Композиции и способы направленного устранения мутационного ускользания в направленной терапии рака

Композиции и способы направленного устранения мутационного ускользания в направленной терапии рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение в целом относится к композициям и способам их применения в комбинации с противоопухолевыми терапевтическими средствами для обеспечения направленного устранения мутационного ускользания.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Новые открытия в биологии рака обеспечили возможность разработки специфичных противоопухолевых средств направленного действия и способствовали успешной разработке лекарственных средств. Указанные открытия позволяют создавать молекулы, обладающие высокой селективностью в отношении специфичных мишеней в опухолевых клетках. Segota & Bukowski, Cleveland Clinic J. Med., 71(7):551-560 (2004). Например, успех ингибитора Bcr-Abl тирозинкиназы, иматиниба (Гливека), при лечении хронического миелолейкоза (ХМЛ) вызвал большие ожидания относительно данного направленного метода. Capdeville et al., Nature Reviews, 1:493-502 (2002). Направленная терапия рака вместе с тем приводит к сложной проблеме: у мишеней появляются мутации ускользания, приводящие, в конечном счете, к развитию устойчивости к лекарственному средству. Например, сообщалось, что мутации, как было установлено, возникали у пациентов, которые первоначально реагировали на терапию с применением Гливека и которые в результате указанных мутаций стали невосприимчивы к дальнейшему лечению с применением Гливека. Gorre et al., Science, 293:876-880 (2001); Shah et al., Cancer Cell, 2:117-125 (2002); Branford et al., Blood, 99(9):3742-3745 (2002); Deininger et al., Blood, 105(7):2640-263 (2005); Walz et al., Critical Reviews in Oncology/Hematology 57:145-164 (2006); а также Burgess et al., TheScientificWorldJOURNAL, 6:918-930 (2006). Точно так же мутации в рецепторе эпидермального фактора роста (EGFR) были обнаружены у пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), которые, как сообщалось, делали их устойчивыми к действию терапевтических средств, таких как гефитиниб (Иресса) или эрлотиниб (Тарцева), которые специфично воздействуют на EGFR. Kobayashi et al., N. Engl. J. Med., 352(8):786-792 (2005). Поэтому эффективность указанных противоопухолевых препаратов существенно ограничена в результате возникновения мутаций, приводящих к ускользанию.

Таким образом, предпочтительно, по меньшей мере, минимизировать возникновение мутантов, которые появляются при введении терапевтических и/или профилактических средств.

Способы активации иммунного ответа описаны, например, в Thyphronitis et al., Anticancer Research, Vol. 24:2443-2454 (2004) and Plate et al., Journal of Cell Biology, Vol. 94:1069 (2005). Дрожжевые системы описаны, например, в патенте США 5830463, Stubbs et al., Nature Med. 5:625-629 (2001); Lu et al., Cancer Research 64:5084-5088 (2004); а также Franzusoff, et al., Expert Opin. Bio. Ther. Vol.5:565-575 (2005).

Все ссылки, приведенные в настоящей заявке, включая патенты, заявки на патент и публикации, настоящим включены путем отсылки в полном объеме.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы направленного устранения мутационного ускользания, связанного с раком. В одном из аспектов, изобретение обеспечивает способы направления устранения мутационного ускользания у человека, нуждающегося в этом, посредством введения человеку эффективного количества терапевтического средства направленного действия, где терапевтическое средство выбрано из группы, состоящей из ингибитора тирозинкиназы, ингибитора Src киназы, средства, влияющего на стабильность Bcr-Abl, и средства, которое действует в сигнальном пути, следующем после Bcr-Abl, а также композиции, включающей одно или несколько из следующего: i) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп; ii) дрожжевой носитель, включающий по меньшей мере один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп; iii) дрожжевой носитель совместно с, по меньшей мере, одним мутантным полипептидом, ассоциированным с раком, его фрагментом, который включает мутацию, или мимотопом; iv) дрожжевой носитель, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введенный внутриклеточно в дендритную клетку; или v) дрожжевой носитель и, по меньшей мере, один мутантный полипептид, ассоциированный с раком, его фрагмент, который включает мутацию, или мимотоп, введенный внутриклеточно в дендритную клетку, где мутантный полипептид, как известно, появляется, или появился, по меньшей мере, с одной специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства направленного действия для лечения рака. В некоторых аспектах терапевтическое средство направленного действия представляет собой ингибитор тирозинкиназы. В одном из аспектов ингибитором тирозинкиназы является иматиниб. В других аспектах ингибитор тирозинкиназы выбран из группы, состоящей из иматиниба, нилотиниба, PD1866326, PD180970, AP23464, BMS-354825, ON012380, VX-680 и BIRB-796.

