Способы и композиции для диагностики остеоартрита у животного семейства кошачьих

Способы и композиции для диагностики остеоартрита у животного семейства кошачьих

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к идентификации новых маркеров остеоартрита у животного семейства кошачьих и к способам диагностики, композициям и наборам, связанным с этим.

Уровень техники

Артрит, более конкретно, остеоартрит (OA), представляет собой дегенеративное поражение суставов, широко распространенное среди людей и домашних животных. OA включает в себя прогрессирующую дегенерацию суставного хряща с потерей протеогликана и коллагена и с пролиферацией новой кости, сопровождающуюся воспалительной реакцией внутри синовиальной мембраны. Это самая широко распространенная форма суставного и скелетно-мышечного заболевания, которому подвержены собаки, но кошки также могут страдать этим заболеванием.

OA животного семейства кошачьих представляет собой заболевание, которому, прежде всего, подвержены животные семейства кошачьих в возрасте 10 лет или старше. Для животных, страдающих этим заболеванием, характерна меньшая склонность к прыжкам, меньшая высота прыжков или полное прекращение прыжков, избегание подъема или спуска по ступеням и тенденция более редкого использования кошачьего туалета. Оказывается также, что кошки, страдающие OA, менее дружелюбны, демонстрируют изменения характера сна-пробуждения и могут также иметь проблемы, связанные с уходом за шерстью. Терапия OA у кошек подобна схемам лечения для других видов, такие схемы включают изменение окружающей среды, лечение ожирения, контролируемую умеренную физическую нагрузку, контролирование болевого состояния и хирургическое вмешательство.

Изменения окружающей среды начинаются с размещения чаш с едой и туалетов в таких местах, куда не требуется прыгать или подниматься по ступеням. Могут быть построены небольшие уклоны к местам кормления или туалета. Само животное может делать попытки уменьшения больших прыжков вверх или вниз, побуждения к умеренной физической нагрузке и создания окружающей среды, где кошка не сталкивается с полосой препятствий при поддержании распорядка дня. Изменение окружающей среды не замедляет прогрессирования заболевания.

На кошек с превышением веса, страдающих OA, может оказать благотворительное воздействие контроль за весом. Уменьшение веса тела смягчает давление и боль в пораженном(ых) суставе(ах). Хотя потеря веса у кошек с превышением веса или с ожирением может помочь смягчить боль, вызванную OA, она не прекращает прогрессирование заболевания.

Контроль боли у кошек является проблемным, так как схемы лечения лекарственными средствами, которые безвредны для других видов, необязательно безвредны для кошек. Хотя многие фармацевтические компании апробируют нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID) для лечения боли у кошек, аспирин представляет собой единственное средство NSAID, для которого установлена безвредная постоянная доза для кошек. Кортикостероиды использовали для смягчения боли и воспаления, но их использование может вызвать прогрессирование OA. NSAID может помочь смягчить боль, но не изменяет прогрессирование OA.

Нутрицевтики использовали для смягчения боли у кошек, ассоциированной с OA. Хондроитин сульфат и глюкозамин HCl, используемые в комбинации или по отдельности, использовали в качестве схемы лечения OA у кошек. Не существует опубликованных клинических исследований, которые бы указывали, что эти нутрицевтики изменяют прогрессирование OA. Недавние данные для людей указывают, что хондроитин и глюкозамин могут помочь смягчить боль у людей, страдающих тяжелой формой OA.

