Растения, имеющие усиленные признаки, связанные с урожайностью, и способ их получения

Растения, имеющие усиленные признаки, связанные с урожайностью, и способ их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится в целом к области молекулярной биологии и касается способа усиления различных признаков растений, связанных с урожайностью, путем увеличения экспрессии в растении последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, выбранный из группы, состоящей из: полипептид GRF, RAA1-подобный полипептид, полипептид SYR, полипептид ARKL и полипептид YTP. Настоящее изобретение также касается растений, имеющих увеличенную экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, выбранный из группы, состоящей из: полипептид GRF, RAA1-подобный полипептид, полипептид SYR, полипептид ARKL и полипептид YTP, при этом растения имеют усиленные признаки, связанные с урожайностью, по сравнению с контрольными растениями. Изобретение также предоставляет конструкции, применимые в способах по изобретению.

Постоянно увеличивающееся население мира и истощающийся запас пахотных земель, пригодных для сельского хозяйства, способствуют исследованиям по направлению к увеличению эффективности сельского хозяйства. Обычные средства для улучшения сельскохозяйственных и садовых культур используют методы селекционного разведения для определения растений, имеющих желательные характеристики. Однако такие методы селекционного разведения имеют некоторые недостатки, а именно эти методы обычно являются трудоемкими и приводят к растениям, которые часто содержат гетерогенные генетические компоненты, которые не всегда могут приводить к желательному признаку, переданному от родительских растений. Достижения в молекулярной биологии позволяют человечеству модифицировать зародышевую плазму животных и растений. Генетическая инженерия растений включает в себя выделение и манипуляции с генетическим материалом (обычно в форме ДНК или РНК) и последующее введение этого генетического материала в растение. Такая технология обладает способностью производить сельскохозяйственные культуры или растения, имеющие различные улучшенные экономические, агрономические или садоводческие признаки.

Признаком особого экономического интереса является увеличенная урожайность. Урожайность обычно определяют как измеряемую продукцию экономической ценности из сельскохозяйственной культуры. Она может определяться в терминах количества и/или качества. Урожайность непосредственно зависит от нескольких факторов, например числа и размера органов, структуры растений (например, число побегов), продукции семян, старения листьев и не только. Развитие корней, поглощение питательных веществ, устойчивость к стрессу и ранняя мощность могут также быть важными факторами в определении урожайности. Оптимизация вышеупомянутых факторов, следовательно, может способствовать увеличению урожайности сельскохозяйственных культур.

Урожайность семян является чрезвычайно важным признаком, так как семена многих растений являются важными для питания людей и животных. Сельскохозяйственные культуры, такие как кукуруза, рис, пшеница, канола и соя составляют более половины общего потребления калорий человеком или путем непосредственного употребления самих семян, или путем употребления мясных продуктов, выращенных на переработанных семенах. Они также являются источником сахаров, масел и многих видов метаболитов, используемых в промышленных процессах. Семена содержат зародыш (источник новых побегов и корней) и эндосперм (источник питательных веществ для роста зародыша во время прорастания и начального роста сеянцев). Развитие семени включает много генов и требует переноса метаболитов от корней, листьев и стеблей в растущее семя. Эндосперм, в частности, осуществляет ассимиляцию метаболических предшественников углеводов, жиров и белков и синтезирует их в запасные макромолекулы для наполнения зерна.

Растительная биомасса представляет собой урожай кормовых культур, таких как люцерна, силосная кукуруза и сено. Многие показатели урожая используются для зерновых культур. Важнейшими из них являются оценки размера растения. Размер растения может измеряться многими путями в зависимости от видов и стадии развития, но включает общую сухую массу растений, сухую надземную массу, сырую надземную массу, листовую поверхность, объем стебля, высоту растения, диаметр розетки, длину листа, длину корней, массу корней, число побегов и число листьев. Многие виды сохраняют консервативное соотношение между размером различных частей растения на определенной стадии развития. Эти аллометрические соотношения используются для экстраполяции от одного из этих показателей размера к другому (например, Tittonell et al (2005) Agric Ecosys & Environ 105:213). Размер растения на ранней стадии развития обычно может коррелировать с размером растения, более позднего по развитию. Более крупное растение с большей листовой поверхностью обычно может поглощать больше света и диоксида углерода, чем более маленькое растение, и, следовательно, может, вероятно, набирать более высокую массу в течение того же самого периода (Fasoula & Tollenaar 2005 Maydica 50:39). Это является дополнением к потенциальному продолжению преимущества микросреды или генетического преимущества, которые растение имеет изначально для достижения большего размера. Существует серьезный генетический компонент для размера растения и скорости роста (например, ter Steege et al. (2005) Plant Physiology 139:1078), и таким образом в пределах различных генотипов размер растения в одних условиях окружающей среды, вероятно, коррелирует с размером в других (Hittalmani et al. (2003) Theoretical Applied Genetics 107:679). Таким образом, стандартная окружающая среда используется как показатель для разнообразных и динамических условий окружающей среды, обнаруженных в различных местах и временах у сельскохозяйственных культур на поле.