В другом аспекте терапевтическое средство направленного действия представляет собой ингибитор Src киназы. В некоторых примерах ингибитор Src киназы выбран из группы, состоящей из PD166326, PD180970, AP23464, BMS-354825, AZM475271, PP1, PP2, AP-23236, CGP76030 и PD173955. В другом аспекте терапевтическим средством направленного действия является PKC412 или SU11248. В других аспектах терапевтическое средство направленного действия влияет на стабильность Bcr-Abl. В некоторых примерах средство направлено на белки теплового шока или другие белки-шапероны, которые ассоциированы с Bcr-Abl. В других примерах средство представляет собой гелданамицин/17-AAG или NVP-LAQ824.

В другом аспекте терапевтическое средство направленного действия действует в сигнальном пути, следующим после Bcr-Abl. В некоторых примерах средство выбрано из группы, состоящей из SCH66336, BAY-439006, CI-1040, LY294002, вортманнин, OSU-03012, CCI-779, R115777, BMS-214662, U0126, PD184352, рапамицин, RAD001, CCI-779 и AP23573.

Изобретение также обеспечивает наборы для направленного устранения ассоциированного с раком мутационного ускользания у человека, у которого мутационное ускользание, как известно, появляется, или уже появилось, по меньшей мере, с одной специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства направленного действия, и где набор включает композицию любого из вышеуказанных терапевтических средств.

Изобретение также обеспечивает наборы для направленного устранения ассоциированного с раком мутационного ускользания у человека, у которого мутационное ускользание, как известно, появляется, или уже появилось, по меньшей мере, с одной специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства направленного действия, и где набор включает дрожжевой носитель и, по меньшей мере, один мутантный полипептид, его фрагменты, которые включают мутацию, или мимотопы. В одном из аспектов набор дополнительно включает терапевтическое и/или профилактическое средство направленного действия. В другом аспекте набор дополнительно включает инструкцию по применению набора.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

На Фиг.1 показана кривая выживаемости при лейкемии дикого типа BCR-ABL для контрольных мышей по сравнению с вакцинированными.

На Фиг.2 показана кривая выживаемости при мутантной лейкемии для контрольных мышей по сравнению с вакцинированными.

На Фиг.3 показана кривая выживаемости для мышей, иммунизированных двумя различными конструкциями Tarmogen: GI-10,001 (Tarmogen, содержащий три мутации ускользания (E255K, T315I и M351T)) и GI-10,002 (Tarmogen, содержащий одну мутацию ускользания (T315I)).

На Фиг.4 показан подсчет количества лейкозных клеток у контрольных мышей по сравнению с вакцинированными. Мышей вакцинировали с применением Tarmogen, содержащего мутацию ускользания T315I. По оси Y указан процент GFP-положительных клеток. Два открытых круга вблизи 0 указывают вакцинированных мышей, которые демонстрируют весьма небольшое количество лейкозных клеток.

