Новые аллергены пшеницы

Новые аллергены пшеницы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области IgE-опосредованной аллергии, в частности, к профессиональной астме, такой как астма пекарей. Более конкретно изобретение относится к идентификации нового аллергена пшеницы и его применению при терапии и диагностики. Изобретение также относится к способам диагностики и лечения IgE-опосредованной аллергии у млекопитающих.

Уровень техники

Аллергены пшеницы (Triticum aestivum) могут вызывать три разных типа IgE-опосредованной аллергии, респираторную аллергию в результате вдыхания пшеничной муки, пищевую аллергию в результате употребления в пищу продуктов из пшеницы и аллергию на пыльцу пшеницы, которая относится к группе аллергий на пыльцу растений. Аллергическая сенсибилизация к компонентам пшеничной муки является одной из наиболее частых причин профессиональной астмы, и поражает примерно 1-10% работников пекарен, поэтому заболевание называют астмой пекарей. У таких работников пекарни вырабатываются IgE-антитела против аллергенов пшеничной муки и индуцированная действием муки астма и/или ринит. Подтверждение предположения о том, что астма пекарей является настоящим профессиональным заболеванием, получено в результате обнаружения того, что распространенность сенсибилизации к ассоциированным с производством выпечки аллергенов примерно в десять раз выше у людей, подвергающихся воздействию муки, по сравнению с контрольными популяциями, не контактирующими с мукой. Кроме того, оказалось возможным установить пороговые значения в случае воздействия пшеничной муки, которые, как известно, вызывают бронхиальную астму у сенсибилизированных людей. Первое систематическое исследование аллергии на муку было осуществлено еще в 1933 году Baggoe. Другие более ранние сообщения сфокусированы на описании случаев астмы пекарей после механистических исследований, показывающих важность IgE-опосредованных механизмов в развитии астмы пекарей. Затем было предпринято несколько попыток охарактеризовать вызывающие заболевание аллергены муки иммунохимическими способами, с использованием методики RAST, иммуноблоттинга, а недавно с использованием методики молекулярного клонирования.

Triticum aestivum является важным представителем семейства злаковых трав. До 40% всех пациентов с аллергией несут сывороточные IgE-антитела, взаимодействующие с аллергенами пыльцы растений. В нескольких исследованиях сообщалось о перекрестной реактивности между пшеничной мукой и пыльцой растений вследствие наличия общих эпитопов для IgE в белках пшеничной муки и пыльцы растений. Описана перекрестная реактивность между аллергенами пыльцы растений и аллергенами зерна пшеницы, и существует доказательство того, что пациенты, страдающие астмой пекарей и IgE-опосредованной пищевой аллергией на пшеницу, могут узнавать разные аллергены, которые можно использовать для дифференциальной диагностики астмы пекарей, пищевой аллергии на пшеничную муку и аллергии на пыльцу растений. Однако огромное количество растворимых аллергенов пшеничной муки еще не идентифицировано. В настоящее время идентифицировано и охарактеризовано только небольшое количеств аллергенов пшеничной муки, и к ним относятся представители семейства ингибиторов альфа-амилазы, ацил-CoA-оксидаза, пероксидаза, фруктозодифосфатальдолаза, и в последнее время тиоредоксины.

Диагностика, основанная на использовании экстракта пшеничной муки, не позволяет обнаружить различие между пациентами, страдающими респираторной аллергией или пищевой аллергией на пшеницу. Поэтому точная диагностика все еще основана на специальной ингаляционной провокации в случае респираторной аллергии на пшеничную муку и двойной слепой плацебо-контролируемой пищевой провокации (DBPCFC) в случае предполагаемой пищевой аллергии, и остается открытым вопрос, можно ли идентифицировать аллергены, которые могут быть использованы для селективной диагностики и лечения различных индуцированных пшеницей проявлений аллергии, таких как астма пекарей, пищевая аллергия и поллинозы. Таким образом, существует необходимость в идентификации новых аллергенов пшеницы и разработки способов и диагностических тестов, чтобы более точно выявлять пациентов, страдающих IgE-опосредованной аллергией, такой как респираторная аллергия, например, астма пекарей, чтобы отличать их от пациентов, страдающих пищевой аллергией и/или аллергией на пыльцу. Кроме того, существует необходимость в применении таких новых аллергенов пшеницы для лечения IgE-опосредованной аллергии. Настоящее изобретение обращено к проблеме, связанной с необходимостью получения новых аллергенов пшеницы и их применением для терапии и диагностики. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению известных пептидов и белков в терапии и диагностике. Некоторые из таких пептидов известны: Gennaro S. D. et al., Biological Chemistry, April 2005, 386: 383-389; UNIPROT, номер доступа P82977; UNIPROT, номер доступа Q6W8Q2; US 7214786 и US2006/0107345.