Другим важным признаком для многих сельскохозяйственных культур является ранняя мощность. Улучшение ранней мощности является важным объектом современных программ селекции риса и для сортов умеренного климата, и для тропических сортов риса. Длинные корни важны для надлежащего закрепления в почве посеянного в воду риса. Там, где рис сеют непосредственно в затопленные поля, и там, где растения должны быстро подниматься через воду, более длинные побеги ассоциированы с мощностью. Когда практикуется рядовой посев, более длинные мезокотили и колеоптили важны для хорошего появления всходов. Способность создать раннюю мощность в растениях имела бы огромное значение в сельском хозяйстве. Например, плохая ранняя мощность является ограничением для введения гибридов кукурузы (Zea mays L.) на основе зародышевой плазмы кукурузного пояса в Атлантической Европе.

Индекс урожайности, отношение урожайности семян к сухой надземной массе, является относительно стабильным при многих условиях окружающей среды, и, следовательно, во многих случаях может быть получена прочная корреляция между размером растения и урожаем зерна (например, Rebetzke et al. (2002) Crop Science 42:739). Эти процессы по существу связаны, поскольку большая часть биомассы зерновых зависит от текущей или накопленной фотосинтетической продуктивности листьев и стебля растения (Gardener et al. (1985) Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, p.68-73). Следовательно, отбор по размеру растения, даже на ранних стадиях развития, используется как индикатор будущей потенциальной урожайности (например, Tittonell et al. (2005) Agric Ecosys & Environ 105:213). При исследовании влияния генетических различий на устойчивость к стрессу, способность стандартизировать свойства почвы, температуру, наличие воды и питательных веществ интенсивность света является важным преимуществом условий окружающей среды в теплицах или камерах для выращивания растений по сравнению с полевыми условиями. Однако искусственные ограничения по урожайности вследствие недостаточного опыления из-за отсутствия ветра или насекомых или недостаточного пространства для роста развитых корней или растительного полога могут ограничивать применение этих контролируемых условий окружающей среды для исследования различий по урожайности. Следовательно, измерения размера растений на ранней стадии развития в стандартизованных условиях в камере для выращивания или теплице являются стандартными приемами для обеспечения показателя потенциальных генетических преимуществ урожайности.

Другой важный признак соответствует улучшенной устойчивости к абиотическому стрессу. Абиотический стресс является основной причиной всемирных потерь сельскохозяйственных культур, уменьшая среднюю урожайность для большинства основных сельскохозяйственных культур более чем на 50% (Wang et al. (2003) Planta 218:1-14). Абиотические стрессы могут вызываться засухой, засолением, экстремальными значениями температур, химической токсичностью, избытком или недостаточностью питательных веществ (макроэлементов и/или микроэлементов), радиационным и окислительным стрессом. Возможность увеличить устойчивость растений к абиотическому стрессу явилась бы значительным экономическим преимуществом для фермеров по всему миру и позволила бы культивирование сельскохозяйственных культур во время неблагоприятных условий и на территориях, где культивирование сельскохозяйственных культур иначе невозможно.

Следовательно, урожайность сельскохозяйственных культур можно увеличить оптимизацией одного из вышеупомянутых факторов.

В зависимости от конечного применения модификация определенных признаков урожайности может являться предпочтительной по сравнению с другими. Например, для таких применений, как выращивание кормовых культур, или производство древесины, или источник биологического топлива, увеличение вегетативных частей растений может быть желательным, и для таких применений, как производство муки, крахмала или масла, увеличение параметров семян может быть особенно желательным. Даже среди параметров семян некоторые могут быть предпочтительнее, чем другие в зависимости от применения. Различные механизмы могут делать вклад в увеличение урожайности семян, а именно в форме увеличенного размера семян или увеличенного числа семян.

