Вакцина ассоциированная против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная

Вакцина ассоциированная против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается получения и применения вакцины для профилактики респираторных заболеваний крупного рогатого скота (КРС) и особенно у новорожденных телят.

Заболевания органов дыхания у телят имеют широкое распространение и наносят значительный ущерб животноводству. По широте распространения, смертности, вынужденному убою и недополучению привесов они превалируют над всеми прочими заболеваниями. По данным многих исследователей до 80-100% телят в послеотъемный период подвержены респираторным заболеваниям (1, 2, 3).

Как правило, респираторные заболевания молодняка КРС протекают по типу смешанных инфекций. В патогенезе респираторной инфекции новорожденных телят основная роль принадлежит ассоциации возбудителей, таких как вирус парагриппа-3 (ПГ-3), инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и вирусной диареи (ВД).

Известно, что вирусы ПГ-3, ИРТ и ВД КРС относятся к возбудителям, которые оказывают прямое воздействие на респираторный тракт животного. При этом они имеют общие «клетки-мишени», в которых размножаются.

Чрезвычайно широкое распространение, тенденция вызывать длительную персистенцию, относительная устойчивость к воздействию разнообразных факторов обусловливают энзоотическое течение данных заболеваний в хозяйствах с неблагополучными условиями содержания и кормления.

Смешанные вирусные инфекции или осложненные вторичной бактериальной микрофлорой особенно тяжело протекают и представляют серьезную проблему в плане их диагностики, лечения и профилактики.

Вакцинация животных против указанных инфекционных болезней имеет основное значение в системе профилактики эпизоотии.

В арсенале биологической промышленности во всем мире имеется большое количество препаратов, предназначенных для специфической профилактики вирусных и смешанных инфекционных респираторных заболеваний КРС и телят. При определенных условиях применения все вакцины эффективны, но отличаются по дозировке, видовому антигенному составу, сочетанию биотипов, методу инактивации вируса, используемому адъюванту и типу культуры клеток.

Однако применение известных в настоящее время препаратов не всегда сопровождается положительным эффектом из-за низкой иммуногенной активности и наличия антигенных и иммунобиологических отличий между вакцинными штаммами вирусов, входящих в состав вакцин, и эпизоотическими штаммами возбудителей, циркулирующих на территории России и стран СНГ.

Стратегия борьбы с перечисленными заболеваниями КРС во многих странах, в том числе и в России, основывается прежде всего на применении вакцин живых или инактивированных как в виде моно-, так и ассоциированных препаратов (1, 2, 3).

В настоящее время живые вакцины широко испытаны с хорошими результатами, однако они имеют ряд недостатков. Иммунная реакция у животных при их введении не всегда стабильна и в ряде случаев вызывает осложнения после вакцинации: вакцина может вызвать повышенную реактогенность, иммуносупрессию, а иногда и гибель до 2% животных при вакцинации в зависимости от условий содержания и наличия коинфекций, проблемы воспроизводства, длительную персистенцию и выделение вакцинного вируса во внешнюю среду. Кроме того, применение живых вакцин, содержащих неинактивированные антигены вирусов ИРТ и ВД КРС, категорически противопоказано для стельных коров и новорожденных телят из-за возможности гомологичной рекомбинации вакцинного и полевого штаммов вируса, ведущей к обострению инфекции, абортам и гибели отдельных животных.

Для специфической профилактики указанных заболеваний широко используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные.

Известна ассоциированная вакцина против вирусной диареи - болезни слизистых (ВД-БС), рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма VDV-Oregon-C24 V (САРМ V -293) вируса ВД-БС КРС, из штамма ТМ-91 (САРМ V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (САРМ V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (САРМ 6233), 4804 (САРМ 6234) и 6304 (САРМ 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (4).

Известна ассоциированная вакцина против ИРТ, рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма IBR-BK-5-РТОВ-8 INRV №3760 вируса ИРТ КРС, из штамма ТМ-91 (САРМ V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (САРМ V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (САРМ 6234) и 6304 (САРМ 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (5).

Известна ассоциированная вакцина против ПГ-3, рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма PI-3/T₁/11 V-30 вируса ПГ-3 КРС, из штамма ТМ-91 (САРМ V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (САРМ V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (САРМ 6233), 4808 (САРМ 6234) и 6304 (САРМ 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (6).