Сущность изобретения

Как указано выше, несколько аллергенов пшеничной муки, которые были идентифицированы и охарактеризованы, включают представителей семейства ингибиторов альфа-амилазы, ацил-CoA-оксидазу, пероксидазу, фруктозодифосфатальдолазу и тиоредоксины. До настоящего времени не были идентифицированы аллергены, которые можно применять для селективной диагностики и лечения различных индуцированных пшеницей проявлений аллергии, таких как астма пекарей, пищевая аллергия и поллиноз. Это привело авторов настоящего изобретения к поиску дополнительных, еще не идентифицированных аллергенов пшеницы.

Настоящее изобретение, по меньшей мере, частично удовлетворяет потребность предшествующего уровня техники, так как предлагает новые аллергены пшеницы и способы диагностики и лечения IgE-опосредованной аллергии у млекопитающих.

В первом аспекте изобретение относится к полипептидам, представляющим собой новые аллергены пшеницы, выделенным из пшеницы или полученным рекомбинантно, и их фрагментам или вариантам, имеющим общие эпитопы для антител. Изолированные полипептиды содержат аминокислотную последовательность клона №10, №112 или №126.

Во втором аспекте изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды согласно изобретению, нуклеиновым кислотам, имеющим нуклеотидную последовательность клона №10, №112 или №126.

В другом аспекте изобретение относится к полипептиду, обладающему идентичностью с клонами №10, №38, №112 или №126, для применения в терапии или диагностике, предпочтительно терапии и диагностике IgE-опосредованной аллергии, такой как респираторная аллергия на пшеничную муку, например, астма пекарей. Кроме того, изобретение относится к изолированному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность клона №37, для применения в терапии или диагностике, предпочтительно терапии и диагностике IgE-опосредованной аллергии, такой как респираторная аллергия на пшеничную муку, например, астма пекарей.

В еще одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей полипептид, обладающий идентичностью с клонами №10, №38, №112, №126 или №37, или к его гипоаллергенной форме, модифицированной с тем, чтобы отменить или ослабить IgE-связывающий ответ, и необязательно фармацевтически приемлемые эксципиенты, носители, буферы и/или разбавители. Гипоаллергенная форма полипептида, обладающего идентичностью с клонами №10, №38, №112, №126 или №37, может быть модифицирована посредством фрагментации, укорочения или образования тандема молекулы, делеции внутренних участков, перестановки доменов, замены аминокислотных остатков, разрушения дисульфидных мостиков.

В следующем аспекте изобретение относится к композиции аллергенов, «обогащенной» полипептидом, обладающим идентичностью с клонами №10, №38, №112, №126 или №37. Такая композиция аллергенов может представлять собой экстракт аллергенов или смесь очищенных или рекомбинантных аллергенных компонентов, которые не содержат или содержат небольшое количество полипептида согласно изобретению, при этом полипептид добавляют для того, чтобы связать IgE у пациентов, у которых IgE может быть не связан или слабо связан с другими аллергенными компонентами в композиции. Данный аспект изобретения также относится к способу получения такой композиции, и такой способ включает стадию добавления полипептида, обладающего идентичностью с клонами №10, №38, №112, №126 или №37, к композиции аллергенов, такой как экстракт аллергенов (необязательно обогащенный другими компонентами) или смесь очищенных нативных или рекомбинантных аллергенных компонентов.

В следующем аспекте изобретение относится к композиции аллергенов, получаемой описанным выше способом.

Изобретение, кроме того, относится к способу диагностики in vitro IgE-опосредованной аллергии, включающему стадии контактирования образца жидкости, такого как образец крови, плазмы или сыворотки, из организма млекопитающего, у которого предполагается наличие IgE-опосредованной аллергии, такой как респираторная аллергия на пшеничную муку, например, астма пекарей, с полипептидом, обладающим идентичностью с клонами №10, №38, №112, №126 или №37, и выявления присутствия в образце IgE-антител, которые специфично связываются с полипептидами по изобретению. Присутствие таких антител, специфично связывающихся с полипептидом, обладающим идентичностью с клонами №10, №38, №112, №126 или №37, является показателем IgE-опосредованной аллергии. Один вариант такого способа включает осуществление способа с использованием анализа на микроматрице.

В следующем аспекте изобретения предлагается диагностический набор для осуществления способа диагностики in vitro IgE-опосредованной аллергии, такой как респираторная аллергия на пшеничную муку, например, астма пекарей, при этом указанный набор содержит полипептид, обладающий идентичностью с клонами №10, №38, №112, №126 или №37, и средства для выявления связывания IgE с указанным полипептидом, такие как твердая подложка, например, нитроцеллюлозная мембрана или микроматрица, содержащая связанный с ней полипептид, обладающий идентичностью с клонами №10, №38, №112, №126 или №37.

В следующем аспекте изобретение относится к способу лечения IgE-опосредованной аллергии у млекопитающего, такой как респираторная аллергия, например, астма пекарей. В одном варианте способ включает введение пациенту, чувствительному к такому лечению, полипептида, обладающего идентичностью с клонами №10, №38, №112, №126 или №37, или его фрагмента или варианта, имеющих общие эпитопы для антител. В другом варианте способ включает введение пациенту, чувствительному к такому лечению, фармацевтической композиции согласно предыдущему аспекту.