Один из подходов к усилению признаков, связанных с урожайностью (урожайность семян и/или биомассы), у растений может осуществляться через модификацию внутренних механизмов роста растения, таких как клеточный цикл или различные пути передачи сигналов, вовлеченные в рост растений или в защитные механизмы.

В настоящее время было обнаружено, что различные признаки, связанные с урожайностью семян, могут усиливаться в растениях по сравнению с контрольными растениями путем увеличения экспрессии в растении последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фактора, регулирующего рост (GRF). Усиленные признаки, связанные с урожайностью, содержат один или более из: увеличенная ранняя мощность, увеличенная надземная биомасса, увеличенная общая урожайность семян на растение, увеличенный уровень наполнения семян, увеличенный индекс урожайности и увеличенная масса тысячи зерен.

В настоящее время было обнаружено, что различные параметры роста могут быть улучшены у растений путем модуляции экспрессии в растении нуклеиновой кислоты, кодирующей RAA1-подобный (ассоциированный со строением корня, 1) полипептид в растении.

В настоящее время было обнаружено, что различные параметры роста, в частности увеличенная устойчивость к абиотическому стрессу, могут быть улучшены у растений модуляцией экспрессии в растении нуклеиновой кислоты, кодирующей белок регулятор урожайности семян (SYR).

В настоящее время было обнаружено, что различные признаки, связанные с урожайностью семян, могут быть улучшены у растений модуляцией экспрессии в растении нуклеиновой кислоты, кодирующей ARKL (ARADIA подобный) полипептид в растении.

В настоящее время было обнаружено, что различные признаки, связанные с урожайностью семян, могут быть улучшены у растений модуляцией экспрессии в растении нуклеиновой кислоты, кодирующей YTP (трансмембранный белок урожайности) в растении.

Предшествующий уровень техники

ДНК-связывающие белки представляют собой белки, которые содержат любой из многочисленных ДНК-связывающих доменов и таким образом имеют специфическое или общее сродство к ДНК. ДНК-связывающие белки включают, например, факторы транскрипции, которые модулируют процесс транскрипции, нуклеазы, которые расщепляют молекулы ДНК, и гистоны, которые вовлечены в упаковку ДНК в ядре клетки.

Факторы транскрипции обычно определяют как белки, которые демонстрируют специфическое для последовательности ДНК-связывающее сродство, и которые способны активировать и/или подавлять транскрипцию. Геном Arabidopsis thaliana кодирует по меньшей мере 1533 транскрипционных регуляторов, составляющих ~5.9% его предполагаемого общего числа генов (Riechmann et al. (2000) Science 290:2105-2109). База данных факторов транскрипции риса (DRTF) представляет собой коллекцию известных и предсказанных факторов транскрипции Oryza sativa L. ssp. indica и Oryza sativa L ssp. japonica и в настоящее время содержит 2025 предполагаемых моделей генов факторов транскрипции (TF) в indica и 2384 в japonica, распределенных в 63 семейства (Gao et al. (2006) Bioinformatics 2006, 22(10):1286-7).

Одним из этих семейств является семейство факторов транскрипции, представляющее собой семейство фактора, регулирующего рост (GRF), которое является специфическим для растений. По меньшей мере девять полипептидов GRF идентифицировано в Arabidopsis thaliana (Kim et al. (2003) Plant J 36:94-104) и по меньшей мере двенадцать - в Oryza sativa (Choi et al. (2004) Plant Cell Physiol 45(7):897-904). Полипептиды GRF характеризуются присутствием на их N-концевой части по меньшей мере двух высококонсервативных доменов, названных в честь наиболее консервативных аминокислот внутри каждого домена: (i) домен QLQ (per. номер InterPro IPR014978, per. номер PFAM PF08880), где наиболее консервативные аминокислоты домена представляют собой Gln-Leu-Gln; и (ii) домен WRC (рег. номер InterPro IPR014977, рег. номер PFAM PF08879), где наиболее консервативные аминокислоты домена представляют собой Trp-Arg-Cys. Домен WRC также содержит два отличительных структурных признака, а именно домен WRC обогащен основными аминокислотами Lys и Arg и также содержит три Cys и один His остатки в консервативном участке (СХ₉СХ₁₀СХ₂Н), обозначенном как домен эффектора транскрипции (ЕТ) (Ellerstrom et al. (2005) Plant Molec Biol 59:663-681). Консервативный участок цистеиновых и гистидиновых остатков в домене ЕТ напоминает участок белков «цинковые пальцы» (цинксвязывающие белки). Кроме того, сигнал ядерной локализации (NLS) обычно содержится в полипептидных последовательностях GRF.

