеры, а также гомодимеры. Поскольку PDGFRβ не связывает с высокой аффинностью цепь PDGF-A, PDGF-AA активирует только αα димеры рецепторов, тогда как PDGF-AB и PDGF-СС активирует гетеродимеры рецепторов αα и αβ.

Краткое изложение сущности изобретения.

Данное изобретение относится к лечению первичных и метастатических костных опухолей, включая опухоли, происходящие от предстательной железы, молочной железы или легких, и экспрессирующих рецептор инсулиноподобного фактора роста-I (IGF-IR) и/или альфа-рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFRα).

Опухоли, предназначенные для лечения, могут представлять собой гормон/андроген зависимые или гормон/андроген независимые, которые могут иметь происхождение, например, из предстательной железы, молочной железы или легкого.

Изобретение относится к способам лечения субъекта, имеющего костную опухоль, и к способам ингибирования роста костной опухоли. Способы включают введение эффективного количества антагониста IGF-IR или эффективного количества антагониста PDGFRα. Антагонисты рецепторов включают антитела и фрагменты антител, а также внутриклеточные ингибиторы, представляющие собой небольшие молекулы.

Изобретение относится к антителам против IGF-IR или против PDGFRα, которые связываются с рецептором-мишенью и ингибируют связывание лиганда. Изобретение также относится к антителам и другим антагонистам, которые нейтрализуют активацию IGF-IR или PDGFRα. Кроме того, некоторые антитела промотируют понижающее регулирование их рецепторов-мишеней, например, путем интернализации и/или деградации. Соответственно антитела и антагонисты, представляющие собой небольшие молекулы, функционируют для ингибирования активации сигнальных молекул в прямом направлении, таких как Akt, p42/p44 и MAPK.

Способы включают применение антагонистов IGF-IR или PDGFRα по отдельности, в сочетании друг с другом или в сочетании с другими лекарственными средствами против рака, такими как химиотерапия и лучевая терапия.

Изобретение также относится к антителам и фрагментам антител, которые связываются с PDGFRα, а также нуклеотидам и клетке-хозяину для продуцирования данных антител. Антитела блокируют связывание лиганда и нейтрализуют активацию рецептора. Изобретение также относится к применению антител по отдельности, в сочетании с другими антагонистами рецептора или противоопухолевыми агентами или в виде конъюгатов для лечения новообразования. Антитела против PDGFRα используют для лечения, например, опухолей яичников, опухолей молочной железы, опухолей легких, гепатоклеточных опухолей, опухолей стромальных клеток желудочно-кишечного тракта, меланом, почечно-клеточных карцином, опухолей предстательной железы и саркомы мягких тканей.

Описание фигур

На фиг.1 показан рост подкожных ксенотрансплантатов опухолей LuCaP 35V у кастрированных мышей SCID во время периода лечения, начатого, когда опухоли достигали 150-200 мм³. Полоса А: необработанный контроль; полоса В: животные получали в течение четырех недель только доцетаксел (или 10 мг/кг, или 20 мг/кг) сам по себе или в сочетании с антителами против IGF-IR (40 мг/кг IMC-A12); полоса С: уровни PSA в сыворотке крови у не получавших и получавших лечение мышей SCID, имеющих подкожные ксенотрансплантированные опухоли LuCaP 35V. Мыши, получавшие лечение, получали только доцетаксел (20 мг/кг) или доцетаксел (или 10 мг/кг, или 20 мг/кг) в сочетании с антителами против IGF-IR (40 мг/кг IMC-A12). Лечение начинали, когда опухоли достигали 150-200 мм³, и прекращали через четыре недели.

На фиг. 3 показаны суспензии отдельных клеток ксенотрансплантатов опухолей LuCaP 35V, обработанных только доцетакселом (10 мг/кг) (полоса А) или в сочетании с антителами против IGF-IR (40 мг/кг IMC-A12) (полоса В). Поле, помеченное R1, соответствует апоптическим клеткам с фрагментированной ДНК (повышенное введение метки FITC).