Определения

Таблица AОпределения клонов
Клон	Последовательность нуклеиновой кислоты	Аминокислотная последовательность
#10	SEQ ID №1	SEQ ID № 2
#37	SEQ ID №3	SEQ ID №4
#38	SEQ ID №5	SEQ ID №6
#112	SEQ ID №7	SEQ ID №8
#126	SEQ ID №9	SEQ ID №10

Следует считать, что варианты и фрагменты полипептида по изобретению означают белки или пептиды длиной, по меньшей мере, 10 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере 25, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 50 или 75 аминокислотных остатков, и идентичность последовательности с указанным полипептидом, составляющую, по меньшей мере, 50 %, предпочтительно более 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Модифицированный полипептид в контексте настоящего изобретения следует толковать как полипептид, который был химически или генетически модифицирован для того, чтобы изменить его иммунологические свойства, например, как проиллюстрировано в отношении аспекта изобретения, связанного с иммунотерапией.

Варианты и фрагменты полипептида, имеющего общие с указанным полипептидом эпитопы для антител, следует толковать как такие фрагменты и варианты, связывание которых с IgE-антителами из образца сыворотки типичного пациента, сенсибилизированного полипептидом согласно изобретению, может быть в значительной степени ингибировано полипептидом. Такой анализ ингибирования может быть, например, осуществлен согласно протоколу, описанному в примере 4.

Гипоаллергенный модифицированный полипептид или вариант или фрагмент полипептида следует толковать как модифицированный полипептид или вариант или фрагмент полипептида, который не способен связывать IgE-антитела, реактивные к указанному полипептиду, из образца сыворотки типичного сенсибилизированного полипептидом пациента, который определен, например, в протоколе согласно примеру 1 или который не проявляет или проявляет в значительной степени сниженную биологическую аллергенную активность, которую определяют с использованием анализа активации клеток, такого как анализ высвобождения гистамина базофилами.

Краткое описание таблиц и фигур

В таблице I показаны демографические, клинические и серологические характеристики пациентов, страдающих астмой пекарей.

В таблице II показаны демографические, клинические и серологические характеристики пациентов, страдающих пищевой аллергией на пшеницу (F1-F4) и аллергией на пыльцу растений (G1-G4).

В таблице III показаны идентичности аминокислотных последовательностей в процентах между полученным из клона 10 аллергеном и гомологичными белками, где следующие белки пронумерованы 1-30: 1. gi|122065237 (Triticum aestivum), 2. gi|66356278 (Triticum aestivum), 3. gi|124122 (Hordeum vulgare подвид vulgare), 4. gi|48093360 (Zea diploperennis), 5. gi|48093418 (Tripsacum dactyloides), 6. gi|75994161 (Zea mays подвид parviglumis), 7. gi|58396945 (Oryza sativa [группа японских сортов]), 8. gi|115649132 (Strongylocentrotus purpuratus), 9. gi|37904392 (Brachypodium distachyon), 10. gi|26224744 (Citrus x paradise), 11. gi|224447 (Vicia faba), 12. gi|124395862 (Paramecium tetraurelia), 13. gi|50262213 (Cucurbita maxima), 14. gi|547743 (Nicotiana sylvestris), 15. gi|54610713 (Lumbricus terrestris), 16. gi|169491 (Solarium tuberosum), 17. gi|218290 (Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffiij, 18. gi|124121 (Vigna angularis), 19. gi|603890 (Sambucus nigra), 20. gi|14718445 (Ipomoea batatas), 21. gi|114950 (Momordica charantia), 22. gi|109138554 (Fagopyrum esculentum), 23. gi|18404883 (Arabidopsis thaliana), 24. gi|27734408 (Canavalia lineate), 25. gi|37901103 (Hevea brasiliensis), 26. gi|92874842 (Medicago truncatula), 27. gi|13959383 (Linum usitatissimum), 28. gi|22759723 (Zinnia elegans), 29. gi|37359345 (Vitis vinifera) и 30. gi|6453287 (Amaranthus hypochondriacus).

В таблице IV показаны клинические данные для пациентов с астмой пекарей из примера 2.

В таблице V показаны клинические данные для пациентов с пищевой аллергией и аллергией на пыльцу растений из примера 2.

В таблице VI показаны ПЦР-праймеры, используемые для амплификации кДНК клонов №10, №38, №112, №123, №126 и №37.

Таблица VII. Демографические, клинические и серологические характеристики пациентов, страдающих астмой пекарей.

Таблица VIII. Демографические, клинические и серологические характеристики пациентов, страдающих аллергией на пыльцу растений.

Таблица IX. Демографические, клинические и серологические характеристики пациентов, страдающих пищевой аллергией на пшеницу.