Взаимодействие некоторых полипептидов GRF с небольшим семейством транскрипционных коактиваторов, GRF-взаимодействующих факторов (GIF1 - GIF3; также называемых полипептидами транслокации синовиальной саркомы (SYT) (synovial sarcoma translocation (SYT) polypeptide), SYT1 - SYT3), продемонстрировано с использованием анализа взаимодействия с помощью дрожжевых двойных гибридов (Kirn & Kende (2004) Proc Natl Acad Sci 101:13374-13379).

Название GRF также дано другому типу полипептидов, принадлежащих семейству 14-3-3 полипептидов (de Vetten & Ferl (1994) Plant Physiol 106:1593-1604), которые абсолютно не имеют отношения к полипептидам GRF, используемым при выполнении способов по изобретению.

Трансгенные растения Arabidopsis thaliana, трансформированные полипептидом GRF (OsGRF1) риса под контролем вирусного конститутивного промотора 35S CaMV, демонстрировали скрученные листья, сильно сниженное продолжение первичного цветения и задержку выметывания (van der Knapp et al. (2000) Plant Physiol 122:695-704). Трансгенные растения Arabidopsis thaliana, трансформированные одним из двух полипептидов GRF Arabidopsis (AtGRF1 и AtGRF2), развивавшие более крупные листья и семядоли, имели задержку в выметывании и были частично стерильны (вследствие отсутствия жизнеспособной пыльцы) по сравнению с растениями дикого типа (Kim et al. (2003) Plant J 36:94-104).

В патентной заявке США US2006/0048240 полипептид GRF Arabidopsis thaliana идентифицирован как SEQ ID NO:33421. В патентной заявке США US 2007/0022495 полипептид GRF Arabidopsis thaliana идентифицирован как SEQ ID NO:1803 (также он там упоминается как G1438). Трансгенные растения Arabidopsis, сверхэкспрессирующие G1438 с использованием промотора 35S CaMV, демонстрируют темно-зеленые листья.

Неожиданно в настоящее время было обнаружено, что увеличение экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид GRF, дает растения, имеющие усиленные признаки, связанные с урожайностью, по сравнению с контрольными растениями.

Согласно одному варианту осуществления изобретения предоставляется способ усиления признаков, связанных с урожайностью, у растений по сравнению с контрольными растениями, предусматривающий увеличение экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид GRF в растении. Усиленные признаки, связанные с урожайностью, содержат один или более из: увеличенная ранняя мощность, увеличенная надземная биомасса, увеличенная общая урожайность семян на растение, увеличенный уровень наполнения семян, увеличенный индекс урожайности и увеличенная масса тысячи зерен.

О молекулярной биологии формирования корней у однодольных растений известно немного. До настоящего времени было идентифицировано только несколько генов, которые влияют на развитие корней: примерами являются мутант rt1, который формирует малочисленные или не формирует корневые шейки и опорные корни (Jenkins, J. Hered. 21:79-80, 1930), мутант asr1, который демонстрирует дефектные зародышевые корешки (De Miranda et al., Maize Genet. Coop. News Lett. 54:18-19, 1980), мутант rtcs, не имеющий узловых (придаточных) корней (Hetz et al., Plant J. 10:845-857, 1996), мутант slr1 и мутант slr2 с укороченными боковыми корнями (Hochholdinger et al., Plant Physiol 125:1529-1539, 2001) или rum1, у которого нарушенная боковая инициация у первичного корня, а также инициация формирования зародышевого корешка (Woll et al., Plant Physiol., 139, 1255-1267, 2005). Liu et al. (Proteomics 6, 4300-4308, 2006) сделал протеомическое сравнение между первичными корнями сеянцев дикого типа и rum1 и обнаружил другие 12 генов, которые по-другому регулируются и вовлечены в биосинтез лигнина, защитные функции и цитратный цикл.

