Сухой экстракт фукуса, способ его получения и антикоагулянтная мазь на его основе

Сухой экстракт фукуса, способ его получения и антикоагулянтная мазь на его основе

Реферат

Изобретение относится к медицинской и лечебно-профилактической практике, к химико-фармацевтической, косметической промышленности, в том числе к области создания антикоагулянтов растительного происхождения.

Известен способ получения экстракта фукусного по патенту РФ на изобретение №2126688 от 27.02.1999 г. Способ заключается в измельчении фукусовых водорослей, экстракции и фильтрации экстракта. Перед экстракцией водоросли обрабатывают горячей водой, экстракцию проводят в слабощелочном растворе кальцинированной соды при щелочности 0,7-0,8%, температуре 65±5°C в течение 4-5 ч. После фильтрации упаривают экстракт и сушат при давлении пара 0,19±0,01 мПа. При экстрагировании слабощелочными растворами экстракт фукуса в основном содержит альгинаты, при данном способе получения экстракта извлечения фукоидана не происходит. Экстракт такого состава не может быть применен как антикоагулянтное средство.

Известно средство, обладающее антикоагулянтным и иммунотропным действием по патенту РФ на изобретение №2247574 от 26.12.2002 г. Оно представляет собой фукоидан, полученный путем экстракции водой бурой водоросли Fucus evanescens при температуре 20-60°C с последующим осаждением этанолом. Средство имеет молекулярную массу 20000-40000 дальтон и содержит нейтральные моносахариды: фукозы - 70-80%, галактозы - 2-9%, ксилозы - 5-10% и глюкозы - 2-7%, а также -сульфатов - 20-22%. Антикоагулянтное действие заявляемого фукоидана из Fucus evanescens характеризуется следующими параметрами при испытании in vitro: активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ) от 80 до 900 с, тромбиновое время (ТВ) от 40 до 400 с в зависимости от дозы. По антикоагулянтному действию оно сравнимо с гепарином, который также оказывает дозозависимый эффект. Фукоидан получают следующим способом. Свежую или замороженную (после дефрастации) водоросль обрабатывают этанолом с целью ее обезжиривания и удаления пигмента. Затем водоросль сушат на воздухе, грубо измельчают и обрабатывают водой (1:20 вес/объем) сначала при комнатной температуре (5 часов), а затем при 50-60°C при перемешивании в течение 5 часов. Экстракт концентрируют при пониженном давлении до 1/4-1/5 первоначального объема и доводят pH суспензии до значения 3,0. Затем отделяют образовавшийся осадок центрифугированием, доводят pH супернатанта до нейтрального титрованием гидроокисью натрия, диализуют против воды. Затем высаждают натриевую соль фукоидана двумя объемами 96% этанола. Осадок трижды промывают 50% водным этанолом и сушат 96% этанолом. Получают целевой продукт с выходом 7,5-10% (от веса сухой водоросли). Полученный фукоидан представляет собой порошок кремового цвета, хорошо растворим в воде, диметилсульфоксиде, нерастворим в спирте, ацетоне, гексане, серном эфире. Было проведено исследование антикоагулянтного действия фукоидана: влияние фукоидана на показатели коагулограммы в тестах in vivo и in vitro, которое показало, что оптимальная концентрация фукоидана для проявления максимального антикоагулянтного эффекта находится в интервале 50-100 мкг/мл. Аналогичным дозозависимым эффектом обладает, как известно, и гепарин. Особенностью данного метода является использование в качестве сырья дальневосточной водоросли F. evanescens, содержащей 7-10% фукоидана определенной структуры и состава, от которых зависят фармакологические свойства полисахарида. Кроме того, применение при экстракции сырья неэффективных методов мацерации (настаивания) снижают технологические выходы целевых продуктов, в частности фукоидана. Осаждение спиртом также сопровождается большими потерями конечных продуктов. Антикоагулянтное действия фукоидана из водоросли F. evanescens было изучено при внутривенном введении препарата, его наружное применение не рассматривалось.