Фигура 1 иллюстрирует нуклеотидную и рассчитанную аминокислотную последовательность полученного из клона 10 аллергена (SEQ ID NO: 1). Кодирующая и не кодирующая области показаны заглавными буквами и строчными буквами, соответственно, стартовый кодон (ATG) и стоп-кодон подчеркнуты. Надписи аминокислот семейства ингибиторов I картофеля напечатаны на сером фоне. Номера слева указаны для нуклеотидов, а номера справа указаны для аминокислот. Последовательность представлена в GenBank с номером доступа (EU051824).

Фигура 2 иллюстрирует определение параметров очищенного аллергена, подобного ингибитору сериновой протеиназы. A: Окрашенный Кумасси бриллиантовым синим SDS-ПААГ, содержащий очищенный полученный из клона 10 аллерген. Маркер молекулярной массы (кД) показан слева. B: Масс-спектрометрия (МС) очищенного полученного из клона 10 аллергена. Отношение масса/заряд показано на оси x, а интенсивность показана на оси y в виде процента от наиболее интенсивного сигнала, полученного в исследованном диапазоне масс. C: Анализ кругового дихроизма (КД) в дальней ультрафиолетовой области очищенного полученного из клона 10 аллергена. Спектры представлены в виде средней эллиптичности остатков (θ) (ось y), регистрируемой при 25°C (жирная линия), 95°C (обычная линия) и 25°C после охлаждения (пунктирная линия) при заданных длинах волн (ось x).

Фигура 3 иллюстрирует реактивность IgE у пациентов, страдающих астмой пекарей, аллергией на пыльцу растений и пищевой аллергией. Очищенный полученный из клона 10 аллерген, HSA, rPh1 p 1, rPh1 p 5, rPh1 p 7, rPh1 p 12, экстракт пыльцы пшеницы и экстракт зерна пшеницы в виде пятен наносили на полоски нитроцеллюлозной мембраны и инкубировали с сыворотками 22 пациентов с астмой пекарей (1-22), четырьмя сыворотками пациентов с аллергией на пыльцу растений (G1-G4), четырьмя сыворотками пациентов, страдающих пищевой аллергией на пшеницу (F1-F4), одной сывороткой человека, не страдающего аллергией (NC) и с буфером без добавления сыворотки (B). Связанные IgE-антитела выявляли с использованием ¹²⁵I-меченых антител против IgE человека и визуализировали с помощью авторадиографии.

На фигуре 4 представлена коробчатая диаграмма реактивностей подклассов IgG по отношению к полученному из клона 10 аллергену. Реактивность подклассов IgG_1-4 к полученному из клона 10 аллергену определяли в ELISA для пациентов, страдающих астмой пекарей (n=22) и представляли в виде коробчатых диаграмм, где 50% значений находятся в пределах прямоугольников и не являются выбросами за пределы линий, указывающих величины ошибки. Линии внутри прямоугольников указывают медианные значения, кружками указаны выбросы и звездочками указаны экстремальные значения.

Фигура 5 иллюстрирует аллергенную активность аллергена, полученного из клона 10. Клетки RBL нагружали IgE сыворотки от трех пациентов с астмой пекарей (№2, №4, №12) или сывороткой не страдающего аллергией пациента (NC) и затем провоцировали рекомбинантным полученным из клона 10 аллергеном или аллергеном пыльцы тимофеевки луговой rPh1 p 1. Средние значения высвобождения β-гексозаминидазы показаны по оси y в виде процента от общего высвобождения после вычитания процента спонтанного высвобождения.

На фигуре 6 показана экспрессия аллергена, подобного ингибитору сериновых протеиназ, в семенах во время созревания семян. Нитроцеллюлозные блоты экстракта пшеницы из незрелых (7, 10, 15, 20, 25, 30, 35 день) и зрелых (M) семян пшеницы анализировали, используя кроличьи антитела, специфичные для полученного из клона 10 аллергена, и в целях контроля используя соответствующую сыворотку до иммунизации. Молекулярные массы указаны слева в килодальтонах (кД).

На фигуре 7 показана идентификация полученного из клона 10 аллергена в пыльце пшеницы и экстрактах семян. Экстракты на нитроцеллюлозных блотах анализировали, используя кроличьи антитела, специфичные для полученного из клона 10 аллергена (20), антитела, специфичные для профилина пшеницы (I №123), для клещевого аллергена (NC), или используя буфер без добавления кроличьих антител (B). Соответствующие сыворотки, полученные до иммунизации, указаны как P №10 и P №123, соответственно. Связанные IgG-антитела выявляли с использованием ¹²⁵I-меченых антител осла против Ig кролика и визуализировали с помощью авторадиографии. Маркеры молекулярной массы (в кД) указаны слева.