Другим геном, вовлеченным в формирование корней у однодольных растений, является гаа1, впервые изолированный из риса (Ge et al., Plant Physiol. 135, 1502-1513, 2004): этот ген кодирует 12.0 кДа белок, имеющий 58% гомологии с FPF1 (стимулирующий цветение фактор 1) Arabidopsis. В рисе RAA1 экспрессировался специфически в апикальной меристеме, зоне элонгации корневого кончика, стелах зоны ветвления и молодом боковом корне. Конститутивная сверхэкспрессия увеличивала число придаточных корней, но рост первичного корня снижался. Кроме того, увеличивалось содержание эндогенного ауксина. OsRAA1 также индуцировался ауксином; предполагается, что существует регуляция с положительной обратной связью между RAA1 и ауксином при развитии корней риса (Ge et al., 2004). Более того, растения, сверхэкспрессирующие OsRAA1, имели более длинные листья и стерильные цветки (Ge et al., 2004). WO 2006/067219 раскрывает применение FPF1 и родственных белков для увеличения получения углеводов в растениях, но трансгенные растения, сверхэкспрессирующие FPF1, не демонстрировали увеличенной урожайности семян и не сообщалось о влиянии на рост корней.

Неожиданно было обнаружено, что модуляция экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей RAA1-подобный полипептид, дает растения, имеющие улучшенные признаки, связанные с урожайностью, по сравнению с контрольными растениями.

Согласно одному варианту осуществления изобретения представляется способ улучшения признаков, связанных с урожайностью, у растения по сравнению с контрольными растениями, предусматривающий модуляцию экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей RAA1-подобный полипептид в растении. Улучшенные признаки, связанные с урожайностью, содержали увеличенные высоту, показатель побег/корень, толщину корня, индекс зелени, число цветков на метелку и увеличенную массу тысячи зерен. Улучшенные признаки, связанные с урожайностью, наблюдали при нормальных условиях роста, а также при стрессовых условиях.

Регулятор урожайности семян (SYR) представляет собой новый белок, который ранее не был охарактеризован. SYR демонстрирует некоторую гомологию (около 48% идентичности последовательности на уровне ДНК, около 45% на уровне белка) с белком Arabidopsis, названным ARGOS (Hu et al., Plant Cell 15, 1951-1961, 2003; US 2005/0108793). Hu et al. постулировал, что ARGOS представляет собой белок с уникальной функцией и кодирует один ген. Основные фенотипы сверхэкспрессии ARGOS в Arabidopsis представляются собой увеличенную биомассу листьев и отсроченное цветение. В отличие от этого сверхэкспрессия SYR в рисе в основном увеличивает урожайность семян, тогда как на биомассу листьев и период цветения не оказывается явного воздействия.

Неожиданно в настоящее время было обнаружено, что модуляция экспрессии в растении нуклеиновой кислоты, кодирующей белок регулятор урожайности семян (в дальнейшем именуемый SYR), дает растения, которые при выращивании в условиях абиотического стресса имеют улучшенную устойчивость к абиотическому стрессу по сравнению с контрольными растениями.

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает способ улучшения признаков, связанных с урожайностью, у растений, выращенных в условиях абиотического стресса, по сравнению с контрольными растениями, предусматривающий модуляцию экспрессии в растении нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SYR.

Полипептиды ARKL содержат домен RING-палец, который имеет сходство с обнаруженным в мышином белке ARKADIA, Е3 убиквитин-лигазой, вовлеченной в передачу сигнала Nodal во время эмбриогенеза (Mavrakis et al. 2007; PLoS Biol. 2007 Mar; 5(3):e67).

Убиквитилирование, способ, посредством которого белок модифицируется путем ковалентного присоединения убиквитина, является центральной и основной частью различных клеточных процессов у эукариот. У растений нарушения на этом пути вызывают многочисленные аберрации в развитии, измененную реакцию на внешние раздражители и модифицируют клеточный цикл и паттерны роста. Убиквитинированные белки предназначены для деградации через зависимый или не зависимый от протеасомы 268 путь. Модификация убиквитином играет роль в активации сигнальных белков, эндоцитозе, сортировке и модификации гистонов.

Судьба убиквитинированного белка определяется природой убиквитиновой связи. Один или множество убиквитинов могут присоединяться к мишени (моно- и полиубиквитинирование; специфический Lys остаток, использованный для формирования убиквитиновой цепочки, может влиять на конечную судьбу модифицированного белка, например, будет ли это деградация или активирование).

Присоединение убиквитина к белкам происходит в ходе многоэтапного процесса, включающего три фермента, именуемых Е1, Е2, Е3 (Glikcman and Ciechanover (2000) Physiol Rev 82:377-482). Вначале убиквитин связывается с белком АТФ-зависимым образом и затем переносится на цистеиновый акцептор в белке Е2 с образованием Е2-убиквитинового интермедиата, который действует как убиквитиновый донор в отношении белка-мишени в реакции, опосредуемой убиквитин-лигазой, также называемой лигазой Е3 или ферментом Е3. Существует множество типов лигаз Е3. Е3 лигазы типа RING характеризуются присутствием консервативного домена белка, названного RING-палец или RING-ZnF (Действительно Интересный Новый Ген (Really Interesting New Gene) - цинковый палец).