На фиг.3 показан синтез ДНК (поглощение BrDu) в ксенотрансплантатах опухолей после окончания лечения доцетакселом (10 мг/кг, или 20 мг/кг) по отдельности или в сочетании с антителами против IGF-IR (40 мг/кг IMC-A12).

На фиг.4 показана дифференциальная экспрессия генов, связанных с агрессивностью опухоли предстательной железы (TUBB), устойчивостью к антиандрогенной терапии (BIRC 5) и индукцией апоптоза (IGFBP3) в опухолевых клетках предстательной железы в качестве ответной реакции на лечение доцетакселом и А12 и только доцетакселом.

На фиг.5. показаны уровни А12 в сыворотке крови после прекращения лечения.

На фиг.6 показана масса тела (мера общей цитотоксичности) не болевших животных, которые получали постоянно доцетаксел (или 10 мг/кг, или 20 мг/кг) по отдельности или в сочетании с антителами против IGF-IR (40 мг/кг IMC-A12).

На фиг.7 показан эффект лечения с использованием антитела против IGF-IR (IMC-A12) на ксенотрансплантат-продуцированном PSA у мышей SCID, которым были привиты клетки LuCaP 23.1.

На фиг.8 показана серия рентгеновских снимков мышей SCID, которым были привиты клетки LuCaP 23.1. Мыши А-12 получали 40 мг/кг IMC-A12 внутрибрюшинно три раза в неделю в течение шести недель. Рентгеновские снимки были сделаны в момент смерти.

На фиг.9 показаны уровни PSA (а) и иллюстративные рентгеновские снимки (b) мышей SCID с ксенотрансплантатами клеток LuCaP 23.1 предстательной железы человека внутри большой берцовой кости.

На фиг.10 показано действие жидкости, выделенной из костного мозга человека, на активность Akt в клетках рака предстательной железы. Лизаты клеток подвергали SDS-PAGE. Для вестерн-блот анализа мембраны блотировали антителами, нацеленными на фосфо-Akt (Ser-473, cell signaling Technology), PDGFRα (R&D Systems) и актином (Sigma). Первичное связывание антитела обнаруживали с использованием HRP-конъюгированного белка А или белка G (Sigma).

На фиг.11 показана индукция и ингибирование АКТ-фосфорилирования в клетках PC3-ML. Полоса А показывает ингибирование посредством AG-1296 доза-зависимым образом фосфорилирования Akt в клетках, подвергнутых действию PDFG-BB. Полоса В показывает фосфорилирование Akt с помощью костного аспирата и ингибирование с использованием 20 мкМ AG-1296. Полоса С показывает эффективность аспирата костного мозга в отношении индуцирования фосфорилирования Akt по сравнению с эффективностью комбинации 100 пг/мл PDGF-AA и 100 пг/мл PDGF-ВВ. На полосе D проведено сравнение по величине фосфорилирования Akt аспиратом костного мозга, ингибирование индуцированного костным мозгом фосфорилирования Akt с помощью AG-1296 и фосфорилирования Akt, индуцированного посредством PDGF-AA+ PDGF-ВВ.

На фиг.12 показано ингибирование фосфорилирования Akt в клетках PC3-ML посредством антагонистов PDGFRα. Полоса А показывает доза-зависимое действие моноклонального антитела IMC-3G3 на фосфорилирование Akt, индуцированное 30 нг/мл PDGF-ВВ. Полосы В и С дают возможность сравнения действия IMC-3G3 и AG-1296 на индуцированное костным мозгом фосфорилирование Akt. Полоса D показывает, что ингибирование фосфорилирования Akt зависит от времени предварительной инкубации IMC-3G3.

На фиг.13 показано связывание антитела с PDGFRα. А: непосредственное связывание антитела против PDGFRα с иммобилизованным внеклеточным доменом PDGFRα. В: Ингибирование связывания [¹²⁵I]PDGF-AA с иммобилизованным PDGFRα.