Известна ассоциированная вакцина против ИРТ, ПГ-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной инфекции, рота- и коронавирусных заболеваний телят «КОМБОВАК» сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из 6 производственных штаммов вирусов: ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, респираторно-синцитиальной инфекции, рота- и коронавирусных заболеваний КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (7).

Известна ассоциированная вакцина против вирусных пневмогастроэнтеритов КРС и телят сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов В-25 и ТК-А вируса ИРТ КРС, из штаммов ВД-N и ВД-R вируса ВД-БС КРС, из штаммов В-19 и ПТК-45/86 вируса ПГ-3 КРС, из штаммов К-88 и РП-82 ротавируса КРС, из штаммов КВ-90 и К-22 коронавируса КРС и из штаммов РС-89 и РС-71 возбудителя респираторно-синцитиальной инфекции КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (8).

Наиболее близким аналогом является вакцина «ТРИВАК (ВИЭВ)» для профилактики ИРТ, ПГ-3 и вирусной диареи - болезни слизистых (ВД-БС) КРС, содержащая в качестве активного вещества смесь аттенуированных вирусов из штамма Herpes virus bovis «ТК-А(ВИЭВ)В-2» с активностью 4,5-6,5 lg ТЦД₅₀/см³, штамма Virus diarrhea - mucosal disease bovinum «BK-1(B-1)N28» с активностью 4,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³, штамма Paramyxovirus «ПТК-45/86» с активностью 5,0-7,0 lg ТЦД₅₀/см³ (9).

Общим существенным недостатком известных ассоциированных вакцин, в том числе вакцины-прототипа, предназначенных для профилактики массовых инфекционных респираторных заболеваний КРС различных половозрастных групп, является их недостаточно высокая эффективность вследствие:

1) неполноценности (неполноты) антигенного состава входящих в них ингредиентов и сложных взаимодействий антигенов, из которых они изготовлены;

2) невысокий титр инфекционной активности входящих в состав вакцин вирусных суспензий, в результате чего в прививной дозе не обеспечивается необходимое количество протективных антигенов против указанных болезней;

3) вакцинные штаммы, входящие в состав препаратов, не обеспечивают формирование иммунитета по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах;

4) низкой иммуногенной активности препаратов. Причиной указанного недостатка может быть использование для инактивации вирусов формалина, вызывающего деструктивные изменения вирусных белков.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении ассоциированной вакцины против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных различных половозрастных групп по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах на территории РФ.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин эмульсионных инактивированных против инфекционных болезней КРС, сопровождающихся поражением органов дыхания, а также в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности ассоциированной вакцины и создании напряженного и длительного иммунитета у привитых животных.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины ассоциированной против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вакцина содержит в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «ВГНКИ-4» (авторское наименование) вируса ПГ-3 КРС, из штамма «ВНИИЗЖ» (авторское наименование) вируса ИРТ КРС и из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» (авторское наименование) вируса ВД КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность в организме животного при введении ему целевого препарата, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективном соотношении. Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина ассоциированная против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионная инактивированная.

2. Активное вещество в виде смеси авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС и из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животного при введении ему целевого препарата.

3. Целевые добавки.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина ассоциированная против ПГ-3, ИРТ и ВД КРС эмульсионная инактивированная.

2. Активное вещество.

3. Целевые добавки.

По сравнению с вакциной-прототипом существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3, из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ и из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток сирийского хомячка (ВНК-21), в эффективном количестве.

3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД₅₀/см³ и гемагглютинирующей активностью не ниже 5,0 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (MDBK), в эффективном количестве.

5. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД₅₀/см³ и гемагглютинирующей активностью не ниже 5,0 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

6. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (Таурус-2), в эффективном количестве.

7. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД₅₀/см³ и гемагглютинирующей активностью не ниже 5,0 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

8. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

9. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток гонады козы (Ch-91), в эффективном количестве.

10. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Ch-91 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

11. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK, в эффективном количестве.

12. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

13. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (RBT), в эффективном количестве.

14. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

15. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

16. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2, в эффективном количестве.

17. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,65 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

18. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT, в эффективном количестве.

19. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,65 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

20. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки сайги (ПС), в эффективном количестве.

21. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ПС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,65 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

22. Из целевых добавок масляный адъювант.

23. Масляный адъювант в количестве 69,6 мас.%.

24. Из целевых добавок дополнительно адъювант сапонин.

25. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.

26. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3, из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ и из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученных в перевиваемых культурах клеток млекопитающих, и целевые добавки масляный адъювант и сапонин в соотношении, мас.%:

Авирулентный и очищенный антигенный материал
из штамма«ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС,
полученного в перевиваемой культуре клеток
млекопитающих, взятой из группы, содержащей
культуру клеток MDBK, культуру клеток ВНК-21
и культуру клеток Таурус-2 с инфекционной
активностью не менее 6,5 lg ТЦД50/см3 и
гемагглютинирующей активностью
не менее 5,0 log2 до инактивации	10,0
Авирулентный и очищенный антигенный материал
из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС,
полученного в перевиваемой культуре клеток
млекопитающих, взятой из группы, содержащей
культуру клеток MDBK, культуру клеток Ch-91
и культуру клеток RBT с инфекционной
активностью не менее 6,0 lg ТЦД50/см3 до
инактивации	10,0
Авирулентный и очищенный антигенный материал
из штамма«NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС,
полученного в перевиваемой культуре клеток
млекопитающих, взятой из группы, содержащей
культуру клеток Таурус-2, культуру клеток RBT
и культуру клеток ПС с инфекционной
активностью не менее 6,0 lg ТЦД50/см3 и
активностью в ИФА не менее 6,65 log2 до
инактивации	10,0
Масляный адъювант	69,6
Сапонин	0,4.

В результате проведенных исследований авторами установлено, что между антигенами, входящими в состав предлагаемой вакцины, отсутствует конкуренция. Авторами обнаружено также явление синергизма при соединении указанных антигенов в предлагаемой вакцине, что позволило снизить их количественное содержание в препарате при сохранении такой же напряженности и длительности иммунитета у вакцинированных животных, как и при использовании для иммунизации соответствующих монопрепаратов.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения производственного штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС, выделен из легких 2-3-месячных телят с респираторной патологией. Штамм «ВГНКИ-4» адаптирован к культуре клеток почек сирийского хомячка ВНК-21 и к культуре клеток теленка Таурус-1.

Штамм «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС депонирован 09 сентября 1999 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) под регистрационным наименованием «ВГНКИ-4» ДЕП.

Штамм «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (10).

Морфологические признаки

Штамм «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС относится к семейству Paramyxoviridae, роду Parainfluenza, подтипу Parainfluenza virus 3 и по своему строению является классическим парамиксовирусом. Внешне вирус почти сферический, но часто встречаются полиморфные формы. Размер сферических форм от 80 до 300 нм, но большинство вирионов в среднем от 130 до 140 нм.

Вирус ПГ-3 КРС штамма «ВГНКИ-4» имеет 7 структурных белков:

1. Фосфопротеиды (Р,. м.м. 83 кД).

2. ГА-нейраминидазный гликопротеин (HN, м.м. 69 кД).

3. Главный нуклеокапсидный протеин (NP, м.м. 66 кД).

4. Гликопротеин (F, м.м. 55 кД).

5. Матричный белок (М, м.м. 38 кД).

6. Белок L-полимераза (м.м. 180 кД).

7. Клеточный активный белок А (м.м. 43 кД).