На Фиг.5 показан подсчет количества лейкозных клеток у мышей, которых либо не вакцинировали, либо вакцинировали с применением GI-10,001 (Tarmogen, содержащий три мутации ускользания (E255K, T315I и M351T)) или GI-10,002 (Tarmogen, содержащий одну мутацию ускользания (T315I)).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Существует потребность в профилактических и терапевтических средствах, которые специфично воздействуют на сигнальные пути, которые являются уникальными для опухолевых клеток, однако при этом существует проблема, что опухолевые клетки подвергаются мутации (мутациям), которые позволяют им "ускользать" от воздействия лекарственного средства (средств) и/или становиться устойчивыми. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы направленного устранения мутационного ускользания, связанного с профилактическими или терапевтическими средствами (также упомянутыми в настоящей заявке как мутантный полипептид). Указанные композиции и способы могут применяться для активации иммунного ответа против мутантного полипептида, который, как известно, появляется, или уже появился, в ответ на лекарственное средство направленного действия или на клетку, которая экспрессирует мутантный полипептид. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом, в некоторых примерах иммунный ответ является гуморальным ответом, а в другом примере иммунный ответ является и клеточным, и гуморальным. В некоторых примерах клеточный иммунный ответ направлен на устранение клетки, такой как, например, опухолевая клетка или клетка, которая поддерживает рост опухоли, которая избежала устранения, и включает мутации в полипептиде, на который воздействует лекарственное средство, но устранение клетки при этом не требуется. В некоторых примерах клеточный и/или гуморальный иммунный ответ блокирует пролиферацию клеток или репликацию.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способы активации иммунного ответа против мутантного полипептида, или клетку, которая включает нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный полипептид, и/или экспрессирует мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства (средств). В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом. В некоторых примерах иммунный ответ является гуморальным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ включает и клеточный, и гуморальный иммунный ответ. В некоторых примерах мутантный полипептид кодируется онкогеном и/или экспрессируется опухолевой клеткой. В некоторых примерах мутантный полипептид ассоциирован с или экспрессируется опухолевой клеткой. В некоторых примерах средство направлено на опухолевую клетку. В некоторых примерах средство представляет собой небольшую молекулу или антитело.

Терапевтические средства направленного действия включают, помимо прочего, средства, которые ингибируют киназную активность белков, экспрессия (или сверхэкспрессия) которых связана с развитием и ростом опухоли. Примеры подобных киназ включают Bcr-Abl, Src, Src/Akt, EGFR, PDGFR, Raf, Mek, Erk, PI3K, PDK, PDK, AKT и mTOR. В других примерах средства действуют как общие ингибиторы указанных белков и другого белка при их выработке. В некоторых примерах средства действуют через прямое связывание с активным сайтом белка, а в других случаях средства вызывают аллостерические изменения в белке, влияя на его активность. Композиции, описанные в настоящей заявке, применяются в комбинации с указанными терапевтическими средствами направленного действия в целях контроля и/или устранения "ускользнувших" мутантов, которые появляются в результате применения указанных терапевтических средств направленного действия.

Общие методики

При осуществлении настоящего изобретения используются, если не указано иное, стандартные методы молекулярной биологии (включая методы генной инженерии), микробиологии, клеточной биологии, биохимии, химии нуклеиновых кислот и иммунологии, известные специалистам в данной области. Такие методы подробно описаны в литературе, например, в Methods of Enzymology, Vol. 194, Guthrie et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); Biology and activities of yeasts, Skinner, et al., eds., Academic Press (1980); Methods in yeast genetics: a laboratory course manual, Rose et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990); The Yeast Saccharomyces: Cell Cycle and Cell Biology, Pringle et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997); The Yeast Saccharomyces: Gene Expression, Jones et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1993); The Yeast Saccharomyces: Genome Dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, Broach et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1992); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989), а также Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition (Sambrook and Russell, 2001), (в настоящем описании в целом упоминаются как "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, включая дополнения по 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (в настоящем описании в целом упоминаются как "Harlow and Lane"), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000) и Vaccines, S. Plotkin and W. Orenstein, eds., 3rd edition (1999).

Определения

Используемый в настоящем описании термин "рак" включает, помимо прочего, меланомы, плоскоклеточную карциному, раковые опухоли молочной железы, карциномы головы и шеи, карциномы щитовидной железы, саркомы мягких тканей, саркомы кости, раковые опухоли яичка, раковые опухоли простаты, раковые опухоли яичников, раковые опухоли мочевого пузыря, раковые опухоли кожи, раковые опухоли мозга, ангиосаркомы, гемангиосаркомы, тучноклеточные опухоли, первичные раковые опухоли печени, раковые опухоли легкого, раковые опухоли поджелудочной железы, желудочнокишечные раковые опухоли, почечноклеточные карциномы, неоплазии кроветворной системы, лейкозы, а также метастатические раковые опухоли.