Наиболее близким способом получения экстракта фукуса является способ комплексной переработки фукуса пузырчатого Fucus vesiculosus по патенту РФ на изобретение №2337571 от 11.08.2006 г. Способ заключается в том, сухие слоевища водорослей измельчают, экстрагируют смесью метиленхлорида со спиртом этиловым в соотношении 94,2:5,86% в аппарате Сокслета, концентрируют в вакууме на роторном испарителе, сушат в вакууме на роторном испарителе, сушат в вакуум-сушильном шкафу с получением липидно-пигментного комплекса - густого экстракта, затем шрот экстрагируют методом перколяции 85-90%-ным этанолом с принудительной циркуляцией экстрагента через каждый час настаивания в течение 3-5 ч, фильтруют, концентрируют в вакууме на роторном испарителе, кристаллизуют, фильтруют на нутч-фильтре, сушат и очищают методом колоночной хроматографии с использованием оксида алюминия и получают маннит очищенный, затем оставшийся шрот экстрагируют методом циркуляционной перколяции 5-15%-ным водным этанолом при pH 1-2 и временем настаивания 6-9 ч при температуре 40-60°C, концентрируют в вакууме на роторном испарителе, сушат в вакуум-сушильном шкафу и получают полисахаридный комплекс - сухой экстракт фукуса, затем шрот экстрагируют 1,5%-ным раствором карбоната натрия, обрабатывают серной кислотой, концентрируют на роторном испарителе, очищают диализом через целлофановую мембрану, сушат в вакуум-сушильном шкафу или лиофилизацией и получают полисахарид альгинат натрия. Недостатком способа является длительность процесса экстрагирования, низкие значения pH (или сильнокислые растворы экстрагента), что может приводить к гидролизу конечного продукта - фукоидана, а также сильный нагрев экстрагента, требующий значительных энергетических затрат при извлечении фукоидана.

Наиболее близким антикоагулянтным средством является гепариновая мазь. Фармакологические свойства: Антикоагулянтное средство, обладает местным противовоспалительным и антиэкссудативным действием. Предупреждает местное тромбообразование, повышает проницаемость сосудов; ускоряет рассасывание гематом; способствует восстановлению поврежденной соединительной ткани и хрящевых клеток. Показания: тромбофлебит, флебит поверхностных вен, перифлебит при варикозной язве, варикозные язвы, трофические язвы голени; состояние после флебосклерозирования, флебоэктомии; фурункул, карбункул, лимфаденит; гематома, ушибы, расхождение старых послеоперационных швов, для улучшения заживления швов после травм, ожогов, операций; артроз коленного сустава и суставов пальцев; хондропатия коленной чашечки; асептический инфильтрат, местный отек. Противопоказания: гиперчувствительность, геморрагический диатез, разные формы пурпур, тромбоцитопения, гемофилия, склонность к кровотечениям, беременность. Побочные действия: аллергические реакции (кожная сыпь, зуд кожи, крапивница, ангионевротический отек). При применении на больших поверхностях возможны геморрагические осложнения (вследствие резорбтивного действия).

Сухой экстракт фукуса, как и известные, представляет собой полисахаридный комплекс, содержащий фукоидан.

Способ получения сухого экстракта фукуса путем комплексной переработки фукуса пузырчатого Fucus vesiculosus, как и известные, заключается в том, что сухие слоевища водорослей измельчают, экстрагируют смесью метиленхлорида со спиртом этиловым в соотношении 94,2:5,86% в аппарате Сокслета, концентрируют в вакууме на роторном испарителе, сушат в вакууме на роторном испарителе, сушат в вакуум-сушильном шкафу с получением липидно-пигментного комплекса - густого экстракта, затем шрот экстрагируют методом перколяции 85-90%-ным этанолом с принудительной циркуляцией экстрагента через каждый час настаивания в течение 3-5 ч, фильтруют, концентрируют в вакууме на роторном испарителе, кристаллизуют, фильтруют на нутч-фильтре, сушат и очищают методом колоночной хроматографии с использованием оксида алюминия и получают маннит очищенный, затем оставшийся шрот экстрагируют методом перколяции 5-15%-ным водным этанолом, концентрируют, сушат и получают полисахаридный комплекс - сухой экстракт фукуса, затем шрот экстрагируют 1,5%-ным раствором карбоната натрия, обрабатывают серной кислотой, концентрируют на роторном испарителе, очищают диализом через целлофановую мембрану, сушат в вакуум-сушильном шкафу или лиофилизацией и получают полисахарид альгинат натрия.

Мазь антикоагулянтная, как и известные, включает активное и вспомогательные вещества, в качестве которых используют воду очищенную, эмульгатор и консерванты.

Задачей изобретения является совершенствование комплексной переработки фукусовых водорослей Баренцева моря, в частности фукуса пузырчатого Fucus vesiculosus, с целью расширения арсенала лекарственных средств растительного происхождения с антикоагулянтным действием.

