Фармацевтический состав для лечения заболеваний, связанных с эндотелиальной дисфункцией

Фармацевтический состав для лечения заболеваний, связанных с эндотелиальной дисфункцией

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к медицине, конкретно к созданию средств нового поколения на основе открытых или синтезированных химических молекул с биологической и фармакологической активностью, используемых в качестве средств этиотропной, патогенетической и симптоматической терапии.

Сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания часто основаны на многочисленных "порочных кругах", являются аутокаталитическими и обусловливают развитие клинических проявлений развития системного воспаления и эндотоксикоза у больных. И хотя точный механизм и последовательность событий в формировании нарушений функции органов до сих пор не определен, развитие гипоксически/ишемических процессов, повышение иммуновоспалительной активности и вторичного воспаления играет важную роль в развитие универсального механизма патогенеза атеросклероза, артериальной гипертонии, сахарного диабета и др. эндотелиальной дисфункции. Барьерная роль эндотелия сосудов как активного органа определяет его главную роль в организме человека: поддержание гомеостаза путем регуляции равновесного состояния противоположных процессов - а) тонуса сосудов (вазодилатация/вазоконстрикция); б) анатомического строения сосудов (синтез/ингибирование факторов пролиферации); в) гемостаза (синтез и ингибирование факторов фибринолиза и агрегации тромбоцитов); г) местного воспаления (выработка про- и противовоспалительных факторов).

Необходимо заметить, что каждая из четырех функций эндотелия, определяющая тромбогенность сосудистой стенки, воспалительные изменения, вазореактивность и стабильность атеросклеротической бляшки, напрямую или косвенно связана с развитием, прогрессированием атеросклероза, артериальной гипертензии и ее осложнений [8-10]. Таким образом, деремоделирование эндотелия, включающее в себя восстанолвения его структурных и функциональных изменений и гомеостаза синтезируемых в нем биологически активных веществ, под воздействием фармакологических средств играет важнейшую роль в целенаправленной (таргетной) терапии сердечно-сосудистых заболеваний, цереброваскулярных и многих других заболеваниях гипоксически/ишемически-реперфузионного генеза. Развивается концепция об эндотелии как о мишени для профилактики и лечения патологических процессов, приводящих или реализующих сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания.. Более того представление об атеросклерозе, как о своеобразном макрофаг-зависимом гранулематозном воспалении с нарушениями липидного обмена и повышенным в далеко-зашедших стадиях, тромбообразованием позволяет выделить "атерогенные" мишени/эффекты эндотоксина, включают повреждение эндотелия, индукцию формирования пенистых и пенисто-подобных клеток из макрофагов, тромбогенные эффекты и пр. Тканевая дизоксия служит базой для формирования аномального механизма экстракции кислорода периферическими тканями. Происходит это за счет недостаточной десатурации поступающего в капилляры гемоглобина. При этом системный выброс цитокинов, катехоламинов, ангиотензина II, простагландинов - способствует формированию тканевого шунта со снижением перфузии. Адаптативное высвобождение эндотелина-1 эндотелием на начальной стадии развития эндотелиальной дисфункции является триггером высвобождения пуриновых нуклеотидов, которые через взаимодействие с пуриновыми A1, A2 и A3 рецепторами, оказывают экзогенный защитный эффект. Однако увеличение длительности ишемии ведет к истощению пула пуриновых нуклеотидов и преобладанию вазоконстрикторного эффекта эндотелина-1. особое значение при этом отводится инозину (лиганд аденозиновых рецепторов A3 и А2А), способному оказывать инотропный, вазодилатирующий и противоспалительный эффект [Hasko G, Kuhel DG, Nemeth ZH, et al. Inosine inhibits inflammatory cytokine production by a posttranscriptional mechanism and protects against endotoxin-induved shock. J Immunol 2000, 164:1013-1019.]. Оказалось, что пурины, в частности, инозин, но не аденозин, ингибируют гиперактивацию поли-АДФ-рибозы полимеразы в ядре, и таким образом, регулируют процессы клеточной гибели, выраженность процессов ишемически-реперфузионных поражений, поражения эндотелия [Veres G., Radovits Т., SeresL. Effects of inosine on reperfusion injury after cardiopulmonary bypass. J. Cardiothoracic Surgery. 2010, 5:106-112.]. Другим регулятором метаболических процессов является система, связанная с G-белок сопряженным рецептором, в частности с подтипом GPR91, который является структурным гомологом P2Y1 пуринергических рецепторов, модулируемых сукцинатом [Не W, Miao FJ, Lin DC, Schwandner RT, Wang Z, Gao J, Chen JL, Tian H, Ling L. Citric acid cycle intermediates as ligands for orphan G-protein-coupled receptors. Nature. 2004;429:188-93]. Это позволило предположить, возможный синергизм в действие сукцинат-содержащих препаратов и инозина в деремоделировании эндотелия при различных поражениях сосудов. Кроме того, основываясь на данных об активном иммуномодулирующем действии инозина (стимулирует активность иммунокомпенентных клеток (моноцитов, макрофагов и NK-клеток) появилась возможность усиления противоспалительного эффекта сукцинатсодержащих производных метилпиридинов.