В двухслойной содержащей липиды оболочке (толщина 10-И 5 нм) размещены 2 различные макромолекулы: гликопротеин гемагглютинин нейраминидаза (HN) и гликопротеин слияния (F). Оба выступают на 8 нм над оболочкой вириона с интервалом 7÷8 нм. Гемагглютинин осуществляет прикрепление вириона к рецепторам клетки-хозяина, содержащим нейраминовую (сиаловую) кислоту, а нейраминидаза разрушает рецепторы и тем самым помогает элюции вируса в процессе отпочковывания от клетки-хозяина. F-белок отвечает за проникновение вируса в клетку, осуществляя слияние с клеточной мембраной и неся ответственность за гемолиз, который происходит за счет точечного гидролиза молекулы неактивного предшественника F₀. Известна зависимость между структурой гликопротеидов и патогенностью вируса. У патогенных штаммов оба поверхностных гликопротеида в клетках ВНК-21 включаются в вирионы только в расщепленной форме. У апатогенных штаммов гликопротеид F включается в вирионы в виде предшественника F₀. Вирусы с нерасщепленными гликопротеидами обладают очень низкой биологической активностью, однако, если их обрабатывать трипсином, они проявляют полную биологическую активность. Белок F ответственен за гемолитическую активность и вирусиндуцируемый кариоцитоз. Посттрансляционное расщепление белка предшественника F₀ на F₁ и F₂ осуществляется клеточными ферментами.

Антигенные свойства

Штамм «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС агглютинирует эритроциты морской свинки, кролика, свиньи, коровы, мыши, овцы, козы, человека и белой мыши. Клетки, инфицированные вирусом ПГ-3 КРС из штамма «ВГНКИ-4», сорбируют эритроциты морской свинки, КРС, овцы, кролика и белой мыши. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител на 8÷14 сутки после ревакцинации, антитела достигают пика к 16÷28 дню и сохраняются до одного года. Продолжительность и напряженность поствакцинального иммунитета обеспечивается преимущественно IgG и секреторными IgA, выработка которых стимулируется активным вакцинальным процессом. Привитые телята с титром гуморальных антител от 6,0 до 10,3 log₂ устойчивы к заражению вирусом ПГ-3 КРС. Полевые изоляты вируса ПГ-3 КРС имеют близкое антигенное родство с вирусом ПГ-3 КРС штамма «ВГНКИ-4».

Генотаксономическая характеристика

Парамиксовирусы обычно состоят из одной молекулы однонитевой, линейной, спиральной РНК диаметром 15 нм, имеющей внутри полую сердцевину, модель которой напоминает колос. Молекулярный вес ее приблизительно 4,5×10⁶, что составляет примерно 5% веса вирусной частицы. Она содержит генетическую информацию для 6 структурных протеинов. Нуклеотидное секвенировние генома вируса ПГ-3 КРС показало, что он состоит из 15156 нуклеотидов.

Биотехнологические характеристики

Штамм «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС предназначен для приготовления живых и инактивированных вакцин против ПГ-3 КРС. Вирус штамма «ВГНКИ-4» ПГ-3 КРС репродуцируется в культурах клеток ПЭК, ПТ, MDBK, Таурус-2 и ВНК-21 и накапливается в титрах от 6,5 до 8,5 lg ТЦД₅₀/см³. Результаты адаптации вируса ПГ-3 КРС штамма «ВГНКИ-4» к культуре клеток ВНК-21 представлены в таблице 1. Штамм «ВГНКИ-4» является стабильным и безвредным.

Физические свойства

Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы находится в диапазоне 1,197 г/см³, коэффициент седиментации вирионной РНК составляет 42S.

Устойчивость к внешним факторам

Вирус ПГ-3 КРС штамма «ВГНКИ-4» быстро разрушается под действием высокой температуры. Возбудитель чувствителен к хлороформу, эфиру, формалину и детергентам.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток MDBK, ВНК-21, Таурус-2 в течение 10 серийных пассажей.

Патогенность - не патогенен для морских свинок, кроликов и белых мышей.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3 КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно культуры клеток ВНК-21, или Таурус-2, или MDBK. Полученный вируссодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса ПГ-3 используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ), который добавляют в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,10%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36÷37°С в течение 24 часов при значении рН 7,6÷7,8 с периодическим перемешиванием суспензии (каждые 5÷6 часов по 3÷5 минут). По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную до 2÷8°С суспензию антигена добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины используют авирулентный очищенный антигенный материал из штамма «ВГНКИ-4» вируса ПГ-3, полученного в культуре клеток ВНК-21, или Таурус-2, или MDBK с инфекционной активностью не менее 6,5 lg ТЦД₅₀/см³ и гемагглютинирующей активностью не менее 5,0 log₂ до инактивации, в количестве не менее 10,0 мас.%.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения производственного штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, выделен из патологического материала телят, павших с явлениями ИРТ во время вспышки заболевания в СПК «Миневское» Нижегородской области в 1998 году. Вакцинный штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС адаптирован к культурам клеток RBT, MDBK и Ch-91.