Техническими результатами изобретения являются: ускорение процесса экстрагирования и получение сухого экстракта фукуса с определенными физико-химическими характеристиками, усиливающими его антикоагулянтное (гепариноподобное) действие, а также получение антикоагулянтного лечебно-профилактического средства в виде мази на основе полученного экстракта, обеспечивающего снижение побочных эффектов при использовании, способствующее расширению антикоагулянтных средств растительного происхождения.

Технический результат по первому пункту формулы достигается тем, для получения сухого экстракта фукуса, обладающего антикоагулянтным действием, шрот водорослей экстрагируют 4-6 часов при температуре 30-40°C и pH=3-4 методом перколяции с ультразвуковой обработкой, которую осуществляют прикрепленным с наружной стороны перколятора источником ультразвука, при этом включение ультразвука производят на 15-20 минут каждый час настаивания, затем вытяжку фильтруют, концентрируют на ультрафильтрационной установке и сушат в распылительной сушилке.

Технический результат по второму пункту формулы достигается тем, что сухой экстракт фукуса, обладающий антикоагулянтным действием, полученный способом по п.1, представляет собой полисахаридный комплекс, содержащий фукоидан следующего состава: нейтральные моносахариды - фукоза 41-44%, ксилоза 2-2,5%, манноза 3-3,5%, галакоза 4-4,5%, глюкоза 2%, уроновые кислоты 3-3,5%; а также полифенолы 18-20% и сульфаты 21-25%.

Технический результат по третьему пункту формулы достигается тем, что мазь антикоагулянтная включает сухой экстракт фукуса по п.2, ланолин, масло оливковое, ТВИН 80, консервант, воду очищенную, при следующем соотношении компонентов, масс.%:

сухой экстракт фукуса - 0,15-30;

ланолин - 1-10;

оливковое масло - 10-30;

ТВИН 80 - 1-5;

консерванты - 1-1,5;

вода очищенная - остальное.

Мазь может содержать следующее соотношение компонентов, масс.%:

сухой экстракт фукуса - 0,15;

ланолин - 10;

оливковое масло - 10;

ТВИН 80 - 1;

консерванты - 1;

вода очищенная - остальное.

Фукусовые водоросли - перспективное сырье для получения БАВ. Запасы фукоидов на побережье Баренцева моря оцениваются специалистами как значительные (более 300 тонн), данные виды водорослей имеют широкое распространение, произрастают в удобных для заготовки местах - на литорали. F. vesiculosus - представитель фукусовых на побережье Баренцева и Белого морей. В настоящее время проводится широкое исследование антикоагулятных свойств фукоидана (Розкин и др., 1991; Colliec et al.,1991; Nishino et al., 1991; Mauray et al., 1995; Giraux et al., 1998; Chevolot et al., 1999; Boissonvidal et al., 2000; Chevolot et al., 2001), в результате которого установлено, что фукоидан влияет на реологию крови, подобно гепарину. Гепариновая мазь применяется как антикоагулянтное средство, обладает местным противовоспалительным и антиэксудативным действием. Предупреждает местное тромбообразование, повышает проницаемость сосудов; ускоряет рассасывание гематом; способствует восстановлению поврежденной соединительной ткани и хрящевых клеток. Однако гепарин является лекарственным препаратом животного происхождения, и его применение в клинике может вызывать ряд побочных эффектов: снижение свертываемости крови, тромбоцитопения, возникновение желудочно-кишечных кровотечений, аллергические реакции и др. Гепарин плохо проникает через неповрежденные кожу и слизистые оболочки, вследствие этого лекарственное средство практически обладает слабым системным резорбтивным действием. При длительном применении на большие поверхности возможны геморрагические осложнения. Учитывая недостатки лекарственного препарата «гепариновая мазь», актуален поиск новых высокоэффективных, малотоксичных антикоагулянтов прямого действия растительного происхождения. Наибольшее признание в качестве таких веществ получили соединения полисахаридной природы, и в частности, водорослевый полисахарид фукоидан, а также фукоидансодержащие сухие экстракты водорослей.

Получение фукоидана наиболее перспективно осуществлять в процессе комплексного использования водорослевого сырья. Стадии комплексной технологии по получению густого экстракта и маннита являются одновременно и стадиями очистки при получении сухого экстракта фукуса.