Из анализа приведенных выше информационных материалов закономерно формулируется цель настоящего изобретения, а именно: создание безопасных (повышение широты терапевтического действия), лекарственных средств на основе сукцинат содержащих производных метилпиридинов, в том числе фармацевтически приемлемых солей, для лечения заболеваний связанных с эндотелиальной дисфункцией, напряженности иммунной системы и снижением собственных детоксицирующих свойств.

Согласно изобретению предлагается способ воздействия на инфекционные агенты (в том числе внутриклеточно локализованные) и/или стимуляции Т-клеточного и гуморального противоинфекционного иммунитета наряду с обеспечением цитопротекторных и антигипоксических эффектов, заключающийся во введении в организм млекопитающих эффективного количества сукцинат-содержащих производных метилпиридина с нуклеотидами пуриновой природы.

В медицине известна субстанция, обладающая антигипоксической активностью, используется 3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридина сукцинат (патент РФ 2995350 - прототип). Данные экспериментов показывают, что в условиях острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) заявляемое соединение проявляет свойства сильного антигипоксанта, увеличивающего продолжительность жизни животных на высоте 11000 м в 2-9раза для низкоустойчивых (НУ) животных и в 2-4 раза для высокоустойчивых (ВУ) крыс. Максимальное антигипоксическое действие заявляемое соединение оказывает в дозе 40 мг/кг, с увеличением дозы эффективность антигипоксического действия снижается. Заявляемое соединение в 2-4 раза превосходит по антигипоксической активности препарат гамма оксимасляная кислота (ГОМК), используемый в дозе в 7 раз более высокой, чем эффективная доза для заявляемого соединения. Кроме того, антигипоксическое действие заявляемого соединения проявляется как на НУ, так и на ВУ животных в отличие от эталонного антигипоксанта ГОМК, который в условиях ОГБГ увеличивает продолжительность жизни только НУ крыс.Структурный аналог заявляемого соединения мексидол в аналогичных экспериментальных условиях не проявляет антигипоксических свойств как на НУ, так и на ВУ животных.

Однако, 3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридин сукцинат более токсичен, чем мексидол и ГОМК. При внутривенном введение мышам его ЛД₅₀ составляет 97,94 (91,13-105,3) мг/кг для самок и 109,0 (97,0-121,0) для самцов. При внутрибрюшинном введении ЛД₅₀ составляет 146,4 (135,0-157,0) мг/кг - для самок и 159,7 (149,2-169,5) мг/кг для самцов. При пероралыюм введении для самок ЛД₅₀ составляет 189,7 (161,0-224,0) мг/кг и для самцов - 197,7 (190,2-204,5) мг/кг, а при введении крысам: внутрибрюшинно - ЛД₅₀ составляет 146,8 (124,2-173,5) мг/кг, перорально - для самок ЛД5о составляет 181,7 (154,6-213,5) мг/кг и для самцов 189,5 (168,1-213,7) мг/кг.

Уровень техники.

Описаны производные изоксазола следующей общей формулы I, где R¹ представляет атом водорода; атом галоида; алкильную группу; алкоксигруппу; гидроксильную группу; алкилтиогруппу; аминогруппу; алкиламиногруппу; алканоилоксигруппу; алкоксикарбонильную группу; карбоксигруппу; карбамоильную группу; нитрогруппу; или цианогруппу, как соединения обладающие ингибирующей моноаминоксидазу активностью и противоспалительной активностью (патент РФ 2140414).

Известно изобретение, представляющее собой соли 1,3-диалкил-4,5-бис(необязательно N-замещенный карбамоил)имидазолия, которое используется для стимуляции процессов заживления и ослабления воспаления (патент РФ № ЕАПО / Евразийский сервер публикаций / Патент №008173).