На фиг.14 показано специфическое ингибирование фосфорилирования PDGFRα и эффекторных молекул в прямом направлении.

На фиг.15 показано ингибирование посредством mAbs стимулированного PDGF-AA внедрения [³Н]тимидина в клетки РАЕ Rα.

На фиг.16 показано ингибирование индуцированной PDGF-AA активации эффекторных молекул в прямом направлении в клетках SKLMS-1 (A) и U118(B).

На фиг.17 показано ингибирование посредством mAbs стимулированного PDGF-AA внедрения [³Н]тимидина в клетки U118 (А) и SKLMS-1 (В). Ингибирование стимулированного PDGF-ВВ внедрения [³Н]тимидина также показано для клеток SKLMS-1 (С) и U118 (D).

На фиг.18 показано доза-зависимое действие при обработке развитых ксенотрансплантатов опухолей U118 (глиобластома, полоса А) и SKLMS-1 (лейомиосаркома, полоса В) у бестимусных мышей.

На фиг.19 показано уменьшение фосфорилирования PDGFRα in vivo в опухолях U118, обработанных антителом против PDGFRα по сравнению с обработкой неспецифическим IgG человека.

На фиг.20 показаны векторы экспрессии GS, использованные для клонирования полученных из гибридомы генов вариабельных областей VH и VK человека и экспрессии полных тяжелых (IgG1) и легких цепей белков. Два вектора были рекомбинированы, как объяснено в примерах, и объединенный вектор был трансфектирован в клетки NS20.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к лечению костных опухолей с использованием антител или фрагментов антител, которые связываются с рецептором инсулиноподобного фактора роста (IGF-IR). Эндокринная экспрессия IGF-I в первую очередь регулируется гормоном роста, и он продуцируется в печени, но другие типы тканей также способны экспрессировать IGF-I, включая кости, которые содержат большой запас факторов роста. В зависимости от типа опухолевых клеток, IGF-I вовлекается в эндокринное, паракринное и/или аутокринное регулирование (Yu, H.and Rohan, J., J.natl. Cancer Inst., 92: 1472-89 (2000)).

Установлено, что антитела, которые связывают IGF-IR, полезны при терапии для лечения костных опухолей, которые экспрессируют IGF-IR. Антитела можно использовать сами по себе или в сочетании с другими видами лечения рака, в частности, с химиотерапией. Анти-IGF-IR терапия, сама по себе, или в сочетании с терапией с использованием одного или более противораковых агентов (таких, например, как химиотерапия или лучевая терапия) имеет значительную терапевтическую эффективность. Подавление роста опухоли часто сопровождается увеличением апоптоза и сохраняется после прерывания всего лечения, а опухоли у животных, которых лечили только с использованием химиотерапии, опять начинают расти.

Также было установлено, что PDGFRα играет важную роль в росте костных опухолей. Например, некоторые опухолевые клеточные линии, которые экспрессируют PDGFRα, предпочтительно метастазируют в кость. Такие клеточные линии проявляют повышенную активацию PDGFRα и фосфорилирование сигнальных молекул в прямом направлении в ответ на растворимые факторы, присутствующие в костном мозге. Активация PDGFRα костного мозга уменьшается или полностью ингибируется антагонистами PDGFRα и фосфорилирование сигнальных молекул в прямом направлении, которые обычно активируются посредством передачи сигнала через PDGFRα и другие рецепторные системы тирозинкиназы, снижается в значительной степени. Некоторые данные позволяют предположить, что путь выживаемости PI3K/Akt активируется путем передачи сигнала с помощью PDGFRα не только за счет лигандов, которые непосредственно активируют PDGFRα, но также и факторов, присутствующих в костном мозге, которые вызывают трансактивацию рецептора.