Используемое в настоящем описании терапевтическое и/или профилактическое "средство" или "лекарственное средство", направленное на клетку, означает, что средство направлено на молекулу (молекулы), ассоциированную с или ответственную за трансформацию клетки, или поддерживающую рост опухоли в случае рака. Примеры терапевтических и/или профилактических средств, которые направлены на клетку, такую как раковая клетка, описаны в настоящей заявке и известны в уровне техники.

Используемый в настоящем описании термин "мутантный полипептид" охватывает полноразмерный полипептид, кодируемый геномом, а также его фрагмент, при условии, что фрагмент включает мутацию, которая, как известно, появляется или появилась в результате специфичной мутации в ответ на средство, такое как профилактическое и/или терапевтическое средство. Такие мутантные полипептиды, которые появляются со специфичной мутацией в ответ на средство, такое как профилактическое и/или терапевтическое средство, направленное на клетку, такую как раковая клетка, обычно упоминаются в уровне техники как "ускользнувшие мутанты". Мутантные полипептиды также упомянуты в настоящем описании как "мутационное ускользание", а также "ускользнувший мутант". Мутация может быть обнаружена в любой области полноразмерного полипептида и может включать аминокислотную замену, вставку или делецию, или их комбинацию, или слияние непоследовательных последовательностей, как при транслокации. В некоторых примерах мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на средство, является иммуногенным сам по себе, то есть, без присутствия адъюванта или другого вектора или носителя, такого как дрожжевой носитель, но это не обязательно. В других примерах мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился в ответ на средство, является иммуногенным совместно с адъювантом, который усиливает его антигенные свойства.

Используемый в настоящем описании термин "адъюванты" включает, например, лиганд-агонист Toll-подобного рецептора (TLR), который активирует ответы цитокинов врожденного иммунитета, и который, как сообщают, связан с созреванием и активацией антиген-презентирующих клеток (АПК); CpG нуклеотидные последовательности; одно- или двунитевые РНК (агонисты TLR7); липидные остатки, такие как липополисахарид (ЛПС); маннаны и глюканы, компоненты дрожжей (которые, как сообщают, функционируют через взаимодействие с TLR 2, 4 и 6); и дрожжевые носители, такие как описанные в настоящей заявке.

Введение мутантного полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид (который может быть получен любым из способов, раскрытых в настоящем описании или известных в уровне техники) "совместно" со средством не означает, что мутантный полипептид и средство вводят одновременно, хотя это включено в способы, описанные в настоящей заявке. Мутантный полипептид может быть введен перед, одновременно с или после введения средства, или в комбинации вышеперечисленного. Мутантный полипептид или нуклеиновая кислота, кодирующая мутантный полипептид, могут быть введены через несколько часов, дней или месяцев после введения средства. В некоторых примерах введение мутантного полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид (который может быть получен любым из способов, раскрытых в настоящем описании или известных в уровне техники) проводят перед введением средства, а дополнительно могут проводить после введения средства, в особенности, если средство, как известно, прямо или опосредованно воздействует на пролиферацию клеток какого-либо типа.

Используемый в настоящем описании термин "мимотоп" относится к пептидному эпитопу, который имитирует способность пептида или полипептида вызывать иммунный ответ, а в некоторых примерах клеточный и/или гуморальный иммунный ответ, к целевому полипептиду или клетке, экспрессирующей целевой полипептид. Используемый в настоящем описании термин "мимотоп" включает, помимо прочего, пептид, который имитирует один или несколько эпитопов мутантного полипептида, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на введение терапевтического и/или профилактического средства. Такие мимотопы могут быть получены с использованием полученных при помощи компьютера структур MHC-пептидных комплексов и предполагаемые обязательные участки связывания с рецептором клетки T. Мимотопы могут быть также получены посредством генерации рандомизированных молекул, например олигонуклеотидов, пептидов или других органических молекул, и скрининга таких образцов на предмет их способности вызывать иммунный ответ, например, клеточный иммунный ответ, с помощью способов и анализов, описанных в настоящей заявке и известных из уровня техники.

Используемое в настоящем описании "улучшение симптомов болезни или инфекции" включает смягчение, стабилизацию, изменение, замедление или задержку какого-либо симптома и/или развития состояния заболевания, которые можно оценить в соответствии с клиническими и/или субклиническими критериями.