На моделях циклофосфамидной иммунодепрессии и липополисахаридного иммунного стресса были изучены психоиммуномодулирующие свойства нового производного фенотропила - сукцината фенотропила - при внутрибрюшинном введении различным курсом (от однократного до 7-ми дневного) в разных дозах (25 мг/кг, 50 мг/кг и 100 мг/кг). Установлено, что изучаемое вещество проявляет способность устранять нарушения со стороны различных звеньев иммунной системы [Тюренков И.Н., Магомедов М.М., Теплый Д.Л., и соавт. Медицинская иммунология, 2011. - N 1. - C.55-60].

Согласно изобретению предлагается способ воздействия на инфекционные агенты (в том числе внутриклеточно локализованные) и/или стимуляции Т-клеточного и гуморального противоинфекционного иммунитета наряду с обеспечением цитопротекторных и антигипоксических эффектов, заключающийся во введении в организм млекопитающих эффективного количества сукцинат содержащих производных 6-метилпиридина с нуклеотидами пуриновой природы.

В медицине известна субстанция, обладающая антигипоксической активностью, используется 3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридина сукцинат (патент РФ 2995350 - прототип). Данные экспериментов показывают, что в условиях острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) заявляемое соединение проявляет свойства сильного антигипоксанта, увеличивающего продолжительность жизни животных на высоте 11000 м в 2-9раза для низкоустойчивых (НУ) животных и в 2-4 раза для высокоустойчивых (ВУ) крыс.Максимальное антигипоксическое действие заявляемое соединение оказывает в дозе 40 мг/кг, с увеличением дозы эффективность антигипоксического действия снижается. Заявляемое соединение в 2-4 раза превосходит по антигипоксической активности препарат гамма оксимасляная кислота (ГОМК), используемый в дозе в 7 раз более высокой, чем эффективная доза для заявляемого соединения. Кроме того, антигипоксическое действие заявляемого соединения проявляется как на НУ, так и на ВУ животных в отличие от эталонного антигипоксанта ГОМК, который в условиях ОГБГ увеличивает продолжительность жизни только НУ крыс. Структурный аналог заявляемого соединения мексидол в аналогичных экспериментальных условиях не проявляет антигипоксических свойств как на НУ, так и на ВУ животных.

Однако, 3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридин сукцинат более токсичен, чем мексидол и ГОМК. При внутривенном введение мышам его ЛД₅₀ составляет 97,94 (91,13-105,3) мг/кг для самок и 109,0 (97,0-121,0) для самцов. При внутрибрюшинном введении ЛД₅₀ составляет 146,4 (135,0-157,0) мг/кг - для самок и 159,7 (149,2-169,5) мг/кг для самцов. При пероральном введении для самок ЛД₅₀ составляет 189,7 (161,0-224,0) мг/кг и для самцов - 197,7 (190,2-204,5) мг/кг, а при введении крысам: внутрибрюшинно - ЛД₅₀ составляет 146,8 (124,2-173,5) мг/кг, перорально - для самок ЛД₅₀ составляет 181,7 (154,6-213,5) мг/кг и для самцов 189,5 (168,1-213,7) мг/кг.

Показан механизм иммуномодулирующего действия инозина до конца не выяснен, но исходя из последних данных литературы, можно предположить, что этот препарат является специфически активным иммуномодулятором, стимулируют активность иммунокомпенентных клеток (моноцитов, макрофагов и NK-клеток) путем усиления их хемотаксиса и фагоцитоза, процессинга и презентации антигена, продукции интерферонов и интерлейкинов. Инозин относится к нетоксичным и безопасным продуктам пуринового ряда. Инозин является метаболическим активатором, поддерживающим способность мышечных клеток к сокращению и эритроцитов - к связыванию с кислородом, а также активность кровотока в коронарных сосудах. Известны свойства инозина стимулировать синтез нуклеотидов, усиливать активность некоторых энзимов цикла Кребса и уменьшать агрегационную способность тромбоцитов. Инозин ингибирует продукцию радикалов супероксида стимулированными нейтрофилами. В отличие от аденозина инозин химически более стоек, поэтому широко применяется в кардиологической практике в форме препаратов рибоксин и инозин-F. Благодаря указанным свойствам инозин можно использовать для лечения и профилактики острых и хронических вирусных инфекций, для ослабления повреждающего действия на организм радио- и химиотерапии. Согласно изобретению предлагается способ воздействия на инфекционные агенты (в том числе внутриклеточно локализованные) и/или стимуляции Т-клеточного и гуморального противоинфекционного иммунитета наряду с обеспечением цитопротекторных и антигипоксических эффектов, заключающийся во введении в организм млекопитающих эффективного количества сукцинат содержащих производных метилпиридина с нуклеотидами пуриновой природы.