Первичные костные опухоли, предназначенные для лечения согласно изобретению, включают, но не ограничиваются указанным, остеосаркомы, хондросаркомы, фибросаркомы и гемангиосаркомы. Примечательно, что злокачественные вторичные (метастатические) опухоли являются намного более обычными, чем первичные костные опухоли. Метастатические костные опухоли, предназначенные для лечения согласно изобретению, могут возникать из множества источников, наиболее обычными из которых являются раковые заболевания предстательной железы, молочной железы или легких. Источник метастатического рака костей обычно будет очевиден из истории болезни пациента. Опухоли могут быть остеобластными или остеолитическими. Опухоли в момент появления могут быть зависимыми от стимуляции IGF-IR, или они могут переходить в IGF-IR-зависимые. Например, раковые заболевания предстательной железы или метастазы раковых заболеваний предстательной железы, которые первоначально являются гормон/андроген-зависимыми, и с которыми можно бороться физическими или химическими методами лечения, которые подавляют продуцирование андрогена или гормона, могут стать гормон/анроген независимыми благодаря повышенной чувствительности к стимуляции посредством IGF-IR. Более того, в дополнение к разработке лечения для гормон/андроген-независимых опухолей, данное изобретение можно использовать для лечения гормон/андроген-зависимых костных опухолей без уверенности на подавление продуцирование андрогена или гормона, например, путем совместного применения антител против IGF-IR вместе с противоопухолевыми агентами. Такие опухоли могли бы включать метастатические костные опухоли, которые стимулируются IGF-IR в IGF-обогащенной окружающей среде кости, которые могут быть чувствительными к гормональной стимуляции, но не достаточно чувствительными для роста без вовлечения IGF. Удаление гормонов может не требоваться для таких опухолей.

Костные опухоли, которые являются PDGF-зависимыми, также можно лечить в соответствии с изобретением, а также опухоли, которые являются зависимыми от «костного мозга». Зависимые от костного мозга опухоли проявляют активацию PDGFRα в качестве ответной реакции на растворимые факторы, присутствующие в костном мозге. Например, как проиллюстрировано в данном изобретении, метастатическая экспрессирующая PDGFRα раковая клеточная линия человека претерпевает активацию PDGFRα и фосфорилирование Akt+ при воздействии аспирата костного мозга. Антитело против PDGFRα, а также небольшие молекулы, являющиеся антагонистами PDGFRα, ингибируют активацию PDGFRα и фосфорилирование Akt+ для данной клеточной линии. Растворимые факторы костного мозга, которые активируют PDGFRα, включают, но не ограничиваются указанным, PDGF-АА и -ВВ.

Хотя такая зависимость от костного мозга включает передачу сигнала через PDGFRα, она может не включать только связывание PDGFRα лигандом PDGFRα. Например, как проиллюстрировано в данном описании, отмечено, что активация PDGFRα определенными лигандами (PDGF-АА или -ВВ) слабее, чем активация аспиратом костного мозга. Более того, наблюдается, что в присутствии аспирата костного мозга фосфорилирование Akt+ уменьшается при увеличении времени инкубации. Совместно данные результаты позволяют предположить, что помимо ответной реакции на связывание PDGF, PDGFRα может трансактивироваться (фосфорилироваться) другими элементами сигнальной трансдукции (например, другими тирозинкиназами рецепторов), чувствительными к другим компонентам костного мозга. В любом случае, в клеточной линии подходящей для метастатического роста в кости (т.е. клеточная линия, которая предпочтительно метастазирует в кости) наблюдается зависимая от костного мозга активация PDGFRα, которая ингибируется антагонистами PDGFRα. Помимо этого, лечение с использованием антагониста PDGFRα ингибирует индуцированную костным мозгом стимуляцию противоапоптического пути PI3K/Akt и митоген-активированную протеинкиназу (МАРК).