Фигура 8 иллюстрирует выявление аллергена, подобного ингибитору сериновых протеиназ, в экстрактах семян пшеницы, риса, кукурузы, фасоли и картофеля. A: Окрашенный Кумасси синим гель, содержащий экстракты пшеницы (W), риса (R) и кукурузы (M), фасоли обыкновенной (B) и картофеля (P). B: Экстракты на нитроцеллюлозных блотах подвергали воздействию сыворотки кролика до иммунизации и C: воздействию антител, специфичных для полученного из клона 10 аллергена. Молекулярные массы (кД) указаны слева.

На фигуре 9 показана локализация полученного из клона 10 аллергена в семенах пшеницы с помощью трансмиссионной электронной микроскопии с иммунологическим мечением частицами золота. A и B: Поперечный срез зерна пшеницы при малом (A) и большом (B) увеличении. На фигуре A показана плодовая оболочка и семенная оболочка (C), алейроновый слой (AL) и начало крахмалистого эндосперма (SE). Прямоугольником на фигуре A показана область, сопоставимая с областью, показанной на фигуре B, т.е. граница между алейроновым слоем и крахмалистым эндоспермом. Прямоугольниками на фигуре B очерчены области, показанные при большом увеличении на фигурах C, D и E, F, соответственно. C и D: Детальное изображение алейроновой клетки зерна пшеницы, исследованной с использованием Ig кролика, полученного против клона 10 (C) или Ig, полученного до иммунизации (D). E и F: Микрофотография при большом увеличении крахмалистого эндосперма после локализации на основе иммунологического мечения частицами золота белка пшеницы 10 с использованием Ig кролика, полученного против Ig клона 10 (E) или Ig до иммунизации (F). Связанные кроличьи антитела выявляли с помощью конъюгированной с золотом антисыворотки козы против Ig кролика (частицы золота = черные точки). Стрелки указывают частицы коллоидного золота. Линиями указано: A, 20 мкм; B, 5 мкм; C-F, 0,5 мкм. AG, алейроновое зерно; AL, алейроновый слой; C, многослойная плодовая и семенная оболочка; CY, вещества цитоплазмы; L, липидное тельце; M, митохондрия; SE, крахмалистый эндосперм; SG, крахмально зерно; W, клеточная стенка.

Фигура 10. Дот-блот-анализ IgE пациентов, страдающих астмой пекарей.

Фигура 11. Дот-блот-анализ IgE пациентов, страдающих пищевой аллергией на пшеницу и аллергии на пыльцу растений.

Фигура 12. Микроматрица аллергенов. A: Схема нанесения на микроматрицу белков и экстракта пыльцы пшеницы. Рекомбинантные белки пшеницы обозначены: 10, 37, 38, 112, 123, 126; WP: экстракт пыльцы пшеницы; рекомбинантные аллергены пыльцы тимофеевки луговой: Ph1 p 1, Ph1 p 5, Ph1 p 7 и Ph1 p 12. Числами в находящемся снизу прямоугольнике указаны маркеры положения. B и C: Изображения микроматриц после инкубации с сывороткой и выявления IgE-реактивных пятен с использованием конъюгированных с флуорофором анти-IgE-антител. B: Изображение после инкубации с сывороткой пациента, не страдающего аллергией. C: Изображения после инкубации с сывороткой типичного пациента, страдающего астмой пекарей (1:B4), индуцированной пшеницей пищевой аллергией (2:F26), аллергией на пыльцу растений (3:G16). Пятнами снизу стекол указаны маркеры положения, которые представляли собой очищенный IgE-антитела, выявляемые с использованием конъюгированных с флуорофором анти-IgE-антител.

Фигура 13. Распространенность IgE-реактивности на белки семян пшеницы, экстракт пыльцы пшеницы и аллергены пыльцы растений. Процент пациентов с IgE-реактивностью показан для случаев астмы пекарей (A) (n=23), пищевой аллергии на пшеницу (B) (n=38) и аллергии на пыльцу растений (C) (n= 17) на оси y. На оси x показаны тестируемые рекомбинантные белки пшеницы №10, №37, №38, №112, №123 и №126, экстракт пыльцы пшеницы, рекомбинантные аллергены пыльцы растений Ph1 p 1 , Ph1 p 5, Ph1 p 7 и Ph1 p 12, «пшеничная смесь», содержащая все рекомбинантные белки пшеницы, CAP пшеничной муки и тимофеевки луговой, используемые для измерения IgE-реактивности.

Подробное описание изобретения

Приведенные ниже примеры иллюстрируют настоящее изобретение в отношении выделения и применения полипептида согласно изобретению. Примеры являются только иллюстративными, и их не следует рассматривать как ограничивающие изобретение, которое определено объемом прилагаемой формулы изобретения. Клон №123, упоминаемый в примерах, является профилином, известным, например, из US 7214786.

ПРИМЕР 1: Клон №10 нового аллергена пшеницы

В примере 1 показана идентификация и характеристика нового аллергена семян пшеницы, клона №10, относящегося к семейству ингибиторов картофеля, семейству ингибиторов сериновых протеаз, которые вместе с другими ингибиторами протеаз называют белками, связанными с патогенезом (PR), семейству PR6. Клон №10 является первым аллергеном, идентифицированным и описанным для семейства PR6. Кроме того, в примере 1 показана экспрессия и очистка рекомбинантного полученного из клона 10 аллергена.