Цинк-связывающие мотивы представляют собой стабильные структуры, и они редко подвергаются конформационным изменениям при связывании со своей мишенью. Большая часть белков ZnF содержит множество пальцеподобных выступов, которые осуществляют тандемные контакты с их молекулой-мишенью, обычно распознавая вытянутые (extended) субстраты. RING-палец является специализированным цинк-связывающим доменом, который вероятно функционирует во взаимодействиях белок-белок. RING-палец составляет 40-60 остатков в длину и координирует два атома цинка. Он отличается от других цинковых пальцев, так как восемь аминокислотных остатков - лигандов металлов, которые координируют ион цинка, входят в специфическую структуру, называемую структурой «кросс скобки» (cross-brace) (Borden (2000). J MolBiol 295:1103-1112). Участок цистеинов/гистидинов, координирующих ионы цинка в таком домене, представляет собой С-х(2)-С-х(9-39)-С-х(1-3)-Н-х(2-3)-С-х(2)-С-х(4-48)-С-х(2)-С. Пары лигандов ионов металлов первая и третья координируются для связывания одного иона цинка, в то время как пары вторая и четвертая связывают второй.

Существуют два различных варианта, С3НС4-типа и С3Н2С3-типа, которые несомненно являются родственными, несмотря на различный цистеин/гистидин паттерн. Последний тип иногда называют 'RING-H2 палец'. В последнем координация иона цинка опосредуется 6 цистеинами и 2 гистидинами, в то время как в С3НС4 опосредуется 7 цистеинами и одним гистидином.

В Arabidopsis thaliana существуют по меньшей мере 477 предполагаемых белков, содержащих домен RING. Некоторые содержат множество доменов RING-пальцев. Домены RING классифицированы на восемь типов, основываясь на присутствующем остатке лиганда иона металла и/или числе аминокислот между ними (Stone at al. 2005) Plant Phys. 137, 13-30. Класс RING-H2 является самым большим классом в Arabidopsis. Основываясь на природе доменов и их организации, белки RING-пальцы в Arabidopsis также классифицируют на 30 групп, Группа 1 - Группа 30. Также распознаются подгруппы внутри некоторых групп, например подгруппы 2.1 и 2.2 группы 2 (Stone et al. 2005). Группу 1 относят к группе белка RING-палец, не имеющего ранее описанных доменов. Анализ последовательностей этих белков выявил области сходства между некоторыми белками за пределами домена RING, которые назвали DAR1 - DAR3 (домен, ассоциированный с RING). DAR1 и DAR3 составляют в длину приблизительно 40 аминокислот, a DAR2 - 120. Сообщали, что DAR1 встречается только в белках растительного происхождения (Stone et al. 2005). Присутствие общих консервативных доменов наводило на мысль о родственной функции белков, содержащих эти домены.

Неожиданно в настоящее время было обнаружено, что модуляция экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ARKL, дает растения, имеющие улучшенные признаки, связанные с урожайностью, в частности увеличенную урожайность по сравнению с контрольными растениями.

Согласно одному варианту осуществления изобретения предоставляется способ улучшения или увеличения признаков, связанных с урожайностью, у растения по сравнению с контрольными растениями, предусматривающий модуляцию экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ARKL в растении.

Все эукариотические клетки содержат сложные системы внутренних мембран, которые устанавливают различные окруженные мембранами компартменты внутри клетки. Эндомембранная система представляет собой совокупность мембранных структур, вовлеченных в транспорт внутри клетки. Основными компонентами эндомембранной структуры являются эндоплазматический ретикулум, тельца Гольджи, пузырьки, клеточная мембрана и ядерная оболочка. Члены эндомембранной системы пропускают вещества через друг друга или посредством применения пузырьков. Общий признак всех клеток представляет собой наружную ограничивающую мембрану, называемую плазматической мембраной.

Клеточные мембраны построены из липидов и белков. Связь белков с мембраной может осуществляться через ковалентную связь, посредством которой белок присоединяется к липидам мембраны. В случае так называемых трансмембранных белков полипептидные цепочки белка в действительности проходят липидный бислой. Связь с мембраной может также происходить через соединение с белком, так называемым периферическим белком, посредством нековалентных связей с выступающими частями интегральных мембранных белков.