Костные опухоли, предназначенные для лечения с использованием антагониста PDGFRα, могут возникать в качестве метастазов раковых клеток предстательной железы и, как и выше, могут быть гормонально/андроген зависимыми или перейти в гормонально/андроген независимые. Такие опухоли могут также возникать в качестве метастазов на рак, отличный от рака предстательной железы. Специалист в данной области будет способен легко диагностировать такие состояния и нарушения с использованием известных обычных исследований.

Термин «лечение» означает любое лечение заболевания у животного и включает (1) профилактику возникновения заболевания у млекопитающего, которое может быть предрасположенным к заболеванию, но у которого еще не наблюдается заболевания или не проявляются симптомы заболевания; например, предотвращение начала клинических симптомов; (2) ингибирование заболевания, например, остановку его развития; или (3) оказание помощи при заболевании, например, вызов регрессии симптомов заболевания. Ингибирование роста опухоли включает замедление или остановку роста, а также регрессию опухоли. Выражение «эффективное количество для лечения заболевания» означает то количество, которое при введении нуждающемуся в этом млекопитающему является достаточным для лечения данного заболевания, как определено выше. Антагонист IGF-IR и антагонист PDGFRα по данному изобретению можно вводить по отдельности, в сочетании друг с другом или в сочетании с одним или несколькими противоопухолевыми агентами, такими как, например, химиотерапевтический агент или радиологический агент.

В одном из вариантов осуществления изобретения может оказаться желательным определение уровня экспрессии IGF-IR и/или PDGFRα в опухоли, предназначенной для лечения. В таких случаях берут биопсийную пробу опухоли и анализируют ее методами, хорошо известными в данной области. В другом варианте осуществления изобретения, антагонист IGF-IR или антагонист PDGFRα применяют на основании того, что соответствующий рецептор обычно экспрессируется или активируется в определенном типе опухоли или без исключений начинает экспрессироваться или активироваться по мере прогрессирования заболевания.

Антагонист IGF-IR может представлять собой внеклеточный антагонист или внутриклеточный антагонист и можно использовать более одного антагониста. Внеклеточные антагонисты включают, но не ограничиваются указанным, белки или другие биологические молекулы, которые связываются с IGF-IR или одним или несколькими его лигандами (например, IGF-I и IGF-II являются природными лигандами IGF-IR). В варианте осуществления изобретения внеклеточный антагонист ингибирует связывание IGF-IR с его лигандами. В одном варианте осуществления антагонист представляет собой антитело против IGF-IR, такое как, например, IMC-A12. В другом варианте осуществления антагонист представляет собой растворимый лиганд-связывающий фрагмент IGF-IR. Внутриклеточные антагонисты IGF-IR могут представлять собой биологические молекулы, но обычно представляют собой небольшие молекулы. Примеры включают, но не ограничиваются указанным, ингибитор тирозинкиназы AG1024 (Calbiochem), ингибитор киназы рецептора инсулиноподобного фактора роста-I NVP-AEW541 (Novartis), ингибитор рецептора инсулиноподобного фактора роста-I/инсулина BMS-554417 (Bristol Myers Squibb). Следует понимать, что используемые небольшие молекулы для применения в данном изобретении представляют собой ингибиторы IGF-IR, но они не должны быть полностью специфичными в отношении IGF-IR.

Антитела против IGF-IR для использования в соответствии с настоящим изобретением проявляют одно или несколько из следующих свойств:

1) Антитела связываются с внешним доменом IGF-IR и ингибируют связывание IGF-I или IGF-II с IGF-IR. Ингибирование может быть определено, например, путем анализа непосредственного связывания с использованием очищенных или мембранно-связанных рецепторов. В данном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению или их фрагменты предпочтительно связывают IGF-IR по меньшей мере также сильно, что и природные лиганды IGF-IR (IGF-I и IGF-II).

2) Антитела нейтрализуют IGF-IR. Связывание лиганда, например, IGF-I и IGF-II, с внешним, внеклеточным доменом IGF-IR стимулирует автофосфорилирование бета-субъединицы и сигнальных молекул, включая МАРК, Akt и IRS-1, в прямом направлении.