Раскрытие изобретения.

Использование изобретения впервые позволит получить следующий технический результат: создать безопасную стабильную лекарственную форму сукцинат-содержащего производного метилпиридина, которая по фармакодинамической активности на эндотелиальную дисфункцию и токсикологическим свойствам значительно превосходит существующие аналоги (сравнение с прототипом 3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридин сукцинат). Впервые предлагается использовать инозин в качестве модулятора фармакологической активности биологически активных соединений, в частности производных метилпиридинов и их фармацевтически приемлемых солей, для повышения терапевтической эффективности и стабилизации состава химических молекул с известным биологическим действием и фармакологической активностью. В настоящее время создание новых высокоэффективных и безопасных лекарственных средств антигипоксического и цитопротекторного действия, которые могут применяться при лечении различных заболеваний в остром и подостром периодах для лечения эндотелиальной дисфункции имеет большое значение.

Заявленный фармацевтический состав имеет токсичность ниже, чем у производных метилпиридинов в отдельности. При этом заявленный фармацевтический состав позволяет достигать быстрой положительной динамики и обратное развитие эндотелиальной дисфункции и тем самым существенно снизить риск развития осложнений при острых ишемических поражениях мозга, миокарда, после хирургических операций, и цереброваскулярной недостаточности при различных заболеваниях, уменьшить дозировку и повысить эффективность применения сукцинат-содержащих производных метилпиридинов и их фармацевтически приемлемых солей, повысить защитные системы организма, купировать или способствовать удалению из организма медиаторов, которые вызывают осложнения или даже приводят к развитию полиорганной недостаточности.

Полученный терапевтический эффект является стойким, поскольку достигается путем одновременного сбалансированного воздействия на различные звенья и собственных защитных сил и детоксицирующих систем организма. Терапевтический эффект разработанного средства достигается в результате купирования сложного каскада субклеточно-молекулярных сдвигов, восстановления равновесия между интимными механизмами регуляции гомеостаза организма при различных заболеваниях.

Осуществление изобретения

Сущность изобретения состоит в создании фармацевтического состава, содержащего производное метилпиридина или его фармацевтически приемлемую соль - 1,0-6,0; пурин - 10,0-80,0 и вспомогательные вещества до получения стабильной формы -остальное. В качестве вспомогательных веществ в зависимости от лекарственной формы используются соединения, рекомендуемые к применению в качестве вспомогательных веществ Государственной Фармакопеи XI изд РФ, Европейской и Британскими Фармакопеями, содержание которых и способ введения в лекарственную форму описаны в пособиях «Вспомогательные вещества в технологии лекарственных форм». Большаков В.Н. 1991; Тихонов А.И. «Технология лекарств». 2002.

Фармацевтический состав характеризуется тем, что он дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтический состав характеризуется тем, что он выполнено в виде инъекционной лекарственной формы.

Фармацевтический состав характеризуется тем, что он находится в форме лиофилизата.

Фармацевтический состав характеризуется тем, что он выполнено в виде твердой лекарственной формы.

Фармацевтический состав характеризуется тем, что он выполнено в виде твердой капсулы.

Фармацевтический состав характеризуется тем, что он выполнено в виде суппозитория.

Использованные в формуле количественные соотношения компонентов, включенных в фармацевтический состав, отражают результат экспериментальных наблюдений, которые продемонстрировали, что выход за пределы представленных концентраций снижают синергическое действие ингредиентов и, как следствие, терапевтическую эффективность препарата.

Новый состав предлагается к выпуску в стеклянных или пластиковых флаконах или ампулах, содержащих прозрачную жидкость или лиофилизированный порошок белого цвета (в последнем случае возможна комплектация растворителем), или в виде кишечнорастворимых и подъязычных таблеток белого цвета, а также суппозиториев, при следующем составе компонентов на 1 флакон-ампулу или таблетку или суппозиторий.

Пример 1. В соответствие с технологическим процессом смеситель засыпают ингредиенты состава в следующих соотношениях из расчета на 100 мг, мг:

Сукцинат, содержащее производное метилпиридина - 5 мг,

инозин - 60 мг,

вспомогательные вещества, разрешенные к применению в фармпромышленности ссылка - 35 мг

затем тщательно перемешивают.