Трансмембранные белки (белки ТМ) имеют амфифильную природу с гидрофобными сегментами ТМ (TMS) и гидрофильными петлями. В трансмембранных белках часть внутри липидного бислоя состоит в основном из гидрофобных аминокислот. Они обычно организованы в альфа-спираль, так что полярные карбокси (-С=O) и амино (-NH) группы в пептидных связях могут взаимодействовать друг с другом, а не с их гидрофобным окружением. Те части полипептида, которые выступают за пределы бислоя, стремятся иметь высокий процент гидрофильных аминокислот. Следовательно, те, которые выступают во внеклеточное пространство, обычно являются гликозилированными.

Трансмембранная топология белка определена на основе экспериментальной рентгеновской кристаллографии, ЯМР, метода слияния генов, метода доступности замещенного цистеина, эксперимента по Asp(N)-связанному гликозилированию и других биохимических методов. Кроме того, разработан ряд методов предсказания трансмембранной топологии для определения структуры и функции ТМ белков из их аминокислотных последовательностей (Moller et al., 2001; Ikeda et al., 2002; Chen et al., 2002).

Анализ сходства белковых последовательностей между белками пользуется разработками в области геномики. Ряд доменов, консервативных между двумя или более белками, для которых никакой функции еще не установлено, могут исследоваться с использованием специфических алгоритмов. Один такой консервативный домен представляет собой так называемый домен DUF221 (домен с неизвестной функцией 221), как описано у Pfam (Finn et al. Nucleic Acids Research (2006) Database Issue 34:D247-D251). Этот домен обнаружен в семействе гипотетических трансмембранных белков, ни один из которых не имеет какой-либо известной функции, и выровненный участок составляет 538 остатков при максимальной длине. Этот домен встречается в ряде белков эукариотического происхождения. Сообщают, что экспрессия гена Arabidopsis, EDR4, кодирующего белок, содержащий DUF221, происходит вскоре после дегидратации (Kiyosue et al; Plant Mol Biol. 1994 25(5):791-8). Нокаутный мутант Arabidopsis, gfs10, no гену, кодирующему другой домен DUF221-содержащий белок, как сообщают, имеет фенотип, сходный с фенотипом мутантов вакуолярной сортировки (Fuji et al; 2007. Plant Cell. 2007. 19(2).-597-609).

Неожиданно в настоящее время было обнаружено, что модуляция экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид YTP, дает растения, имеющие улучшенные признаки, связанные с урожайностью, в частности увеличенную урожайность по сравнению с контрольными растениями.

Согласно одному варианту осуществления изобретения предоставляется способ усиления (улучшения) признаков, связанных с урожайностью, у растения по сравнению с контрольными растениями, предусматривающий модуляцию экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид YTP в растении.

Определения

Полипептид(ы)/Белок(белки)

Термины "полипептид" и "белок" используются здесь взаимозаменяемо и относятся к аминокислотам в полимерной форме любой длины, соединенным вместе пептидными связями.

Полинуклеотид(ы)/Нуклеиновая(ые) кислота(ы)/ Последовательность(и) нуклеиновой(ых) кислот(ы)/нуклеотидная(ые) последовательность(и)

Термины "полинуклеотид(ы)", "последовательность(и) нуклеиновой(ых) кислот(ы)", "нуклеотидная(ые) последовательность(и)", "нуклеиновая(ые) кислота(ы)", "молекула нуклеиновой кислоты" используются здесь взаимозаменяемо и относятся к нуклеотидам, или рибонуклеотидам, или дезоксирибонуклеотидам, или комбинации их обоих в полимерной неразветвленной форме любой длины.

Контрольное(ые) растение(я)

Выбор подходящих контрольных растений является рутинной частью экспериментальной подготовки и может включать соответствующие растения дикого типа или соответствующие растения, не содержащие рассматриваемый ген. Контрольное растение обычно представляет собой растение того же вида или даже того же сорта, что и оцениваемое растение. Контрольное растение может также быть нуль-зиготой (nullizygote) оцениваемого растения. "Контрольное растение" при использовании здесь относится не только к целым растениям, но также к частям растений, включая семена и части семян.

Гомолог(и)

"Гомологи" белка охватывают пептиды, олигопептиды, полипептиды, белки и ферменты, имеющие аминокислотные замены, делеции и/или вставки по сравнению с немодифицированным рассматриваемым белком и имеющие схожую биологическую и функциональную активность как у немодифицированного белка, из которого они были получены.