В некоторых примерах "эффективное количество" мутантного полипептида (или его мимотопа) или нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантный полипептид, соответствует количеству, способному вызывать иммунный ответ при введении млекопитающему. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным иммунным ответом. В других примерах иммунный ответ является гуморальным ответом. В некоторых примерах иммунный ответ является клеточным и гуморальным ответом.

Используемые в настоящем описании понятия "млекопитающее" или "млекопитающее-хозяин" включают человека и приматов, кроме человека, таких как шимпанзе, а также другие виды высших и низших приматов; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овца, свиньи, козы и лошади; домашних млекопитающих, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая домашних, диких и охотничьих (дичь), таких как куры, индюки и другие куриные, утки, гуси и т.п. Данное понятие не обозначает конкретный возраст. Таким образом, включены взрослые, незрелые и новорожденные особи, а также пренатальные млекопитающие.

"Антиген" относится к молекуле, содержащей один или несколько эпитопов (либо линейные, либо конформационные, или и те, и другие) или иммуногенные детерминанты, которые стимулируют иммунную систему организма-хозяина, например, иммунную систему млекопитающего, вызывая антиген-специфичный гуморальный и/или антиген-специфичный клеточный ответ. Антиген может быть "иммуногеном" самостоятельно или совместно со средством, которое усиливает его антигенные свойства. Термин "антиген" включает цельный белок, процессированный белок, фрагмент белка, пептида и пептидный мимотоп. Антигены могут иметь природное происхождение, или являться генно-инженерными вариантами белка. Антигены могут иметь природное происхождение, или являться генно-инженерными вариантами белка. Термин "антиген" включает субъединичные антигены (то есть, антигены, которые являются отдельными и дискретными от целого организма, с которым антиген связан в природе). Антитела, такие как антиидиотипические антитела или их фрагменты, а также синтетические пептидные мимотопы, которые являются синтетическими пептидами, способными имитировать антиген или антигенную детерминанту, также подпадают под определение антигена, используемое в настоящей заявке. В некоторых примерах антиген включает мутантный полипептид или может быть получен из мутантного полипептида, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на профилактическое и/или терапевтическое средство, и может быть природным или синтетическим. Антиген может являться всего лишь одним эпитопом, или может быть больше и включать несколько эпитопов. Таким образом, размер антигена может составлять всего лишь приблизительно 5-12 аминокислот (например, пептид), или же соответствовать размеру полноразмерного белка, включая мультимеры и слитые белки, химерные белки, цельные клетки, цельные микроорганизмы или их части (например, лизаты цельных клеток или экстракты микроорганизмов). Следует понимать, что в некоторых примерах (то есть, когда антиген экспрессируется вектором, таким как дрожжевой вектор или вирус, с молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты) антиген включает, помимо прочего, белок или его фрагмент, слитый белок, химерный белок, мультимеры, а не всю клетку или микроорганизм.

Используемый в настоящей заявке термин "эпитоп" определен в настоящем описании как отдельный антигенный сайт в пределах данного антигена, который является достаточным, чтобы вызвать иммунный ответ, который может быть клеточным и/или гуморальным иммунным ответом. Специалисты в данной области осведомлены, что эпитопы T-клеток имеют другой размер и состав по сравнению с эпитопами B-клеток, и что эпитопы, презентируемые посредством главного комплекса гистосовместимости класса I (MHC), отличаются от эпитопов, презентируемых посредством MHC класса II. Обычно эпитоп B-клетки включает, по меньшей мере, приблизительно 5 аминокислот, но может включать всего лишь 3-4 аминокислоты. Эпитоп T-клетки, такой как эпитоп цитотоксического T-лимфоцита (CTL), включает, по меньшей мере, приблизительно 7-10 аминокислот, а эпитоп хелперной T-клетки, по меньшей мере, приблизительно 12-20 аминокислот. В данном контексте антиген может являться мимотопом, который более эффективен при активации и амплификации T-клеток, способных узнавать клетки, экспрессирующие мутированный полипептид. Обычно эпитоп, узнавание которого T-клетками приводит к устранению целевой клетки, включает приблизительно 7-15 аминокислот, например, 8, 9, 10, 12 или 15 аминокислот.