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС депонирован 12 марта 2001 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Государственного учреждения «Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (ВГНКИ) под регистрационным наименованием «ВНИИЗЖ-ДЕП».

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (11).

Морфологические свойства

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesviridae, роду Varicellavirus, группе HPV-1, обладает морфологическими признаками, характерными для данного семейства.

Штамм «ВНИИЗЖ» включает линейную 2-цепочечную ДНК с молекулярной массой 92÷102 кД. Вирионы округлой формы, состоят из 4-х структурных компонентов: нуклеоида, капсида диаметром 120÷150 нм, окруженного содержащей липиды оболочкой, мембраны (тегумента) и наружной оболочки. Нуклеоид тороидальной формы содержит ДНК и окружен икосаэдрическим капсидом диаметром 100-5-110 нм, содержащим 162 частично полых капсомера. Капсид окружает ядро вириона, состоящее из ДНК, покрытой белком. Мембрана из глобулярного материала окружает капсид. В составе вириона определено до 32 белков с молекулярной массой до 200 кД.

Вирионы имеют сложную четырехуровневую (от центра к периферии) организацию: нуклеоид, капсид, суперкапсидную структуру и оболочку. Наружная оболочка вирионов имеет типичное строение и содержит многочисленные выступы (шипы) длиной около 8 нм. Вирусы формируют характерные внутриядерные включения. При прохождении через внутренний листок ядерной мембраны в эндоплазматический ретикулум вирионы покрываются дополнительной оболочкой, содержащей гликопротеины и липиды.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС относится к группе 1 герпесвирусов КРС. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус обладает гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью), реагируя с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных вирусный антиген индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РИГА в разведении 1:16-5-1:256.

Генотаксономическая характеристика

Выделено и охарактеризовано 9 структурных белков вируса ИРТ штамма «ВНИИЗЖ»: VP 105, VP 90 (гемагглютинин), VP 74, VP 64, VP 54, VP 50, VP 47, VP 40 и VP 31. Гликопротеины g I, g III, g IV участвуют в формировании гуморального и клеточного иммунитета. Наиболее эффективным в этом отношении является g IV. По данным реакции нейтрализации наибольшей иммуногенностью обладают VP 90 и VP 74. Белок, маркированный как VP 8 с м.м. 96 кД, является одним из главных белков герпесвируса-1 КРС. Он участвует в модуляции экспрессии генов класса А, стимулирует пролиферацию Т-клеток и образование антител у телят как после заражения, так и после иммунизации животных очищенным белком. За индукцию вируснейтрализующих антител к герпесвирусу-1 КРС ответственны 4- оболочечные гликопротеины, главными из которых являются g 70 и g 97, расположенные в шипиках вириона. В структуре g IV вируса ИРТ идентифицированы 3 нейтрализующих домена. Домен 1 содержит 2 перекрывающих эпитопа, домен 2 - один эпитоп. Домен 1 имеет отношение к проникновению вируса в клетки-мишени.

Биотехнологические характеристики

Вирус ИРТ КРС штамма «ВНИИЗЖ» репродуцируется в культурах клеток MDBK, Ch-91 и RBT, вызывая цитопатическое действие (ЦПД), и в течение 48÷96 часов инкубирования накапливается в титрах от 6,0 до 8,0 lg ТЦД₅₀/см³. Результаты адаптации вируса ИРТ КРС штамма «ВНИИЗЖ» к культурам клеток Ch-91 и RBT представлены в таблицах 2 и 3. Штамм «ВНИИЗЖ» является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Физические свойства

Плавучая плотность вирионов в градиенте CsCl составляет 1,27÷1,29 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС устойчив к воздействию низких температур: при минус 60÷70°С вирус выживает 7÷9 месяцев, при 56°С вирус инактивируется через 20 минут, при 37°С - через 4÷10 суток, при 22°С - через 50 суток, при 4°С активность вируса снижается через 30÷40 суток лишь на 1,0 lg. Раствор формалина 1:500 инактивирует вирус через 24 часа. Ацетон, эфир, хлороформ и этиловый спирт инактивируют его немедленно. В кислой среде вирус быстро теряет свою активность, но длительно (до 9 месяцев) сохраняется при рН 6÷9 и в условиях 4°С. Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижают вирулентность и иммуногенность вируса. Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток MDBK, Ch-91 и RBT в течение 10 серийных пассажей.