Делеция относится к удалению одной или более аминокислот из белка.

Вставка относится к одному или более аминокислотным остаткам, введенным в заранее определенный участок белка. Вставки могут содержать N-концевые и/или C-концевые слияния, а также вставки внутри последовательности одной или множества аминокислот. Как правило, вставки внутри аминокислотной последовательности могут быть меньше, чем N- или С-концевые слияния, порядка около 1-10 остатков. Примеры N- или С-концевых слитых белков или пептидов включают связывающий домен или активирующий домен транскрипционного активатора, как использовано в системе дрожжевых двойных гибридов, белки оболочки фагов, (гистидин)-6-тэг, глутатион S-трансфераза-тэг, белок А, мальтоза-связывающий белок, дигидрофолатредуктазу, Tag·100 эпитоп, с-myc эпитоп, FLAG®-эпитоп, lacZ, CMP (кальмодулин-связывающий пептид), эпитоп гемагглютинина (НА), эпитоп белка С и эпитоп вируса везикулярного стоматита (VSV).

Замена относится к замещению аминокислот белка другими аминокислотами, имеющими схожие свойства (такие, как схожая гидрофобность, гидрофильность, антигенность, предрасположенность образовывать или разрушать α-спиральные структуры или β-складчатые структуры). Аминокислотные замены представляют собой обычно единичные остатки, но могут быть сгруппированы в зависимости от функциональных ограничений, установленных для полипептида; вставки могут быть обычно порядка около 1-10 аминокислотных остатков. Аминокислотные замены являются предпочтительно консервативными аминокислотными заменами. Таблицы консервативных замен хорошо известны в данной области техники (см., например, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company (Eds) и Таблицу 1 ниже).

Таблица 1
Примеры консервативных аминокислотных замен
Остаток	Консервативные замены	Остаток	Консервативные замены
Ala	Ser	Leu	Ile; Val
Arg	Lys	Lys	Arg; Gln
Asn	Gln; His	Met	Leu; Ile
Asp	Glu	Phe	Met; Leu; Tyr
Gln	Asn	Ser	Thr; Gly
Cys	Ser	Thr	Ser; Val
Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp; Phe
His	Asn; Gln	Val	Ile; Leu
Ile	Leu, Val

Аминокислотные замены, делеции и/или вставки могут быть легко сделаны при использовании методов пептидного синтеза, хорошо известных в данной области техники, таких как твердофазный пептидный синтез и т.п., или путем манипуляции с рекомбинантными ДНК. Способы манипуляции с последовательностями ДНК для получения вариантов белка с заменами, вставками или делециями хорошо известны в данной области техники. Например, методы получения мутаций в виде замен в заранее определенных участках ДНК хорошо известны специалистам в данной области техники и включают М13-мутагенез, T7-GEN in vitro мутагенез (USB, Cleveland, ОН), QuickChange сайт-направленный мутагенез (Stratagene, San Diego, СА), ПЦР-опосредованный сайт-направленный мутагенез или другие протоколы сайт-направленного мутагенеза.

Производные

"Производные" включают пептиды, олигопептиды, полипептиды, которые могут по сравнению с аминокислотной последовательностью встречающейся в природе формы белка, такого как рассматриваемый белок, содержать замены аминокислот не встречающимися в природе аминокислотными остатками или добавления не встречающихся в природе аминокислотных остатков. "Производные" белка также охватывают пептиды, олигопептиды, полипептиды, которые содержат встречающиеся в природе измененные (гликозилированные, ацилированные, пренилированные, фосфорилированные, миристоилированные, сульфатированные и т.д.) или не встречающиеся в природе измененные аминокислотные остатки по сравнению с аминокислотной последовательностью встречающейся в природе формы полипептида. Производное может также содержать один(одно) или более аминокислотных заместителей или добавлений по сравнению с аминокислотной последовательностью, из которой оно получено, например репортерную молекулу или другой лиганд, ковалентно или нековалентно связанные с аминокислотной последовательностью, такие как репортерная молекула, которая присоединяется для облегчения ее обнаружения, и не встречающиеся в природе аминокислотные остатки по сравнению с аминокислотной последовательностью встречающегося в природе белка.

Кроме того, «производные» также включают слияния встречающейся в природе формы белка с пептидами для мечения, такими как FLAG, HIS6 или тиоредоксин (что касается обзора по