Используемые в настоящем описании понятия "иммунологический ответ" или "иммунный ответ" к мутантному полипептиду (или его мимотопу) или нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид (или к нуклеиновой кислоте, способной связываться с мутантным полипептидом, такой как, например, миРНК или антисмысловая РНК), или композиции, включающей полипептид или нуклеиновую кислоту, включает развитие у млекопитающего клеточного иммунного ответа, который узнает полипептид. В некоторых примерах иммунный ответ является гуморальным иммунным ответом. В некоторых примерах клеточный иммунный ответ дополнительно включает гуморальный иммунный ответ. Иммунный ответ может быть специфичным к мутантному полипептиду, но это не обязательно. Иммунный ответ, активируемый в результате введения мутантного полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, может быть любым детектируемым увеличением любого аспекта иммунного ответа (например, клеточным ответом, гуморальным ответом, выработкой цитокинов) по сравнению с иммунным ответом без введения полипептида или нуклеиновой кислоты. Иммунный ответ может являться специфичным ответом к мутантному полипептиду, но это не обязательно. Настоящее изобретение охватывает композиции совместно с мутантным полипептидом (или его мимотопом) или нуклеиновой кислотой, кодирующей мутантный полипептид, который вызывает иммунный ответ.

Используемый в настоящем описании "гуморальный иммунный ответ" относится к иммунному ответу, опосредованному молекулами антител или иммуноглобулинами. Молекулы антител настоящего изобретения включают классы IgG (а также подтипы IgG1, IgG2a и IgG2b), IgM, IgA, IgD и IgE. Антитела функционально включают антитела первичного иммунного ответа, а также антитела вторичного иммунного ответа или сывороточные нейтрализующие антитела. Что касается инфекционной болезни, антитела настоящего изобретения могут служить, но не обязательно, в целях нейтрализации или уменьшения инфекционности вируса, кодирующего мутантный полипептид, и/или опосредуют комплементзависимую (CDC) или антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в отношении мутантного полипептида.

Используемый в настоящем описании "клеточный иммунный ответ" представляет собой ответ, опосредованный T-лимфоцитами и/или другими лейкоцитами, включая без ограничения натуральные киллерные (NK) клетки и макрофаги. T-лимфоциты настоящего изобретения включают T-клетки, экспрессирующие субъединицы альфа/бета рецептора T-клеток, или T-клетки, экспрессирующие гамма/дельта рецептор, и могут являться либо эффекторными, либо супрессорными T-клетками.

Используемые в настоящем описании термины "T-лимфоциты" или "T-клетки" являются непродуцирующими антитела лимфоцитами, которые составляют часть клеточно-опосредованной составляющей иммунной системы. T-клетки происходят от незрелых лимфоцитов, которые мигрируют из костного мозга в тимус, где они подвергаются процессу созревания под контролем гормонов тимуса. Созревающие T-клетки становятся иммунокомпетентными на основе своей способности узнавать и связывать специфичный антиген. Активация иммунокомпетентных T-клеток инициируется, когда антиген связывается с поверхностными рецепторами лимфоцита. Известно, что для генерации T-клеточных ответов антиген должен синтезироваться внутри или поступать в клетки, затем подвергаться процессингу под действием протеасомного комплекса с образованием небольших пептидов, и перемещаться в секреторный путь эндоплазматического ретикулума/комплекса Гольджи для последующего соединения с белками главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I. В альтернативе пептидные антигены могут поступать из внешней среды клеток, замещая пептиды, уже связанные с рецепторами MHC-I или MHC-II. Функционально клеточный иммунитет включает клетки антиген-специфичных цитотоксических T-лимфоцитов (ЦТЛ).