Способы, описанные выше, хотя и помогают в некотором отношении для обеспечения симптоматического ослабления, не являются достаточно успешными при терапии заболевания, поскольку они абсолютно не лечат лежащую в основе патологию. Действительно, необходимы не только улучшенные способы лечения, но также улучшенные способы для отслеживания клинического прогресса у животного, страдающего OA, а также для постановки диагноза животному, которое страдает OA, и для выявления тех животных, которые могут быть генетически предрасположены к развитию OA, но у которых еще не проявлены клинические признаки заболевания. В настоящее время для подтверждения диагноза OA у животного, должны проводиться экстенсивные рентгенографические тесты, и эти тесты применяются только для идентификации животных, у которых имеются очевидные повреждения суставов и ткани. Таким образом, существует необходимость создания простого диагностического теста для детектирования OA у животных семейства кошачьих, а также создания улучшенных способов отслеживания клинического прогресса животного, страдающего OA.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к идентификации новых биомаркеров для OA у животных семейства кошачьих, и к способам детектирования животных, страдающих артритом, на основе характерной модели экспрессии генов для этих ОА-биомаркеров in vivo. Конкретно, способы по изобретению включают детектирование дифференциальной экспрессии по сравнению с контрольным уровнем экспрессии, по меньшей мере, одного биомаркера в образце из организма, предпочтительно, в образце крови, где детектирование дифференциальной экспрессии указанного биомаркера конкретно идентифицирует животных, которые страдают OA. Таким образом, способ основан на детектировании, по меньшей мере, одного биомаркера, который дифференциально экспрессируется при OA по сравнению с клетками здоровых или контрольных животных.

Биомаркеры по изобретению представляют собой белки и/или нуклеиновые кислоты, которые дифференциально экспрессируется при OA у животных семейства кошачьих. В одном аспекте, биомаркеры, представляющие конкретный интерес, включают биомаркеры, перечисленные в настоящей заявке в таблицах 1-3.

Экспрессия биомаркера может оцениваться по уровню белка или нуклеиновой кислоты с использованием разнообразных методов. Таким образом, в другом аспекте, изобретение относится к способам, в которых применяются антитела для детектирования экспрессии OA-биомаркерных белков в образцах от животных семейства кошачьих. В этом аспекте изобретения используется, по меньшей мере, одно антитело, направленное к конкретному представляющему интерес OA-биомаркеру. В следующем аспекте, уровень экспрессии также может детектироваться с помощью методов на основе нуклеиновых кислот, включающих, например, гибридизацию, методы с использованием микрочипа и РВ-ПЦР, включая количественную реакцию РВ-ПЦР. Масс-спектрометрия, клеточный сортер с активацией флуоресценции (FACS), или метод с применением гранул Luminex Xmap® также может использоваться для детектирования уровня экспрессии одновременно на уровне белка и на уровне нуклеиновой кислоты.

В настоящей заявке дополнительно предполагается, что способы по настоящему изобретению могут использоваться в комбинации с традиционными методами диагностики, которые способны детектировать физические и морфологические характеристики дегенеративного поражения суставов. Таким образом, например, характеристика дифференциальной экспрессии генов для ОА-биомаркеров в клетках, полученных из образца крови животного, может комбинироваться с обычными методами диагностики (например, рентгенологическим методом) с целью подтверждения диагноза OA.

В следующем аспекте изобретение относится к композициям, включающим один или более зондов для нуклеиновой кислоты, которые специфически гибридизуются с нуклеиновой кислотой или ее фрагментом, кодирующими OA-биомаркер по настоящему изобретению.

В дополнительном аспекте, изобретение относится к композициям, включающим антитела, которые специфично связываются с полипептидом, кодируемым геном OA-биомаркера по настоящему изобретению.

Изобретение также относится к наборам реагентов для диагностики OA у животного семейства кошачьих, причем наборы реагентов включают компоненты, которые могут использоваться для детектирования экспрессии ОА-биомаркеров по настоящему изобретению, причем компоненты включают, но не ограничены ими, композиции и микрочипы, описанные в настоящей заявке.

Также в настоящей заявке предусмотрено, что настоящее изобретение относится к применению ОА-биомаркеров и композиций, раскрытых в настоящей заявке, в способах для диагностики OA у животного семейства кошачьих.