Пример 2. В смеситель засыпают ингредиенты лекарственного средства в следующих соотношениях, мг:

3-окси-6-метил-2-этилпиридина сукцинат - 5 мг,

инозин - 80 мг,

вспомогательные вещества - 15 мг

затем тщательно перемешивают.

Пример 3. В смеситель засыпают ингредиенты согласно технологической процедуре состава в следующих соотношениях, мг:

3-окси-6-метил-гидроксипиридина гидрохлорид - 2 мг,

инозин - 80,

вспомогательные вещества - остальное,

затем тщательно перемешивают.

Пример 4. В смеситель засыпают ингредиенты лекарственного средства в следующих соотношениях, мг:

3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридина сукцинат - 4 мг,

инозин - 80 мг,

вспомогательные вещества - 16 мг

Для приготовления инъекционной формы ингредиенты смешивают в необходимых соотношениях ингредиенты, смесь разводят в предварительно очищенной воде, используемой в фармацевтической промышленности, добавляют вспомогательные вещества, пропускают через миллипоровые фильтры диаметром 22 мкм и далее разливают в ампулы или флаконы и проверяют на герметичность и стерильность. Возможен вариант лиофилизированной инъекционной формы (более стабильной), в этом случае препарат, разлитый в ампулы или флаконы, высушивают в специальных лиофильных сушках при низких температурах [Азаренко Ю.Н. «Жидкие лекарственные формы». 2000; Милованова Л.Н. и др. «Технология изготовления лекарственных форм». 2002].

Для приготовления лекарственного средства в виде твердой дозированной лекарственной формы, в частности кишечнорастворимых таблеток, приготовленную смесь прессуют в таблетки и покрывают желудочно-резистентной оболочкой (кишечнорастворимые таблетки), или прессованием гранул и частиц, предварительно покрытых желудочно-резистентной оболочкой или прессованием лекарственных веществ в смеси с желудочно-резистентным наполнителем (дурулы). При изготовлении таблеток для использования в полости рта делают непокрытые таблетки, полученные по специальной технологии с целью высвобождения лекарственного вещества или веществ в полости рта и обеспечения местного или общерезорбтивного действия (таблетки защечные, сублингвальные и др.). Возможно изготовление таблетированных форм с модифицированным высвобождением покрытые или непокрытые таблетки, содержащие специальные вспомогательные вещества или полученные по особой технологии, что позволяет программировать скорость или место высвобождения лекарственного вещества.

В технологии изготовления используют вспомогательные вещества, разрешенные Фармакопеей СССР XI издания, предпочтительнее использовать технологии предварительного гранулирования ингридиентов (влажного гранулирования) при изготовлении лекарственной формы. При приготовлении лекарственного средства в форме суппозиториев (твердая дозированная лекарственная форма, состоящая из основы и лекарственных веществ, расплавляющаяся (растворяющаяся, распадающаяся) при температуре тела) используются основы, предусмотренные Фармакопеей СССР XI издания. Технологический процесс осуществляют в асептических условиях с выполнением контрольных исследований качества готовой лекарственной формы. Предлагаемое средство независимо от формы выпуска обладает высокой стабильностью [Тихонов А.И. «Технология лекарств». 2002].

Пример 5. Поражение эндотелия исследовали при артериальной гипертензии у нормотензивных крыс. Артериальную гипертензию воспроизводили путем операции под наркозом. Вскрывали брюшную полость, обнажали участок аорты с отходящими от нее артериями почек и накладывали титановое спиралевидное кольцо, суживающее просвет аорты на 2/3 диаметра. Артериальное давление измеряли путем использования датчика с резиновой манжеткой на хвосте животного. Сигнал от датчика регистрировали на мингографе ЕМТ-118. животных подвергали эвтаназии на 15, 20 и 35 сутки после операции.