Используемые в настоящем описании понятия "антиген-специфичные киллерные Т-клетки", "ЦТЛ" или "цитотоксические T-клетки" относятся к клеткам, которые обладают специфичностью к пептидным антигенам, презентированным в комплексе с белками MHC или лейкоцитарными антигенами человека (HLA), когда указанные белки, представляют собой белки человека. ЦТЛ настоящего изобретения включают активированные ЦТЛ, инициированные специфичным антигеном в контексте MHC; и ЦТЛ памяти или вторичные ЦТЛ, которые относятся к T-клеткам, повторно активированным в результате повторного воздействия антигена, а также перекрестно-реактивные ЦТЛ или ЦТЛ, реактивные в отношении различных подтипов. ЦТЛ настоящего изобретения включают CD4+ и CD8+ T-клетки. Активированные антиген-специфичные ЦТЛ настоящего изобретения вызывают разрушение и/или лизис клеток индивида, инфицированного патогеном, в отношении которого специфичны ЦТЛ, блокируя проникновение патогена посредством секреции хемокинов и цитокинов, включая в частности воспалительный белок макрофагов 1α (MIP-1α), MIP-1β и RANTES; и секреции растворимых факторов, которые подавляют инфекции. Клеточный иммунитет настоящего изобретения также относится к антиген-специфичному ответу, вырабатываемому подгруппой T-клеток - T-хелперами. Хелперные T-клетки способствуют стимуляции функции, а также фокусируют активность неспецифичных эффекторных клеток в отношении клеток, презентирующих на своей поверхности пептид в комплексе с молекулами MHC. Клеточный иммунный ответ также относится к выработке цитокинов, хемокинов и других подобных молекул, продуцируемых активированными T-клетками и/или другими лейкоцитами, включая молекулы, вырабатываемые CD4 и CD8 T-клетками и NK-клетками. Композиция, которая вызывает клеточный иммунный ответ, может служить с целью сенсибилизации млекопитающего посредством презентирования полипептида в комплексе с молекулами MHC на поверхности клетки. Клеточно-опосредованный иммунный ответ направлен на, или вблизи, клетки, презентирующие антиген на своей поверхности. Кроме того, антиген-специфичные T-лимфоциты могут быть выработаны, чтобы обеспечить будущую защиту иммунизируемого организма-хозяина.

Способность определенного полипептида или антигена стимулировать клеточно-опосредованный иммунологический ответ может быть определена рядом анализов, известных в уровне техники, таких как анализы лимфопролиферации (активации лимфоцитов), киллинг-анализы ЦТЛ, или посредством анализа на наличие T-лимфоцитов, специфичных к антигену, у сенсибилизированного индивида. Подобные анализы известны в уровне техники. См., например, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376. Другие способы измерения клеточно-опосредованных иммунных ответов включают измерение уровней внутриклеточных цитокинов или цитокинов, секретируемых популяциями T-клеток, или измерение эпитоп-специфичных T-клеток (например, метод МНС-тетрамеров) (см. обзор McMichael, A. J., and O'Callaghan, C. A., J. Exp. Med. 187(9)1367-1371, 1998; Mcheyzer-Williams, M. G., et al, Immunol. Rev. 150:5-21, 1996; Lalvani, A., et al, J. Exp. Med. 186:859-865, 1997).

Используемый в настоящем описании "иммунологический ответ", или "иммунный ответ" охватывает иммунный ответ, который стимулирует продукцию ЦТЛ, и/или продукцию или активацию хелперных T-клеток, и/или антитело-опосредованный иммунный ответ. "T-лимфоциты" или "T-клетки" являются непродуцирующими антитела лимфоцитами, которые составляют часть клеточно-опосредованной составляющей иммунной системы. T-клетки происходят от незрелых лимфоцитов, которые мигрируют из костного мозга в тимус, где они подвергаются процессу созревания под контролем гормонов тимуса. Здесь зрелые лимфоциты быстро делятся до очень большого количества. Созревающие T-клетки становятся иммунокомпетентными на основе своей способности узнавать и связывать специфичный антиген. Активация иммунокомпетентных T-клеток индуцируется, когда антиген связывается с поверхностными рецепторами лимфоцита в контексте презентирования рецепторами MHC/HLA и корецепторами.

Используемая в настоящем описании "иммуногенная композиция" является композицией, которая включает мутантный полипептид (или включает соответствующий мимотоп мутированного эпитопа) или нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на терапевтическое и/или профилактическое средство, и может включать или не включать адъювант, который усиливает антигенные свойства мутантного полипептида, где введение композиции млекопитающему приводит к развитию клеточного иммунного ответа, гуморального иммунного ответа или клеточного и гуморального иммунного ответа. Иммуногенная композиция включает композицию, способную индуцировать защитный клеточный иммунный ответ, но это не обязательно.