В другом аспекте, в настоящей заявке также предполагается, что изобретение относится к способам идентификации биоактивных пищевых компонентов или других природных соединений (обозначаемых ниже как "компоненты"), которые могут тестироваться на предмет способности лечить остеоартрит или улучшать состояние при остеоартрите у животного семейства кошачьих, причем способы включают: (а) контактирование клетки, способной экспрессировать РНК или белковый продукт одного или более ОА-биомаркеров, раскрытых в таблицах 1-3, с тестируемым компонентом; (b) определение количества указанных РНК и/или белкового продукта, продуцированными в клетках, контактировавших с тестируемым компонентом; и (с) сравнение количества указанных РНК и/или белкового продукта в клетках, контактировавших с тестируемым компонентом, с количеством тех же указанных РНК или белкового продукта, присутствующих в соответствующей контрольной клетке, которая не контактировала с тестируемым компонентом; где в случае если количество РНК или белкового продукта изменяется относительно количества к контроле, то компонент идентифицируют как компонент, который следует протестировать на предмет способности лечить остеоартрит или улучшать состояние при остеоартрите у животного семейства кошачьих.

Краткое описание фигур

На фиг.1 раскрыто относительное количество TGF-бета у здоровых и у страдающих артритом кошек, получающих различные типы питания. Что касается фиг.1 и 2-4, как указывается, "j/d" и "senior" обозначают типы питания, содержащие различные количества омега-3 жирных кислот, как раскрыто в патентах WO 2007/002837 A2 и WO 2006/074089 А2, соответственно.

На фиг.2 изображено относительное количество ИЛ-1 альфа у здоровых и страдающих артритом кошек с питанием j/d и senior.

На фиг.3 изображен уровень NTx у кошек, получающих питание с высоким содержанием ЕРА и DHA. Уровень детектируют с использованием обычных методов ELISA.

На фиг.4 изображен уровень CTX-II у кошек, получающих питание с высоким содержанием ЕРА и DHA. Уровень детектируют с использованием обычных методов ELISA.

В таблице 1 раскрыты OA-биомаркеры для животного семейства кошачьих, идентифицированные на основе критерия отбора, где величина p<0,001, и уровень экспрессии демонстрирует кратное изменение, составляющее >2. Что касается таблиц 1-3, а также тех, где среднее соотношение составляет>1, то ген подвергается апрегуляции при OA и уровень экспрессии приравнивается к позитивному кратному изменению. Напротив, там, где среднее соотношение составляет <1, ген подвергается даунрегуляции у животных, страдающих OA, и уровень экспрессии приравнивается к негативному кратному изменению.

В таблице 2 раскрыты ОА-биомаркеры животного семейства кошачьих, идентифицированные на основе критерия отбора, где величина p<0,001, и уровень экспрессии демонстрирует кратное изменение, составляющее>1,5.

В таблице 3 раскрыты ОА-биомаркеры животного семейства кошачьих, идентифицированные на основе анализа данных для животного семейства кошачьих с использованием количественного анализа РВ-ПЦР (qRT-PCR).

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении предлагаются композиции и способы для идентификации или диагностики остеоартрита у животных семейства кошачьих. Способы включают детектирование дифференциальной экспрессии конкретных биомаркеров, которые или селективно сверх-экспрессируются или экспрессируются на низком уровне при остеоартрите. Таким образом, биомаркеры по изобретению способны отличать животных, которые страдают OA от тех, которые не страдают этим заболеванием. Также в настоящей заявке предусмотрено, что возможно идентифицировать тех животных, которые могут быть предрасположены к развитию OA, или тех, которые страдают OA, но еще не проявляют морфологических или физических изменений. Указанные способы диагностики остеоартрита включают в себя детектирование дифференциальной экспрессии, по меньшей мере, одного биомаркера, который является показателем остеоартрита в образце ткани или в образце жидкости организма животного семейства кошачьих. В конкретных вариантах осуществления изобретения, для детектирования экспрессии представляющего интерес биомаркера используют антитела и методы иммуногистохимии или зонды для нуклеиновой кислоты и методы гибридизации. Дополнительно предлагаются наборы реагентов для практического осуществления способов по изобретению.