Клон №10 специфично распознавался IgE сыворотки пациентов с астмой пекарей, но не проявлял реактивности по отношению к IgE при тестировании с сыворотками от пациентов, страдающих пищевой аллергией на пшеницу, целиакией или аллергией на пыльцу растений. Поэтому полученный из клона 10 аллерген вместе с другими аллергенами пшеницы можно использовать для разработки диагностических тестов, которые позволяют специфично идентифицировать пациентов, страдающих от IgE-опосредованной астмы пекарей, и отличать таких пациентов от пациентов с пищевой аллергией или аллергией на пыльцу.

Способы

Биологические материалы, сыворотки пациентов и антитела

Семена пшеницы Triticum aestivum сорта Michael получали из Osterreichische Agentur fur Gesundheit und Ernahrungssicherheit GmbH и высевали в теплицу. Незрелые семена собирали на 7, 10, 15, 20, 25, 30 и 35 день после начала опыления сразу в жидкий азот и хранили при -80°C вплоть до использования. Пыльцу пшеницы получали из Allergon (Valinge, Sweden). Рис, кукурузу, фасоль и картофель покупали на местном рынке. Рекомбинантные Ph1 p 1, Ph1 p 5, Ph1 p 7 и Ph1 p 12 приобретали из BIOMAY (Vienna, Austria) и сывороточный альбумин человека (HSA) приобретали из Behring (Marburg, Germany). Сыворотки получали от 22 пациентов, страдающих астмой пекарей. Астму пекарей диагностировали на основании положительного анамнеза, IgE, специфичного по отношению к пшеничной и ржаной муке, выявляемого с помощью системы CAP-FEIA (Phadia, Uppsala, Sweden) и специальных провокационных ингаляционных тестов для подтверждения клинически значимой сенсибилизации (1). Демографические, клинические и серологические данные для таких пациентов суммированы в таблице I. Кроме того, в эксперименты включали сыворотку человека, не страдающего аллергией, сыворотки 4 пациентов, страдающих пищевой аллергией на пшеницу и 4 пациентов с аллергией на пыльцу растений без признаков астмы пекарей, но с IgE-реактивностью сыворотки на пшеничную и ржаную муку (таблица II). Сыворотки пациентов с аллергией на пыльцу растений анализировали в отношении общих уровней IgE в сыворотке и IgE, специфичного в отношении пыльцы тимофеевки луговой в системе CAP-FEIA (Phadia), а пациентов с пищевой аллергией на пшеницу характеризовали как описано ранее (2). Специфичность полученного из клона 10 аллергена для астмы пекарей подтверждали в результате тестирования дополнительных 20 сывороток пациентов с целиакией, 119 пациентов с пищевой аллергией, 23 сывороток пациентов с аллергией на пыльцу растений и 25 пациентов с астмой пекарей с использованием анализа чипов (Constantin et al, не опубликовано).

Специфичные кроличьи антитела против полученного из клона 10 аллергена были получены при иммунизации кролика с месячными интервалами очищенным полученным из клона 10 аллергеном (200 мкг на инъекцию) с использованием полного адъюванта Фрейнда и дважды с использованием IFA (Charles River, Kisslegg, Germany). Сыворотку до иммунизации получали от кролика перед иммунизацией. В целях контроля использовали иммунную сыворотку кролика, специфичную для клещевого аллергена домашней пыли, и кроличью антисыворотку, специфичную для профилина пшеницы.

Конструирование библиотеки кДНК λgt11 из семян пшеницы

Суммарную РНК экстрагировали согласно способу Yeh (3) из семян пшеницы, собранных через двадцать пять дней после начала опыления, и хранили при -80°C. Затем осадок РНК растворяли в буфере, содержащем изотиоцианат гуанидиния (4М изотиоцианат гуанидиния, 0,83% об./об. 3М ацетата натрия, pH 6, 11 мМ β-меркаптоэтанол), и очищали ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлорида цезия (4). Поли-A⁺-РНК выделяли аффинной хроматографией на олиго-dT-целлюлозе (Nucleo Trap mRNA; Machery-Nagel) и синтезировали двунитевую кДНК, используя набор для синтеза кДНК (Система для синтеза кДНК; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). После метилирования EcoRI-метилазой (New England Biolabs, Beverly, MA), к кДНК добавляли EcoRI-линкеры (New England Biolabs). Связанную линкерами кДНК расщепляли EcoRI (Roche Diagnostics). Отщепленные линкеры удаляли на колонке Nick (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) и кДНК лигировали в плечи λgt11 (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Продукт лигирования подвергали упаковке in vitro (набор для клонирования Gigapack III Gold, Stratagene), получая экспрессирующую библиотеку кДНК в λgt11 с 2,43×10⁶ БОЕ.