Нейтрализация IGF-IR включает ингибирование, снижение, дезактивацию и/или нарушение одной или нескольких данных видов активности, обычно связанных с сигнальной трансдукцией. Нейтрализация может быть определена in vivo, ex vivo или in vitro с использованием, например, тканей, культивированных клеток или очищенных клеточных компонентов. Нейтрализация включает ингибирование гетеродимеров IGF-IR/IR, а также гомодимеров IGF-IR. Таким образом, нейтрализация IGF-IR имеет множество действий, включая ингибирование, снижение, дезактивацию и/или нарушение роста (пролиферации и дифференциации), ангиогенез (восстановление кровеносных сосудов, инвазия и метастазы) и подвижность клеток и метастазы (адгезия и инвазивность клеток).

Одной мерой нейтрализации IGF-IR является ингибирование тирозинкиназной активности рецептора. Ингибирование тирозинкиназы может быть определено с использованием хорошо известных способов, например, путем измерения уровня автофосфорилирования рекомбинантного рецептора киназы и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Таким образом, анализы фосфорилирования могут использоваться для определения нейтрализующих антител в контексте настоящего изобретения. Фосфорилирование может быть обнаружено, например, с использованием антитела, специфического в отношении фосфотирозина в анализе ELISA или вестерн-блоте. Некоторые анализы активности тирозинкиназы описаны в Panek et al., J.Pharmacol. Exp.Thera. 283:1433-44 (1997) и Batley et al., Life Sci., 62:143-50 (1998). Антитела по изобретению вызывают уменьшение фосфорилирования тирозина IGF-IR по крайней мере примерно на 75%, предпочтительно по крайней мере примерно на 85% и более предпочтительно по крайней мере примерно на 90% в клетках, которые дают ответную реакцию на лиганд.

Другой мерой нейтрализации IGF-IR является ингибирование фосфорилирования субстратов IGF-IR в прямом направлении. Соответственно может быть измерен уровень фосфорилирования МАРК, Akt или IRS-1. Фосфорилирование снижается по крайней мере примерно на 40% и может снижаться по крайней мере примерно на 60% или по крайней мере примерно на 80%.

Кроме того, способы обнаружения экспрессии белка можно использовать для определения нейтрализации IGF-IR, при которых измеряемые белки регулируются путем тирозинкиназной активности IGF-IR. Данные способы включают иммуногистохимический (IHC) для обнаружения экспрессии белка, флуоресцентный in situ гибридизации (FISH) для обнаружения амплификации гена, анализы конкурентного связывания радиоактивных лигандов, методы блоттинга на твердых матрицах, такие как нозерн- и саузерн-блоты, полимеразно-цепная реакция обратной транскриптазы (PCR) и ELISA. См., например, Grandis et al., Cancer, 78:1284-92 (1996); Shimizu et al., Japan J. Cancer Res., 85:567-71 (1994); Sauter et al., Am. J. Path., 148:1047-53 (1996); Collins, Glia 15:289-96 (1995); Radinsky et al., Clin. Cancer Res. 1:19-31 (1995); Petrides et al., Cancer Res. 50:3934-39 (1990); Hoffinann et al., Anticancer Res. 17:4419-26 (1997); Wikstrand et al., Cancer Res. 55:3140-48 (1995).

Анализы ex vivo также можно использовать для определения нейтрализации IGF-IR. Например, ингибирование тирозинкиназы рецептора можно наблюдать путем митогенных анализов с использованием клеточных линий, стимулированных с помощью лиганда рецептора в присутствии и в отсутствие ингибитора. Линия MCF7 рака молочной железы (Американская коллекция типовых культур (АТСС), Rockville, MD) представляет собой такую клеточную линию, которая экспрессирует IGF-IR и стимулируется посредством IGF-I или IGF-II. Другой способ включает тестирование в отношении ингибирования роста экспрессирующих IGF-IR опухолевых клеток или клеток, трансфектированных для того, чтобы экспрессировать IGF-IR. Ингибирование также можно наблюдать с использованием опухолевых моделей, например, клеток опухолей человека, введенных мыши.