Подразумевается, что термин "диагностика остеоартрита" включает, например, диагностику или детектирование присутствия OA или генетической предрасположенности к этому заболеванию, отслеживание прогрессии заболевания и эффективности терапевтического воздействия, а также идентификацию или детектирование клеток или образцов, которые являются показателями остеоартрита. Термины диагностики, детектирования и идентификации остеоартрита используются в настоящей заявке взаимозаменяемо. Подразумевается, что с помощью термина "остеоартрит" обозначают такие заболевания, которые характеризуются дегенерацией суставного хряща на концах кости, которые образуют поверхность суставов и которые могут включать на поздних стадиях сопровождающиеся изменения в окружающей ткани, например, в кости, мышце, связках, мениске и синовиальной мембране. Такие физические изменения проявляются болью, опухолью, слабостью и потерей суставной функции.

OA классифицировали по различным степеням и стадиям. Стадия 1 характеризуется изменениями в метаболизме хондроцитов, такими что происходит увеличение количества ферментов, разрушающих хрящевой матрикс, таких как металлопротеазы. Протеазные ингибиторы синтезируются на недостаточном уровне для борьбы с разрушением хрящевого матрикса. Стадия 2 характеризуется эрозией хрящевой поверхности, которая вызывает детектируемое увеличение уровня фрагментов протеогликана и коллагена в синовиальной жидкости. В течение стадии 3, синовиальная мембрана является хронически воспаленной в результате действия продуктов разрушения хряща. Макрофаги в синовиальной мембране продуцируют цитокины, которые могут повреждать хрящ путем непосредственного разрушения ткани или путем стимулирования хондроцитов к продуцированию металлопротеиназ. Провоспалительные молекулы также могут вызывать повреждение на этой стадии. Полученное в результате повреждение хряща является сигналом к увеличению костного роста, поскольку организм пытается стабилизировать сустав, таким образом изменяя нормальные механические и конструкционные черты сустава.

Как обсуждается выше, предполагается, что способы по настоящему изобретению могут позволить идентификацию животных семейства кошачьих, которые могут быть предрасположены к развитию OA в будущем. Предполагается, что способы по настоящему изобретению могут конкретно применяться для этих животных, так как обычные методы, которые основаны на морфологических изменениях суставной ткани, обычно не могут идентифицировать. В этой связи конкретно могут применяться маркеры гаплотипа и однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) ОА-биомаркеров, раскрытые в настоящей заявке. В таких случаях, профилактические меры или другие терапии могут быть начаты в качестве средства предотвращения более ослабляющих организм симптомов или физического повреждения, ассоциированных с поздними стадиями OA.

Кроме того, в настоящей заявке предусмотрено, что в то время как ОА-биомаркеры, раскрытые в настоящей заявке, могут применяться для диагностики животного семейства кошачьих, страдающего OA, ОА-биомаркеры также могут применяться в качестве мишеней для терапевтического воздействия. Например, в настоящей заявке предусмотрено, что терапевтическое благоприятное воздействие может быть достигнуто перед проявлением патологических физических изменений у животного семейства кошачьих (или даже после появления физических изменений), путем изменения экспрессии любого одного или более биомаркеров, описанных в таблицах 1-3, представленных в настоящей заявке, например, путем уменьшения уровня экспрессии генов со сверхэкспрессией при OA и/или путем увеличения уровня экспрессии генов, которые имеют низкий уровень экспрессии при OA. В случаях некоторых биомаркеров, описанных подробно в разделе Примеров ниже, этого можно достичь путем введения нуждающемуся в этом животному семейства кошачьих лекарственной формы с высоким содержанием ЕРА и DHA.

Еще в настоящей заявке предусмотрено, что компоненты, которые могут применяться для лечения OA у животных семейства кошачьих или для улучшения состояния при OA, могут быть идентифицированы путем экспонирования клеток с тестируемыми компонентами in vitro и путем оценки изменений экспрессии генов одного или более ОА-биомаркеров. Такие in vitro-анализы хорошо известны специалисту в данной области и могут проводиться согласно обычным методам. Могут использоваться первичные культуры клеток животного семейства кошачьих, а также клеточные линии, выделенные из различных тканей животного семейства кошачьих, таких как, например, кровь, почка, мозг, язык или легкое. Клетки животного семейства кошачьих для in vitro-анализа могут быть получены коммерчески, например, из /Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС, Manassas, VA). Компоненты-кандидаты, которые демонстрируют потенциал для влияния на экспрессию ОА-биомаркеров, могут затем быть отмечены для проведения дополнительных экспериментов, включающих их применении в качестве компонентов в составах пищи домашнего животного, таких как описанные ниже в разделе Примеров.