Таблица 1
Динамика изменения содержания эндотелина-1 и эндотелиального сосудистого фактора роста при артериальной гипертензии под воздействием различных средств
Соединение	Контроль (интактное животное)	Артериальная гипертензия
контроль	+ Инозин	+ 3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридина сукцинат, 6 мг	Фармацевтический состав (3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридина сукцинат - 6 мг, инозин - 80 мг)
Эндотелий-1, пкг/мг	0,4±0,1	3,9±0,1*	2,8±0,1*	3,0±0,2*	1,7±0,1#
СЭФР, пкг/мл	54±4	30±5*	50±4#	45±4#	68±4#
Фактор некроза опухоли - α (ФНО-α), пкг/мл	6,1±0,2	12,1±0,2*	9,2±0,3*#	10,4±0,5*#	6,5±0,2*#
Примечание: сравнение с контролем (интактные животные) - *, с контролем (артериальная гипертензия) -#, - достоверность различий средних, Р<0,01

Таблица 1а
Динамика изменения содержания эндотелина-1 и эндотелиального сосудистого фактора роста при артериальной гипертензии под воздействием различных средств в различных дозах (продолжение).
Соединение	Контроль (интактное животное)	Артериальная гипертензия
+ 2-метил 6-этилпиридин, 1,0 мг	+2-метил 6-этилпиридин, 1,0 мг + инозин 40 мг	+3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридина сукцинат, 2,0 мг	Фармацевтический состав (3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридина сукцинат - 2 мг, инозин - 40 мг)
Эндотелин-1, пкг/мг	0,4±0,1	2,9±0,2*	1,3±0,2*	2,0±0,3*	1,5±0,1#
СЭФР, пкг/мл	54±4	33±3*	44±3#	49±4#	66±2#
Фактор некроза опухоли - α (ФНО-α), пкг/мл	6,1±0,2	8,9±0,1*	6,9±0,3*#	7,1±0,4*#	5,8±0,3#

Как показали исследования фармацевтическая композиция 3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридина сукцината и пурина - инозина, позволяет достигать стойкого снижения уровня эндотелина-1 в крови и повышать активность эндотелиального фактора роста. Описанные положительные изменения факторов состояния эндотелия тесно связаны со снижением маркера воспалительного ответа, провоспалительного цитокина - фактор некроза опухоли - α (ФНО-α). Положительный терапевтический эффект комбинации значительно превосходит эффект как оптимальной дозы инозина (пурина), так и только 3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридина сукцината. Полученные данные подтверждают прямое действие разработанного средства на функциональную активность эндотелия.

Пример 6. Поражение эндотелия исследовали на экспериментальной модели сахарного диабета II типа у крыс-самцов (масса 200-250 г), воспроизведенном введением стрептозотоцина (50 мг/кг веса внутрибрюшинно однократно в 1 мл 0,9% раствора NaCl). После введения стрептозотоцина на 10-ые сутки животным 1-й опытной группы вводили состав, приготовленный в соответствие с примером 2, 2-й опытной группы вводили состав, приготовленный в соответствие с примером 3, 3-ей опытной группы вводили состав, приготовленный в соответствие с примером 4, внутримышечно (растворенные в 1 мл 0,9% раствора NaCl на 1 животное) ежедневно в течение 10 сут. Крысы 1-ой контрольной группы после введения стрептозотоцина по аналогичной схеме получали инъекции 0,9% раствора NaCl, 2-ой контрольной группы - вводили 3-окси-6-метил-2-этилпиридина сукцинат - 5 мг (растворенный в 1 мл 0,9% раствора NaCl на 1 животное), 3-ей контрольной группы - 3-окси-6-метил-гидроксипиридина гидрохлорид - 2 мг (растворенный в 1 мл 0,9% раствора NaCl на 1 животное). Группой сравнения служили пркатически здоровые интактные животные. Каждая группа состояла из 20 животных. Определение глюкозы крови проводили натощак (корм убирали за 14 час) на 10 и 30-е сут после введения стрептозотоцина. Исследование влияния фармацевтического состава на уровень глюкозы натощак, инсулина, содержание эндотелина 1 и СЭФР проводили на 10-ые и 30-е сутки после введения стрептозотоцина.