Антитела по настоящему изобретению не ограничены каким-либо конкретным механизмом нейтрализации IGF-IR. Антитела против IGF-IR по настоящему изобретению могут связываться с внешней стороны с поверхностным клеточным рецептором IGF-IR, блокировать связывание лиганда (например, IGF-I или IGF-II) и последующую сигнальную трансдукцию, опосредованную через связанную с рецептором тирозинкиназу, и предотвращать фосфорилирование IGF-IR или других белков в прямом направлении в каскаде сигнальной трансдукции.

3) Антитела оказывают отрицательную негативную модуляцию IGF-IR. Количество IGF-IR, присутствующее на поверхности клетки, зависит от продуцирования, интернализации и разложения рецепторного белка. Количество IGF-IR, присутствующее на поверхности клетки, может быть измерено косвенно путем обнаружения интернализации рецептора или молекулы, связанной с рецептором. Например, интернализация рецептора может быть измерена путем контактирования клеток, которые экспрессируют IGF-IR, с меченым антителом. Мембранно-связанное антитело затем отделяют, собирают и считывают радиоактивность. Интернализованное антитело определяют посредством лизирования клеток и обнаружения метки в лизатах.

Другой способ заключается в прямом измерении количества рецептора, присутствующего на клетках после обработки с помощью антитела против IGF-IR или другого вещества, например, с помощью анализа клеток, окрашенных в отношении поверхностной экспрессии IGF-IR, с использованием клеточного сортинга с возбуждением флуоресценции. Окрашенные клетки инкубируют при 37°С и измеряют интенсивность флуоресценции во времени. В качестве контроля часть окрашенных клеток можно инкубировать при 4°С (условия, при которых прекращается интернализация рецептора).

IGF-IR на клеточной поверхности может быть обнаружен и измерен с использованием другого антитела, которое является специфическим по отношению к IGF-IR и которое не блокирует или не конкурирует в связывании с тестируемым антителом (Burtrum et al. Cancer Res. 63: 8912-21 (2003)). Обработка клетки, экспрессирующей IGF-IR, антителом по изобретению приводит к снижению IGF-IR на клеточной поверхности. В предпочтительном варианте осуществления снижение в качестве ответной реакции на обработку антителом по изобретению составляет по крайней мере примерно 70%, более предпочтительно по крайней мере примерно 80% и еще более предпочтительно по крайней мере примерно 90%. Значительное снижение может наблюдаться по меньшей мере в течение четырех часов.

Другой мерой снижения модулирования является уменьшение общего рецепторного белка, присутствующего в клетке, и она отражает разрушение внутренних рецепторов. Соответственно обработка клеток (в особенности раковых клеток) антителами по изобретению приводит к снижению общего клеточного IGF-IR. В предпочтительном варианте осуществления снижение составляет, по крайней мере, примерно 70%, более предпочтительно, по крайней мере, примерно 80% и еще более предпочтительно, по крайней мере, примерно 90%.