Не подразумевая ограничения конкретным механизмом, в настоящей заявке предусмотрено, что генотипический фингерпринт осеоартрита у животных семейства кошачьих может характеризоваться с помощью дифференциальной экспрессии дискретных генов или биомаркеров. Использование этих молекулярных биомаркеров OA в форматах анализа молекулярной диагностики может улучшить детектирование OA по сравнению с методами, использующимися в настоящее время. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения, способ диагностики остеоартрита включает детектирование дифференциальной экспрессии биомаркера, где дифференциальная экспрессия биомаркера может представлять собой показатель нарушения биохимического пути, связанного или ассоциированного с OA, например, в виде причины или в виде эффекта. В других вариантах осуществления изобретения, способы включают детектирования дифференциальной экспрессии одного или более ОА-биомаркеров, например, ряда биомаркеров, представленных в настоящей заявке в таблицах 1-3. Таким образом, способы по настоящему изобретению не только позволяют идентификацию животного, страдающего остеоартритом, но также могут позволить идентификацию животного, которое может быть генетически предрасположено к развитию OA.

Способы, раскрытые в настоящей заявке, обеспечивают лучшее детектирование остеоартрита по сравнению с обычным диагностическим тестированием. "Обычные методы диагностики OA" хорошо известны специалисту в данной области и включают использование рентгеновского излучения, магнитно-резонансную томографию или использование ультразвука. В конкретных аспектах изобретения, точность настоящих способов является равной точности обычного рентгенологического или магнитно-резонансного тестирования или превосходит их при детектировании присутствия OA.

Биомаркеры по настоящему изобретению включают гены и белки и их варианты и фрагменты. Такие биомаркеры включают полинуклеотиды, например, ДНК, включающие полноразмерную или неполную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей биомаркер, или комплементарную цепь такой последовательности. Полинуклеотиды биомаркера также могут включать РНК, включающую полноразмерную ли неполную последовательность любой из представляющих интерес последовательностей нуклеиновой кислоты. Белок биомаркера представляет собой белок, кодируемый или соответствующий ДНК биомаркера по изобретению. Белок биомаркера включает полноразмерную или неполную аминокислотную последовательность любого из биомаркерных белков или полипептидов, раскрытых в настоящей заявке.

"Биомаркер" представляет собой любой ген или белок, чей уровень экспрессии в ткани или клетке изменяется по сравнению с уровнем в нормальной или здоровой клетке или ткани. Биомаркеры по настоящему изобретению дифференциально экспрессируются у животных семейства кошачьих, страдающих остеоартритом. Термин "дифференциально экспрессируются при остеоартрите" обозначает, что уровень экспрессии генов биомаркеров, представляющих интерес, или подвергается апрегуляции или даунрегуляции у субъекта, страдающего остеоартритом или предрасположенного к остеоартриту, по сравнению с уровнем соответствующих генов у контрольных субъектов, т.е. субъектов, не страдающих эти заболеванием и не предрасположенных к нему. В настоящей заявке предусмотрено, что детектирование биомаркеров по изобретению не только позволяет идентифицировать субъекта, страдающего OA, но также предоставляет средства для идентификации животного, предрасположенного к развитию этого аболевания, в идеале до проявления физических симптомов. По возможности, такое раннее детектирование позволит осуществлять улучшенный контроль за пациентом и сможет, возможно, предотвратить ассоциированное с заболеванием необратимое повреждение суставов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, способы диагностики остеоартрита, раскрытые в настоящей заявке, могут осуществляться в качестве первичных средств скрининга остеоартрита у животного семейства кошачьих. Скрининг указанного животного семейства кошачьих может проводиться как часть обычного медосмотра. Скрининг животного семейства кошачьих может также проводиться согласно способам по настоящему изобретению, если информация на основе истории болезни его матери и/или отца указывает на то, что животное семейства кошачьих может быть генетически предрасположено к OA, или если на основе наблюдаемых изменений в характере поведения животного предполагается, что животное семейства кошачьих страдает заболеванием. Способы по настоящему изобретению также могут применяться как часть клинического исследования совместно с обычными методами диагностики OA у животного семейства кошачьих, например, вместе с рентгенологическим методом или МРТ, когда указанные обычные методы неубедительны или когда требуется подтверждение диагноза, поставленного на основе использования обычных методов.