Сухой экстракт фукуса (СЭФ) в ближайшем аналоге получают из шрота фукусовых водорослей Баренцева моря (F. vesiculosus, F. distichus, F. serratus, A. nodosum) в рамках комплексной технологии, заключающейся в следующем: сухие слоевища водорослей измельчают, экстрагируют смесью органических экстрагентов, концентрируют в вакууме на роторном испарителе, сушат в вакууме на роторном испарителе, сушат в вакуум-сушильном шкафу с получением липидно-пигментного комплекса - густого экстракта, затем последовательно экстрагируют этанолом, водно-спиртовой смесью и гидроксидом натрия с получением маннита, сухого экстракта и альгината натрия.

При переработке фукусовых водорослей вида фукуса пузырчатого Fucus vesiculosus для получения липидно-пигментного комплекса (густого экстракта фукуса) экстрагирование осуществляли смесью метиленхлорида со спиртом этиловым в соотношении 94,2:5,8% в аппарате Сокслета. Для получения маннита водорослевый шрот экстрагировали методом перколяции 85-90% этанолом с принудительной циркуляцией экстрагента через каждый час настаивания в течение 3-5 часов. Для получения сухого экстракта фукуса оставшийся шрот экстрагировали методом циркуляционной перколяции 5-15%-ным водным этанолом, pH=1-2. Время настаивания 6-9 ч, температура 40-60°C. Затем концентрируют в вакууме на роторном испарителе и сушат в вакуум-сушильном шкафу.

Способ получения сухого экстракта фукуса, обладающего антикоагулянтным действием, для целей настоящего изобретения заключается в следующем.

По заявляемому способу шрот водорослей экстрагировали 5-15%-ным водным этанолом при pH=3-4 методом перколяции с ультразвуковой обработкой. Время экстракции 4-6 ч, температура 30-40°С. Источник ультразвука закрепляли на корпусе экстрактора-перколятора с наружной его стороны. Во время настаивания проводили периодическое (каждый час) включение установки на 15-20 мин. Затем вытяжку фильтровали и концентрировали на ультрафильтрационной установке. Сушили в распылительной сушилке. Результат - сухой экстракт фукуса представляет собой порошок от светло коричневого до темно-коричневого цвета, содержащий фукоидан, полифенолы, легко растворимый в воде с образованием вязких растворов бурого цвета, физико-химические характеристики которого представлены в табл.1.

При этом происходит интенсификация процесса извлечения целевых компонентов (полисахаридов, полифенолов и др.), сокращается общее время экстрагирования. За счет локального нагрева во время ультразвуковой обработки температура процесса экстракции также может быть снижена. Сокращено общее время экстрагирования, реакция среды заменена с кислой на слабокислую, определены оптимальные условия проведения экстракции - время и температурный режим. Таким образом, условия перколяции фукуса отличаются от аналога методом, температурой, pH, временем. В результате произошло изменение химического состава действующих веществ в вытяжке, и в конечном итоге в конечном продукте - сухом экстракте. Экстрагирование с применением ультразвука ускоряет процесс экстрагирования из сырья, обеспечивая более полное извлечение действующих веществ - полисахарида фукоидана и полифенолов.

Возникающие ультразвуковые волны создают знакопеременное давление, кавитацию и звуковой ветер. В результате быстрее происходит набухание материала и растворение содержимого клетки, увеличивается скорость обтекания частиц сырья, в пограничном диффузионном слое возникают турбулентные и вихревые потоки. Молекулярная диффузия внутри частиц материала и в пограничном диффузионном слое практически заменяется конвективной, что приводит к интенсификации массообмена. В результате кавитации происходит разрушение клеточных структур, что ускоряет процесс перехода действующих веществ в экстрагент за счет их вымывания.

Применение ультразвука позволяет получить вытяжку от нескольких минут до нескольких часов в зависимости от эффективности его использования, которая зависит от параметров процесса: интенсивности и экспозиции озвучивания, выбора экстрагента, соотношения сырья и экстрагента и др. Наиболее оптимальная температура при озвучивании не выше 30-60°C, во избежание образования пузырьков воздуха, гасящих ультразвуковые волны. В качестве экстрагента предпочтительны спиртоводные смеси с высокой концентрацией этанола, который ингибирует окислительно-восстановительные процессы, имеющие место в ультразвуковом поле. Для многих видов сырья оптимальная интенсивность ультразвука (с частотами 2·10⁴-2·10⁸ с^-1) находится в интервале 1,5-2,3·10⁴ Вт/м². Для получения заявляемого экстракта использовалась средняя интенсивность ультразвука - 2·10⁴ Вт/м². Именно такое сочетание условий экстрагирования и способов обработки вытяжки привело к получению нового продукта - полисахаридно-полифенольного сухого экстракта фукуса, характеризующегося определенным химическим составом, технологическими свойствами, и, главное, усилением антикоагулянтного действия в составе мази.