Используемая в настоящем описании "профилактическая композиция" относится к композиции, которую вводят млекопитающему индивиду или хозяину, который является "иммунологически интактным" или не подвергался ранее воздействию антигена патогена или тому, кто не производит эффективный иммунный ответ против патогена с целью предотвращения болезни, такой как рак и инфекция или повторная инфекция (впрочем, настоящее изобретение не требует, чтобы инфекция или повторная инфекция были полностью предотвращены). Профилактические композиции настоящего изобретения не обязательно индуцируют абсолютный иммунитет у хозяина или индивида, которому они были введены.

Используемая в настоящем описании "терапевтическая композиция" относится к композиции, которую вводят индивиду или хозяину, подверженному раку, и, в некоторых примерах, перешедшему в стадию заболевания.

Используемые в настоящем описании термины "иммунизация", "иммунизировать" или "иммунизированный" относятся к способу введения иммуногенной композиции живому млекопитающему индивиду или хозяину в количестве, эффективно вызывающем иммунный ответ к композиции. В некоторых примерах иммунный ответ включает клеточный иммунный ответ, например, ответ цитотоксических Т-клеток. В некоторых примерах иммунный ответ включает гуморальный ответ, например выработку антител. В некоторых примерах иммунный ответ включает и клеточный, и гуморальный ответ.

Композиции на основе дрожжей и способы

Настоящее изобретение обеспечивает дрожжевые векторы, дрожжевые носители и композиции на основе дрожжей, которые включают мутантный полипептид, который, как известно, появляется или появился со специфичной мутацией в ответ на средства. Используемые в настоящем описании термины "дрожжевой вектор" и "дрожжевой носитель" используются попеременно и включают, помимо прочего, цельную дрожжевую клетку, дрожжевой сферопласт, дрожжевой цитопласт, дрожжевую клеточную тень, а также субклеточный экстракт дрожжевой мембраны или его фракцию. В некоторых примерах дрожжевая клетка или дрожжевой сферопласт используют для получения дрожжевого носителя, который в некоторых примерах включает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный полипептид, причем полипептид экспрессируется дрожжевой клеткой или дрожжевым сферопластом. В некоторых примерах дрожжевой носитель может быть получен из непатогенных дрожжей. В других примерах дрожжевой носитель может быть получен из дрожжей, выбранных из группы, состоящей из: Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Hansenula, Candida и Pichia. В некоторых примерах Saccharomyces представляет собой S. cerevisiae.

В целом дрожжевой носитель и мутантный полипептид могут быть объединены любым способом, описанным в настоящей заявке. В некоторых примерах мутантный полипептид вводят в дрожжевой носитель внутриклеточно. В других примерах мутантный полипептид ковалентно или нековалентно присоединяют к дрожжевому носителю. В дополнительных примерах дрожжевой носитель и мутантный полипептид объединяют посредством смешивания. В других примерах мутантный полипептид экспрессируется рекомбинантно дрожжевым носителем, либо дрожжевой клеткой или дрожжевым сферопластом, из которых был получен дрожжевой носитель.

Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает дрожжевые носители, которые охватывают любую дрожжевую клетку (например, цельную или интактную клетку) или ее производное, которые могут применяться совместно с мутантным полипептидом в композиции, или в качестве адъюванта. При этом дрожжевой носитель может включать, помимо прочего, живой интактный дрожжевой микроорганизм (то есть, дрожжевую клетку, содержащую все ее компоненты, включая клеточную стенку), убитый (мертвый) интактный дрожжевой микроорганизм или их производные, включающие: дрожжевой сферопласт (то есть, дрожжевую клетку, лишенную клеточной стенки), дрожжевой цитопласт (то есть, дрожжевую клетку, лишенную клеточной стенки и ядра), дрожжевую клеточную тень (то есть, дрожжевую клетку, лишенную клеточной стенки, ядра и цитоплазмы) или субклеточный экстракт дрожжевой мембраны или его фракции (также указанные выше, как субклеточная дрожжевая частица).

Дрожжевые сферо