Биомаркеры по изобретению включают полинуклеотид или белок, которые селективно дифференциально экспрессируются при остеоартрите, как определено выше в настоящей заявке. Хотя любой биомаркерный показатель остеоартрита может использоваться по настоящему изобретению, в определенных вариантах осуществления изобретения биомаркеры включают любой один или более биомаркеров или ряд биомаркеров, представленных в настоящей заявке в таблицах 1-3.

Хотя способы по изобретению требуют детектирования, по меньшей мере, одного биомаркера в образце пациента для детектирования остеоартрита, в настоящей заявке предусмотрено, что при практическом использовании настоящего изобретения могут применяться несколько или более биомаркеров. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения, применяются один или более биомаркеров, более предпочтительно, два или более комплементарных биомаркеров. С помощью термина "комплементарный" обозначают, что детектирование комбинации биомаркеров в образце организма приводит в результате к успешной идентификации остеоартрита в большем процентном содержании случаев, чем при идентификации с помощью использования только одного из биомаркеров. Таким образом, в некоторых случаях может производиться более точное определение остеоартрита при использовании, по меньшей мере, двух биомаркеров. Соответственно, при практическом применении диагностических способов, раскрытых в настоящей заявке, в случае, где используются, по меньшей мере, два биомаркера, могут использоваться, по меньшей мере, два антитела, направленных к различным биомаркерным белкам. Например, антитела или зонды для нуклеиновых кислот могут контактировать с образцом организма одновременно или последовательно.

В конкретных вариантах осуществления изобретения, способы диагностики по изобретению включают забор образца крови от пациента-животного семейства кошачьих, контактирование образца, по меньшей мере, с одним антителом, специфичным для представляющего интерес биомаркера и детектирование связывания антитела. Образцы, которые демонстрируют дифференциальную экспрессию биомаркера по изобретению, как определено с помощью детектирования связывания антитела, считаются позитивными для остеоартрита. В конкретных вариантах осуществления изобретения, образец из организма представляет собой образец крови, полученный от животного семейства кошачьих с помощью обычных методов, таких как методы разделения в градиенте плотности, например, метод с использованием Фикола-гипака, или метод с использованием пробирок для клеточных препаратов (пробирки СРТ™ tubes) от фирмы Becton Dickinson, или другие методы, хорошо известные специалисту в данной области.

Под термином "образец из организма" подразумевают любой забор образцов клеток, тканей или жидкостей организма, в которых может детектироваться экспрессия биомаркера. Примеры таких образцов из организма включают, но не ограничены ими, кровь, лимфу, мочу, биопсии и мазки. Образцы из организма могут быть получены от животного семейства кошачьих с помощью разнообразных методов, включающих, например, соскоб или смыв с участка, или использование иглы для аспирирования жидкостей организма. Методы забора разнообразных образцов из организма хорошо известны из области техники. В конкретных вариантах осуществления изобретения, образец из организма включает клетки крови.