Выделение и характеристика IgE-реактивных клонов из библиотеки кДНК семян пшеницы

E. coli Y1090 инфицировали, используя 7×10⁵ БОЕ рекомбинантных фагов, и проводили иммунный скрининг, используя IgE сыворотки четырех пациентов (№1, №2, №4, №12), страдающих астмой пекарей, как описано (5). Пятнадцать IgE-реактивных фаговых клонов были отобраны для дальнейшего повторного клонирования, и их ДНК была амплифицирована в ПЦР с использованием смеси для ПЦР Platinum PCR Supermix (Invitrogen, Life Technolgies) и праймеров λgt11 и секвенирована (MWG, Ebersberg, Germany). Полученные последовательности сравнивали с последовательностями, представленными в базе данных GenBank в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI). Осуществляли множественное выравнивание последовательностей, используя базу данных GenBank в NCBI. Для определения идентичности аминокислотных последовательностей использовали программу множественных выравниваний Clustal W. Поиск мотивов осуществляли с помощью программы PROSITE, имеющейся на сервере ExPASy proteomics, для аминокислотного состава использовали программу ProtParam ExPASy. Прогнозирование доступности растворителю и вторичной структуры осуществляли, используя компьютерную программу PROT из центра биоинформатики Колумбийского университета. Филогенетическое древо реконструировали на основе аминокислотной последовательности полученного из клона 10 аллергена и гомологичных белков, используя компьютерную программу «Множественное выравнивание и реконструкция филогенетического древа», предоставленную Институтом молекулярной генетики Макса Планка.

Экспрессия и очистка полученного из клона 10 рекомбинантного аллергена

Кодирующую область кДНК клона 10 амплифицировали в ПЦР, используя следующую пару праймеров: прямой 5'-CATATGAGCCCTGTGGTGAAGAAGCCGGAGGGA-3' и обратный 5'-GAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGCCGACCCTGGGGAC-3' (MWG). Продукт ПЦР содержат сайты рестрикции NdeI (курсивом), EcoRI (подчеркнут) и последовательность, кодирующую гексагистидиновую метку (жирным шрифтом). Продукт ПЦР субклонировали в векторе AccepTor (Novagen, Madison, WI) и снова секвенировали (MWG). Затем вставку вырезали из вектора AccepTor, используя NdeI и EcoRI (Roche Diagnostics), очищали в геле (Promega, Madison, WI, USA) и субклонировали в экспрессирующей плазмиде pET 17b (Novagen). Последовательность ДНК подтверждали секвенированием обеих нитей ДНК (Microsynth, Balgach, CH). Конструкцией pET 17b-клон 10 трансформировали клетки E. coli BL21 (DE3) (Stratagene) и выращивали в среде Луриа (17), содержащей 100 мг/л ампициллина, при 37°C до OD (600 нм) 0,8-1. Экспрессию белка индуцировали добавлением изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 0,5 мМ и выращивали бактерии еще в течение 3 часов. Бактерии собирали центрифугированием и гомогенизировали в 25 мМ имидазоле, pH 7,5, 0,1% (об./об.) тритоне X-100, используя Ultraturrax (IKA, Stauffen, Germany). ДНК расщепляли, добавляя ДНКазу I, дополнительно перемешивали еще в течение 10 минут при 20°C, реакцию останавливали, используя 200 мкл 5 М NaCl, и затем центрифугировали при 4°C (6000×g, 20 минут). Большую часть полученного из клона 10 аллергена обнаружили в нерастворимой фракции бактериального экстракта. Полученный из клона 10 аллерген очищали из осадка, содержащего тельца включения, в денатурирующих условиях, используя аффинные колонки с Ni-NTA-смолой, согласно руководству QIAexpressionist (QIAGEN, Hilden, Germany). Фракции, содержащие рекомбинантный аллерген, объединяли и диализовали против 10 мМ NaH₂PO₄, pH 7,5. Концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белка Micro BCA (Pierce, Rockford, IL).

ELISA

Полученный из клона 10 аллерген растворяли в PBS в концентрации 5 мкг/мл и покрывали планшеты для ELISA (Nunc Maxisorb, Roskilde, Denkmark). После блокирования 1% (масс./об.) БСА в PBS, 0,05% (об./об.) твин-20 (PBST), планшеты инкубировали с сыворотками в разведении 1:50 в PBST с 0,5% (масс./об.) БСА для измерения IgG₁, IgG₂, IgG₃ и IgG₄, как описано (6). Связанные антитела выявляли посредством инкубации сначала с моноклональными антителами мыши против подкласса IgG человека (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) в разведении 1:1000 в PBST, 0,5% (масс./об.) БСА и затем со связанной с пероксидазой хрена антисывороткой овцы против Ig мыши (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) в разведении 1:2000 в PBST, 0,5% (масс./об.) БСА, как описано ранее (2). Все определения осуществляли в двух повторах, и результаты выражали в виде средних значений.