Для лечения людей антитела согласно данному изобретению предпочтительно являются антителами человека. Альтернативно, антитела могут быть антителами приматов, не являющихся людьми, или других млекопитающих, или представлять собой гуманизованные или химерные антитела. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело против IGF-IR включает один, два, три, четыре, пять и/или шесть гипервариабельных участка (CDR), выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47 и SEQ ID NO:49 (CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDRL3 соответственно). В другом варианте осуществления, антитело против IGF-IR включает один, два, три, четыре, пять и/или шесть гипервариабельных участка (CDR), выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57 и SEQ ID NO:59 (CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDRL3 соответственно). Предпочтительно антитела (или их фрагменты) по настоящему изобретению имеют тяжелые цепи CDR, включающие SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37 и SEQ ID NO:39. Альтернативно, и также предпочтительно, настоящие антитела, включая их фрагменты, имеют легкие цепи CDR, включающие SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47 и SEQ ID NO:49 или SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57 и SEQ ID NO:59. Одно такое антитело против IGF-IR представляет собой антитело IMC-A12 (WO2005016970) IgG1 человека, имеющее вариабельный домен тяжелой цепи, представленный SEQ ID NO:41 и вариабельный домен легкой цепи, представленный SEQ ID NO:51. Другое предпочтительное антитело человека представляет собой IMC-2F8 (WO2005016970), имеющее вариабельный домен тяжелой цепи идентично IMC-A12 и вариабельный домен легкой цепи, представленный SEQ ID NO:61. Полезные антитела дополнительно включают антитела против IGF-IR, которые конкурируют с IMC-A12 или IMC-2F8 за связывание с IGF-IR, а также антитела, которые связываются с другими эпитопами (т.е. антитела, которые связываются с другими эпитопами и проявляют свойства, как описано ранее, такие как блокирование лиганда, интерналиция рецептора и т.д. но не конкурируют с IMC-A12 или IMC-2F8).

В соответствии с изобретением антагонисты PDGFRα также можно использовать для лечения. Антагонист PDGFRα может представлять собой внеклеточный антагонист или внутриклеточный антагонист и можно использовать более одного антагониста. Внеклеточные антагонисты включают, но не ограничиваются указанным, белки или другие биологические молекулы, которые связываются с PDGFRα или одним или несколькими его лигандами (например, PDGF-АА, -АВ, -ВВ, -СС). В одном из вариантов осуществления данного изобретения внеклеточный антагонист ингибирует связывание PDGFRα с его лигандами. В одном варианте осуществления антагонист представляет собой антитело против PDGFRα, такое как, например, IMC-3G3. В другом варианте осуществления связывающий белок представляет собой растворимый лиганд, связывающий фрагмент PDGFRα. Внутриклеточные антагонисты PDGFRα могут представлять собой биологические молекулы, но обычно представляют собой небольшие молекулы. В одном варианте осуществления внутриклеточный антагонист PDGFRα представляет собой AG1296. AG1296 (Calbiochem) представляет собой ингибитор PDGFα, PDGFβ и с-KIT и также реагирует с Flt3. Другие небольшие молекулы, мишенью которых являются PDGFR включают STI-571 (иматиниб мезилат, Gleevec®, Novartis) и SU11248 (сунитиниб малат, SUTENT®, Pfizer).

В одном из вариантов осуществления изобретения антитело против PDGFRα включает один, два, три, четыре, пять и/или шесть гипервариабельных участка (CDR), выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14 (CDR1H, CDR2H, CDR3H, CDR1L, CDR2L, CDRL3 соответственно). Предпочтительно антитела (или их фрагменты) по настоящему изобретению имеют участки CDR, включающие SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6. Альтернативно и также предпочтительно, настоящие антитела или их фрагменты имеют участки CDR, включающие SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:14. Последовательности аминокислот в CDR указаны ниже в таблице 1.

Таблица 1Участки CDR в IMC-3G3
Тяжелая цепь
CDR1	SSSYY	SEQ ID NO:2
CDR2	SFFYTGSTYYNPSLRS	SEQ ID NO:4
CDR3	QSTYYYGSGNYYGWFDR	SEQ ID NO:6
Легкая цепь
CDR1	RASQSVSSYLA	SEQ ID NO:10

CDR2	DASNRAT	SEQ ID NO:12
CDR3	QQRSNWPPA	SEQ ID NO:14

В другом варианте осуществления антитело против PDGFRα или его фрагмент имеет вариабельную область тяжелой цепи человека, представленную SEQ ID NO:8, и/или вариабельную область легкой цепи человека, представленную SEQ ID NO:16. IMC-3G3 представляет собой такое антитело, и оно проиллюстрировано в настоящем изобретении.

Предпочтител