Любые методы, доступные из области техники для идентификации или детектирования ОА-биомаркеров по настоящему изобретению, охвачены настоящей заявкой. Дифференциальная экспрессия биомаркера по изобретению может детектироваться на уровне нуклеиновой кислоты или на уровне белка. Как описано выше, с целью определения дифференциальной экспрессии, исследуемый образец из организма может быть сравнен с соответствующим образцом из организма, который взят от здорового субъекта. Поэтому, "нормальный" уровень экспрессии представляет собой уровень экспрессии биомаркера в клетках субъекта-животного семейства кошачьих, не пораженного остеоартритом или не предрасположенного к остеоартриту. В некоторых случаях, где для животного, страдающего артритом, известно соотношение экспрессии биомаркера к контролю, то дифференциальная экспрессия указанного биомаркера у животного может быть охарактеризована без непосредственного сравнения с нормальным уровнем.

Методы детектирования биомаркеров по изобретению включают любые методы, которые определяют количество или присутствие биомаркеров или на уровне нуклеиновой кислоты или на уровне белка. Такие методы хорошо известны из области техники и включают, но не ограничены ими, Вестерн блот-анализы, Нозерн блот-анализы, блот-анализы по Саузерну, ELISA,

иммунопреципитацию, иммунофлуоресценцию, проточную цитометрию, иммуноцитохимию, методы гибридизации нуклеиновой кислоты, методы обратной транскрипции нуклеиновой кислоты и методы амплификации нуклеиновой кислоты. В конкретных вариантах осуществления изобретения, дифференциальную экспрессию биомаркера детектируют на уровне белка с использованием, например, антител, которые направлены против специфичных биомакерных белков. Эти антитела могут использоваться в разнообразных методах, таких как Вестерн блот-анализ, ELISA, методы иммунопреципитации или иммуноцитохимии. Кроме того, могут быть получены данные обычной диагностической визуализации с использованием рентгеновского излучения или магнитного резонанса, и сравнены с иммуноцитохимической информацией или с информацией гибридизации зонда для нуклеиновой кислоты. Таким образом, детектирование биомаркеров может подтверждать результаты, полученные с помощью обычных диагностических методов, или вносить ясность, когда обычные методы неубедительны.

В одном варианте осуществления изобретения, антитела, специфичные для биомаркерных белков, применяются для детектирования дифференциальной экспрессии биомаркерного белка в образце из организма. Способ включает получение образца из организма субъекта, контактирование образца из организма, по меньшей мере, с одним антителом, направленным против биомаркера, который селективно дифференциально экспрессируется при остеоартрите, и детектирование связывания антитела для определения того, экспрессируется ли биомаркер в образце подобным дифференциальным образом. В предпочтительном аспекте настоящего изобретения предлагается иммуноцитохимический способ диагностики остеоартрита с использованием образца крови, взятого от субъекта.

В предпочтительном иммуноцитохимическом способе, производят забор образца крови у субъекта с использованием методов, хорошо известных специалисту в данной области. Например, как описано в примерах, представленных в настоящей заявке, в случае, где требуется выделение нуклеиновой кислоты, также могут применяться пробирки PAXgene blood RNA tubes (для использования в выделении РНК из клеток крови с помощью набора реагентов PAX gene). Образец крови может быть проанализирован немедленно или, для проведения анализа позже, может храниться при подходящих условиях, хорошо известных специалисту в данной области.

Альтернативно, антитело, конкретно, моноклональное антитело, направленное против представляющего интерес биомаркера, может инкубироваться с образцом крови, взятым от субъекта. Как отмечено выше, специалисту в данной области понятно, что более точный диагноз остеоартрита в некоторых случаях может быть получен путем детектирования более чем одного биомаркера в образце, взятом от пациента. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления изобретения для детектирования остеоартрита применяются, по меньшей мере, два антитела, направленные против двух различных биомаркеров. В случае, где используется более чем одно антитело, эти антитела могут добавляться к одному образцу последовательно в виде индивидуальных реагентов-антител или одновременно в виде коктейля антител. Альтернативно, каждое индивидуальное антитело может добавляться к отдельным образцам, взятым от одного и того же пациента, и полученные данные затем объединяют.В конкретных вариантах осуществления изобретения, коктейль антител может включать несколько антител, где указанные антитела связываются, например, с рядом ОА-биомаркеров, раскрытых в таблицах 1-3.