Экстракты белков, SDS-ПААГ и иммуноблоты

Экстракты белков с SDS из зрелых и незрелых семян пшеницы, риса (Oryza sativa), кукурузы (Zea mays), фасоли (Phaseolus vulgaris) и картофеля (Solarium tuberosum) готовили посредством гомогенизации 3 грамм ткани в 32 мл буфера для образцов (6) и затем кипятили в течение 10 минут. Чтобы удалить нерастворимые частицы экстракты центрифугировали при 10000×g в течение 10 минут при 4°C и надосадки хранили в виде аликвот при -20°C. Кроме того, готовили экстракт белка в PBS из семян пшеницы, как описано ранее (2). Пыльцу Triticum aestivum (500 мг) экстрагировали при 4°C в течение ночи в 5 мл PBS, 2 мМ EDTA, 1 мМ PMSF. После центрифугирования в течение 1 часа при 13000×g и 4°C определяли концентрацию белка в надосадке, используя набор для анализа белка Micro BCA (Pierce), и аликвоты хранили при -20°C вплоть до использования. Равные количества экстрактов белка с SDS разделяли в 14% препаративных SDS-полиакриламидных гелях (7). В качестве стандарта использовали маркер молекулярной массы (маркер Rainbow, GE Healthcare; стандарт белка Precision Plus, BioRad, Herkules, CA; предварительно окрашенный лэддер белков Page Ruler, Fermentas, Burlington, Ontario). После электрофоретического разделения белки либо окрашивали Кумасси бриллиантовым синим, либо переносили на нитроцеллюлозные мембраны (Schleich and Schuell, Dassel, Germany) (8). Мембраны блокировали в буфере A (50 мМ натрий-фосфатный буфер, pH 7,4, 0,5% масс./об. БСА, 0,5% об./об. твин-20, 0,05% масс./об. NaN₃) два раза по 10 минут и один раз в течение 30 минут и инкубировали в течение ночи при 4°C с кроличьей антисывороткой, специфичной для полученного из клона 10 аллергена, с соответствующий сывороткой, полученной до иммунизации, и в целях контроля с кроличьей антисывороткой, специфичной для неродственного антигена, или только с буфером. Сыворотки кролика разводили 1:50000 в буфере A. Связанные антитела выявляли с использованием разведенных 1:2000 в буфере A ¹²⁵I-меченых антител осла против Ig кролика (GE Healthcare) в течение 2 часов при комнатной температуре и визуализировали на пленках Kodak XOMAT с использованием усиливающих экранов (Kodak, Heidelberg, Germany) при -70°C. В случае дот-блот-экспериментов для анализа IgE 100 нг рекомбинантного полученного из клона 10 аллергена и рекомбинантных аллергенов пыльцы растений, Ph1 p 1 , Ph1 p 5, Ph1 p 7 и Ph1 p 12, а также 3 мкг экстракта пыльцы пшеницы и 2 мкг PBS-экстракта зрелых семян пшеницы в виде пятен наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Полоски нитроцеллюлозы блокировали буфером A и подвергали воздействию сыворотки пациентов в разведении 1:10 в буфере A в течение ночи при 4°C. Связанные IgE-антитела выявляли с использованием ¹²⁵I-меченых антител против IgE человека (RAST RIA, Demeditec Diagnostics, Germany) в разведении 1:20 в буфере A в течение ночи при комнатной температуре и визуализировали с помощью авторадиографии, используя пленки Kodak XOMAT с усиливающими экранами (Kodak) при -70°C.

Анализы МС и КД рекомбинантного клона 10

Масс-спектры с лазерной десорбцией получали в линейном режиме, используя прибор TOF Compact MALDI II (Kratos, Manchester, UK; piCHEM, Research and Development, Graz, Austria). Образцы растворяли в 10% ацетонитриле (0,1% трифторуксусная кислота), и α-циано-4-гидроксикоричную кислоту (растворенную в 60% ацетонитриле с добавлением 0,1% трифторуксусной кислоты) использовали в качестве матрицы. Для получения образцов смесь 1/1 белка и раствора матрицы помещали на мишень и сушили на воздухе.

Измерения КД осуществляли с использованием очищенного полученного из клона 10 аллергена (в H₂O) при концентрации белка 0,1 мг/мл на спектрополяриметре Jasco J-810 (Tokyo, Japan), используя прямоугольную кварцевую кювету, длина пути 0,2 см. КД-спектры в дальней ультрафиолетовой области регистрировали от 190 нм до 260 нм с разрешением 0,5 нм и скоростью сканирования 50 нм/мин и получали среднее значение из трех сканирований. Результаты выражены в виде средней остаточной эллиптичности (θ) при данной длине волны. Температурное сканирование осуществляли согласно способу пошагового сканирования, при котором образец нагревали от 25°C до 95°C со скоростью нагревания 2°C/мин и снова охлаждали до 25°C с такой же скоростью. Через каждые 5°C регистрировали спектры с непрерывным изменением длины волны с использованием конкретных параметров. Кроме того, температурн