Подтверждение возможности получения данным способом заявленного технического результата - сухого экстракта фукуса, обладающего антикоагулянтным действием, приводится в следующих конкретных примерах.

Пример 1.

Сухие измельченные слоевища фукуса пузырчатого Fucus vesiculosus экстрагировали азеотропом метиленхлорид - этиловый спирт в аппарате Сокслета 6 ч. Вытяжку концентрировали, сушили. Шрот водорослей экстрагировали методом перколяции этанолом 85% при температуре 65°C, время настаивания 5 ч. Вытяжку фильтровали, концентрировали в вакууме на роторном испарителе. Кристаллизовали при 0÷+4 C в течение 24 ч. Маннит фильтровали на нутч-фильтре и сушили, очищали методом колоночной хроматографии с использованием оксида алюминия. Шрот водорослей экстрагировали методом перколяции с ультразвуковой обработкой 5%-ным водным этанолом, pH=3-4. Время настаивания 4 ч, температура 40°C. Включение ультразвука (интенсивность 2·10⁴ Вт/м²) производили по 15 минут каждый час настаивания. Вытяжку фильтровали, концентрировали на ультрафильтрационной установке и сушили в распылительной сушилке. Далее шрот обрабатывали 1,5% раствором карбоната натрия с последующим получением альгината натрия

Полученный сухой экстракт фукуса содержит нейтральные моносахариды - фукозы 41%, ксилозы 2,4%, маннозы 3,1%, галакозы 4,5%, глюкозы 2,2%, уроновых кислот 3,4%, полифенолы 18% и сульфаты 21%.

Пример 2.

Сухие измельченные слоевища фукуса пузырчатого Fucus vesiculosus экстрагировали азеотропом метиленхлорид - этиловый спирт в аппарате Сокслета 6 ч. Вытяжку концентрировали, сушили. Шрот водорослей экстрагировали методом перколяции этанолом 85% при температуре 65°C, время настаивания 5 ч. Вытяжку фильтровали, концентрировали в вакууме на роторном испарителе. Кристаллизовали при 0÷+4 С в течение 24 ч. Маннит фильтровали на нутч-фильтре и сушили, очищали методом колоночной хроматографии с использованием оксида алюминия. Шрот водорослей экстрагировали методом перколяции с ультразвуковой обработкой 15%-ным водным этанолом, pH=3-4. Время настаивания 6 ч, температура 30°C. Включение ультразвука (интенсивность 2·10⁴ Вт/м²) производили по 20 минут каждый час настаивания. Вытяжку фильтровали, концентрировали на ультрафильтрационной установке и сушили в распылительной сушилке. Далее шрот обрабатывали 1,5% раствором карбоната натрия с последующим получением альгината натрия

Полученный сухой экстракт фукуса содержит нейтральные моносахариды - фукозы 43%, ксилозы 2,1%, маннозы 3,5%, галакозы 4,2%, глюкозы 2,0%, уроновых кислот 3,1%, полифенолы 20% и сульфаты 25%.

Новый продукт представляет собой полисахаридно-полифенольный комплекс, который отличается от полисахаридного комплекса по прототипу химическим составом, технологическими свойствами и фармакологическим действием (антикоагулянтным) (см. таблицы фиг.1 и 2).

Для оценки технологических свойств СЭФ были исследованы фракционный состав, сыпучесть, насыпная масса, остаточная влага образцов экстракта. Фракционный состав сухих экстрактов фукуса, полученных по заявляемому способу и по прототипу, представлен на фиг.3 и 4. Данные демонстрируют существенную зависимость фракционного состава от способа получения и сушки экстракта. Лиофильно высушенный экстракт мелкодисперсный, содержание в нем пылевидной фракции составляет 80,21%. Экстракт, высушенный в распылительной сушилке, имеет большее количество более крупных частиц размером от 0,315 до 0,100 мм (81%), меньшее количество пылевидной фракции 8,1%. Технологические свойства СЭФ, полученных по заявляемому способу и по прототипу, приведены в таблице (см. фиг.5). Таким образом, новый сухой экстракт фукуса за счет применения распылительной сушки состоит из фракций с более крупными частицами, что делает его более технологичным продуктом, менее пылеобразующим, что очень важно для производственных операций по дозированию, транспортировке, фасовки и упаковке.