Термины "антитело" и "антитела" в широком смысле охватывают природные формы антител и рекомбинантные антитела, такие как одноцепочечные антитела, химерные и гуманизированные антитела и мультиспецифичные антитела, а также фрагменты и производные всех вышеперечисленных, имеющие, по меньшей мере, один сайт связывания с антигеном. Полностью собранные антитела и фрагменты антител, которые могут связываться с антигеном, включены в это определение. Производные антител могут включать белок или химический компонент, конъюгированные с антителом.

"Фрагменты антитела" включают участок интактного антитела, предпочтительно, антиген-связывающий или вариабельный участок интактного антитела. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диабоди (diabodies); линейные антитела (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062); молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. С помощью гидролиза антител папаином получают два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых фрагментами "Fab", каждый с одним антиген-связывающим сайтом, и остаточный фрагмент "Fc". С помощью обработки пепсином получают фрагмент F(ab')2, который содержит два антигенсвязывающих центра антитела, и, тем не менее, способен к перекрестному связыванию антигена. В настоящей заявке описаны способы получения антител, способных специфично распознавать один или более дифференциально экспрессирующихся генов эпитопов. Такие антитела могут включать, но не ограничены ими, поликлональные антитела, моноклональные антитела (mAb), гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab')2-фрагменты, фрагменты, получаемые с помощью Fab-экспрессирующей библиотеки, анти-идиотипические антитела (анти-Id), и эпитоп-связывающие фрагменты любых перечисленных выше антител.

Для получения антител к дифференциально экспрессирующемуся гену, разнообразные животные-хозяева могут иммунизироваться с помощью инъекции белка или его части, кодируемых дифференциально экспрессирующимся геном. Такие животные-хозяева могут включать, но не ограничены ими, кроликов, мышей, крыс и цыплят, но редко. Для увеличения иммунологической реакции могут использоваться разнообразные адъюванты в зависимости от вида животного-хозяина, адъюванты включают, но не ограничены ими, реагент Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол и адъюванты, потенциально используемые для человека, такие как БЦЖ (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum.

Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, выделенных из сыворотки животных, иммунизированных с помощью антигена, такого как целевой генный продукт или его производное с антигенной функцией. Для получения поликлональных антител могут быть иммунизированы животные-хозяева с помощью инъекции дифференциально экспрессирующегося генного продукта, с добавлением адъювантов, что также описано выше.

Моноклональные антитела, которые представляют собой гомогенные популяции антител к конкретному антигену, могут быть получены с помощью любого метода, который предусмотрен для получения молекул антител в культуре клеток с помощью стабильных клеточных линий. Эти методы включают, но не ограничены ими, гибридомный метод Келера и Мильштейна (Kohler и Milstein), (1975, Nature 256:495-497; и Пат. US No. 4376110), метод с использованием гибридомы В-клеток человека (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030), и метод с использованием EBV-гибридомы (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96). Такие антитела могут представлять собой иммуноглобулины любого класса, включающие IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и любой их подкласс. Гибридома, продуцирующая mAb по настоящему изобретению, может культивироваться in vitro или in vivo.

Кроме того, могут использоваться методы, разработанные для получения "химерных антител" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454) с помощью сплайсинга генов из молекулы мышиного антитела подходящей антигенной специфичности вместе с генами из молекул человеческого антитела подходящей биологической активности. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные участки выделены из различных видов животных, такую молекулу, которая содержит вариабельный или гипервариабельный участок, выделенный из мышиного mAb, и константный участок человеческого иммуноглобулина.

Альтернативно, методы, описанные для получения одноцепочечных антител (US Пат.No. 4946778; Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; и Ward et al., 1989, Nature 334:544-546), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител к продуктам дифференциально экспрессирующихся генов.

Одноцепочечные антитела образуются с помощью соединения фрагментов тяжелой и легкой цепи Fv-участка посредством аминокислотного мостика с получением в результате одноцепочечного полипе