Таблица 2
Динамика изменения содержания эндотелина-1 и сосудистого эндотелиального фактора роста при стрептозотоциновом сахарном диабете под воздействием различных средств
Соединение	Показатели
Глюкоза, моль/л	Инсулин, мкМЕ/мл	Эндотелии-1, пкг/мг	СЭФР, пкг/мл
Интактные	4,2±0,4	24,0±2,5	1,2±0,2	54±4
Контрольная группа 1	8,5±0,5*	5,0±0,8*	3,5±0,4	62±4
10,2±0,5*	2,3±0,3*	6,8±0,8*	25±8*
Контрольная группа 2	8,9±0,4*	5,3±0,5*	3,2±0,3	64±5
9,6±0,5*	5,3±0,3*	5,6±0,5*	35±7*
Контрольная группа 3	8,6±0,4*	5,0±0,3*	3,4±0,4	69±3
9,1±0,2*	6,2±0,3*#	5,4±0,2*#	39±2*#
Опытная группа 1	9,1±0,4*	4,2±0,3*#	4,3±0,5*#	65±4*#
7,1±0,4*#	7,8±0,4*#	3,3±0,3*#	66±5*#
Опытная группа 2	9,1±0,4*	4,2±0,3*#	4,3±0,5*#	68±4*#
6,6±0,4*	12,0±0,9*	3,0±0,2	72±4*#
Опытная группа 3	9,0±0,4*	4,1±0,3*#	3,9±0,5*#	65±5*#
9,1±0,4*	4,2±0,3*#	2,3±0,5*#	78±4*#
Примечание: в первой строке каждой группы приводятся показатели на 10 сутки после введение стрептозотоцина (до лечения), во второй на 30-ые сутки после введения стрептозотоцина и 20-ти дневного курса лечения. Сравнение с контролем (интактные животные) - *, с контролем (сахарный диабет без лечения, контрольная группа 1) -#, - достоверность различий средних, Р<0,01

Как показали исследования фармацевтические композиции на основе производных метилпиридина или его фармацевтически приемлемых солей и пурина, позволяет достигать стойкого снижения уровня эндотелина-1 в крови и повышать активность эндотелиального фактора роста и по всем показателям превосходят действие производных метилпиридина в отдельности. Полученные данные подтверждают прямое действие разработанного лекарственного средства на функциональную активность эндотелия.

Пример 7. Изучение действия разработанного фармацевтического состава проводили на модели экспериментального атеросклероза у кроликов в соответствии с требованиями Фармакологического комитета МЗ РФ [Методические рекомендации по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ. М., 2000: 224-227]. Моделирование алиментарного атеросклероза у кроликов сопровождалось созданием мощной дислипидемии в крови и значительным накоплением липидов в органах: печени, надпочечниках и аорте. Так, уровень общего холестрина (ХС) вырос в 40 раз, триглицеридов - в 15 раз, при этом в 3,6 раза снижалась концентрация ХС антиатерогенных липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) в сыворотке крови по сравнению с интактными животными. В аортах контрольных кроликов произошло многократное увеличение ХС и степени поражения аорты, что при визуальной оценке и анализе с помощью морфометрического исследования выражалось в значительном количестве атеросклеротических поражений как многослойного, так и диффузного характера.

В условиях развившейся дислипидемии и атеросклерза введение фармацевтического состава, полученного в соответствие с примером 3 способствовало улучшению липидного профиля крови (ХС сыворотки крови снизился в 1,5 раза, а показатель величины ХС ЛПВП повысился в 2 раза). Содержание эндотелина 1 в гомогенатах аорты снизилось с 7,8±1,1 пкг/мл до 3,1±0,5 (р<0,001) на фоне 10-ти дневного внутрибрюшинного введения фармацевтического состава. Тогда как, под влиянием только 3-окси-6-метил-гидроксипиридина гидрохлорид (2 мг, растворенного в 0,9% NaCl), также вводимого внутрибрюшинно в течение 10-ти дней не привело к существенному снижению уровня эндотелина 1 в гомогенатах аорты (7,1±0,6 пкг/мл).

Пример 8. Экспериментальные исследования выполнены на 60 белых беспородных крысах-самках массой 150-180 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария по 10 особей в клетке. Рацион крыс состоял из стандартного гранулированного корма, который они получали 1 раз в сутки. За 24 часа до эксперимента кормление животных, находившихся на свободном водном режиме, прекращали. Расчет ЛД₅₀ производился с использованием экспресс метода по В.Б. Прозоровскому [Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективности дозы и ее ошибки // Фармакология и токсикология, 1978, - с.497-502]. Объекты исследования вводили в фиксированное, время; суток. В контрольных;

опытах животным вводили физиологический раствор, объем, которого был эквивалентным количеству, вводимому в опытных группах. Исследования проведены при внутрибрюшинном введении препаратов, контрольной группе вводилось плацебо в виде 0,9% раствора NaCl.