Патогенность - не патогенен для морских свинок, кроликов и белых мышей.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно монослойные культуры клеток MDBK, Ch-91 и RBT, выращенные в 1,5 дм³ матрасах или вращающихся сосудах объемом 3 дм³. Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса ИРТ штамма «ВНИИЗЖ» используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,10%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36÷37°С в течение 24 часов при значении рН 7,6÷7,8 с периодическим перемешиванием суспензии (каждые 5÷6 часов по 3÷5 минут). По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную до 2÷8°С суспензию антигена добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины используют антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» вируса ИРТ КРС, полученного в культуре клеток Ch-91, или MDBK, или RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ до инактивации, в количестве не менее 10,0 мас.%.

Источником для получения производственного штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС послужил референсный штамм «NADL» вируса ВД КРС, полученный ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.08.2004 г. из коллекции типовых культур АТСС (США).

Производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных биологических системах культивирования.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» адаптирован к перевиваемой культуре клеток млекопитающих, выбранной из группы, содержащей монослойную перевиваемую культуру клеток почки сайги (ПС), монослойную перевиваемую культуру клеток почки теленка (Таурус-2) и монослойную перевиваемую культуру клеток почки теленка (RBT), имеет стабильные биологические свойства, которые позволяют использовать его в качестве производственной расплодки для получения антигенного материала для вакцины против ВД КРС эмульсионной инактивированной.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС депонирован 4 августа 2009 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» - ДЕП вируса диареи КРС (12).

По сравнению с исходным штаммом штамм «NADL-ВНИИЗЖ» имеет генетические и фенотипические особенности. В отличие от штамма «NADL» штамм «NADL-ВНИИЗЖ» репродуцируется в перевиваемых культурах клеток RBT, ПС и Таурус-2, обладает инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняет высокую антигенную и иммуногенную активность после инактивации.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС характеризуется следующими признаками и свойствами(12).

Морфологические признаки

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ВД КРС: сферический вирион диаметром 40÷60 нм состоит из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии, содержащего позитивную одноцепочечную РНК.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «NADL-ВНИИЗЖ» относится к первому генотипу.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Вирус реагирует с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных инактивированный вирус индуцирует образование вирусспецифических и вируснейтрализующих антител в организме морских свинок в титрах от 10,9 до 11,2 log₂ в ИФА и 7,0 log₂ в РМН, у кроликов - от 10,8 до 11,4 log₂ (ИФА) и от 6,0 до 7,1 log₂ (РМН), у телят и коров - от 10,2 до 10,7 log₂ (ИФА) и от 7,6±0,40 до 7,3±0,31 log₂ (РМН).

Генотаксономическая характеристика

Геном штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС представлен позитивной одноцепочечной РНК размером около 12500 нуклеотидов с единственной открытой рамкой считывания. Открытая рамка считывания начинается с 386 нуклеотида. Вся информация о протеинах содержится в одной рамке считывания.

Выделено и охарактеризовано 10 протеинов: 4 структурных и 6 неструктурных. Одноцепочечная РНК связана с капсидным протеином р14/С, окруженным наружными гликопротеинами (др25/Е1, др53/Е2, др48/Е0), и липидной оболочкой.

Наружный гликопротеин gp53/E2 индуцирует в организме животных выработку вируснейтрализующих антител в высоких титрах. Протеин др48/Е0 способен индуцировать у инфицированных животных высокий уровень антител, но с низкой вируснейтрализирующей активностью. У инфицированных животных антитела к gp25/Е1 вырабатываются в низких титрах.

Методом ОТ-ПЦР был амплифицирован участок генома вируса диареи КРС, включающий 149 н.о. 5'-нетранслируемой области.

В результате проведенных исследований было установлено, что штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС является близкородственным рефер