Таблица 3
Сравнительная оценка полулетальных доз (мг/кг) водных растворов производных метилпиридинов и их фармацевтически приемлемых солей для различных соединений и фармацевтического состава, определенных на крысах самцах при внутрибрюшинном введении
Соединение или фармацевтический состав	ЛД50, мг
3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридин сукцинат	109,5
2-этил-6-метил-3-гидроксипиридинасукцинат	808,7
2-метил-6-этилпиридин	1296
3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридин сукцинат+инозин	656,9
2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат+инозин (6 мг+80 мг+вспомогательные вещества до 100 мг)	1000,1
3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридин сукцинат+аденозин (6 мг+80 мг+вспомогательные вещества до 100 мг)	433,4
3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридин сукцинат+гипоксантин (6 мг+80 мг+вспомогательные вещества до 100 мг)	500,1
Примечание: Токсичность и класс опасности - соответственно, способность препарата вызывать отравление и степень этой способности. По степени токсичности вещества делятся на 4 класса опасности. Первый: сильнодействующие ядовитые вещества, ЛД50 менее 1 мг препарата на 1 кг массы тела. Второй: высокотоксичные вещества с ЛД50 до 200 мг/кг. Третий: среднетоксичные вещества с ЛД50 от 200 до 1000 мг/кг. Четвертый: малотоксичные вещества с ЛД50 более 1000 мг/кг.

Таким образом, как следует из таблицы, настоящее изобретение позволяет значительно снизить токсичность 3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридин сукцината и тем самым расширить показания к его терапевтическому применению, происходит переход из второго класса опасности в третий класс опасности по токсичности. Это имеет большое значение, поскольку, например, по антигипоксическому эффекту 3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридин сукцинат значительно превосходит 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат, однако уступал ему по терапевтическому диаозону безопасного применения.

Пример 9. Проведено изучение стабильности препаратов методом «ускоренного старения». Образцы препаратов закладывали на хранение при температуре 55°С.

Таблица 4
Результаты анализа старения водных растворов различных производных метилпиридинов и их фармацевтически приемлемых солей для внутривенного и внутримышечного введения методом «ускоренного старения» при 55°С
№	Лекарственная форма	Срок хранения при 55°С	Эквивал. срок хранения в усл.ед.	Описание	Цветность	Примечание
1	3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридин сукцинат 20 г + натрия хлорида 5 г растворенные в 1 л воды для инъекций	46	1 год	Прозрачная	Бесцветная	Кол-во субстанции ниже нижней границы в ампуле
суток	3 года	Бесцветная
138
276	5 лет	Прозрачная	Бесцветная
		Бесцветная
2	Лиофилизат 3-(N,N-диметилкарбамоилокси)-2-этил-6-метилпиридин сукцинат + инозин + натрия хлорида (в соотношениях 2:80:18 мас.%)	46 суток	1 год	Прозрачный после растворения в воде для инъекций. Бесцветный	Бесцветная Бесцветная	Кол-во 3-(HN-диметилкар бамоилокси)-2-этил-6-метилпири-дин сукцината на средней границе нормы, количество инозина - средняя граница нормы в продолжение всего срока
138	3 года	Прозрачный после растворения в воде для инъекций. Бесцветный
276	5 лет	Прозрачный после растворения в воде для инъекций. Бесцветный

	3-окси-6-метил-2-этилпиридина сукцинат - 60 мг: 100 мл воды для инъекций	46 суток	1 год	Прозрачная Бесцветная	Бесцветная или выдерживает сравнение с эталоном 6б
		138	3 года	Прозрачная	Желтовато-зеленая жидкость превышает цветность эталона 6б и 6в
	Лиофилизат 3-окси-6-метил-2-этилпиридина сукцинат + инозин + вспомогательные вещества (в соотношениях 5:80:15) мас.%)	46 суток	1 год	Прозрачный после растворения в воде для инъекций Бесцветный
		276	5 лет	Прозрачный после растворения в воде для инъекций Бесцветный

Заявленное изобретение позволяет получить стабильный фармацевтический состав для лечения заболеваний, связанных с эндотелиальной дисфункцией, характеризующийся тем, что в качестве активного ингредиента содержит производное метилпиридина или его фармацевтически приемлемую соль, пурин и вспомогательные вещества, находится в виде стабильной лекарственной формы и по показателям фармакологической эффективности, безвредности и стабильности при хранении значительно превосходит существующие лекарственные средства.

1. Фармацевтический состав для лечения заболеваний, связанных с эндотелиальной дисфункцией, характеризующийся тем, что в качестве активного ингредиента содержит производное метилпиридина или его фармацевтически приемлемую соль, пурин и вспомогательные вещества, находится в виде стабильной лекарственной формы при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Производное метилпиридина	1,0-6,0
или его фармацевтически приемлемая соль
пурин	10,0-80,0
Вспомогательные вещества	Остальное

2. Фармацевтич