Были проведены испытания фармакологической активности экстракта.

1. Острая токсичность.

Определение острой токсичности экстракта проведено в аккредитованном Испытательном лабораторном центре Института травматологии и ортопедии им. P.P. Вредена методом Кербера (Беленький, 1963) с учетом рекомендаций фармакологического комитета по изучению общетоксического действия веществ (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ. Под ред. Фисенко Ф.П. Изд. Минздрава РФ. 2000. 400 с.)

Сухой экстракт фукуса (СЭФ) в виде 1% водного раствора вводили перорально белым мышам самцам с массой тела 18-20 г.Животные находились в условиях вивария при свободном доступе к воде. Введение экстракта в виде 1% водного раствора осуществляли зондом в желудок натощак в дозах 250 мг/кг; 625 мг/кг; 1250 мг/кг; 2500 мг/кг. Срок наблюдения за животными - 2 недели. Расчет LD₅₀ по Керберу проводили по формуле:

,

где LD₅₀ - доза изучаемого вещества, которая вызывает гибель 50% группы животных;

LD₁₀₀ - доза изучаемого вещества, которая вызывает гибель всей группы животных;

d - интервал между каждыми двумя сложными дозами;

z - среднее арифметическое из числа животных, у которых наблюдался эффект под влиянием двух смежных доз;

m - число животных в каждой группе.

Гибели животных не отмечено, а также клинических признаков интоксикации: общее состояние, поведение, состояние шерстного покрова, поедание корма в опытной группе не отличалось от интактной. При вскрытии обнаружено, что внутренние органы, региональные лимфатические узлы у опытных мышей в пределах физиологической нормы, весовые коэффициенты внутренних органов у опытных мышей не имели статистически значимых отличий от аналогичных показателей интактных животных.

Вывод: испытуемый сухой экстракт фукуса относится к IV классу малотоксичных веществ по ГОСТ 12.1.007-76 (ЛД₅₀ при пероральном введении составляет >2500 мг/кг массы тела).

2. Гепариноподобное действие - применение в виде мази. Заявляемая мазь антикоагулянтная, как и известные, включает активное и вспомогательные вещества, в качестве которых используют воду очищенную, эмульгатор и консерванты. В качестве активного вещества используют сухой экстракт фукуса по п.2, полученный способом по п.1. Ниже приведены конкретные примеры изготовленных мазей, включающих заявленный в 3 независимом пункте формулы количественный состав компонентов с различным содержанием ингредиентов. Пример. 1.

Мазь антикоагулянтная содержит следующие компоненты, масс.%:

сухой экстракт фукуса - 10;

ланолин - 10;

оливковое масло - 10;

ТВИН 80 - 1;

консерванты - 1;

вода очищенная - остальное (необходимое количество для получения 100 г готового продукта).

Пример 2.

Мазь антикоагулянтная содержит следующие компоненты, масс.%:

сухой экстракт фукуса - 20;

ланолин - 5;

оливковое масло - 20;

ТВИН 80 - 3;

консерванты - 1,5;

вода очищенная - остальное (необходимое количество для получения 100 г готового продукта).

Пример 3.

Мазь содержит следующее соотношение компонентов, масс.%:

сухой экстракт фукуса - 30;

ланолин - 1;

оливковое масло - 30;

ТВИН 80 - 5;

консерванты - 1,5;

вода очищенная - остальное (необходимое количество для получения 100 г готового продукта).

Пример 4.

Мазь содержит следующее соотношение компонентов, масс.%:

сухой экстракт фукуса - 15;

ланолин - 10;

оливковое масло - 10;

ТВИН 80 - 1;

консерванты - 1;

вода очищенная - остальное.

Все вышеприведенные примеры исполнения мазей обладают антигоагулянтным действием.

Изучение антикоагулянтного (гепариноподобного) действия мази, содержащей в качестве основного действующего вещества сухой экстракт фукуса, полученный по заявляемому способу, в сравнении с зарегистрированным лекарственным препаратом «гепариновая мазь» проведено ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации».

Объектами исследования являлись: экстракт фукуса №1 (по заявляемому способу), экстракт фукуса №2 (по способу прототипа) и препарат сравнения - гепариновая мазь. Целью работы являлось выявление гепариноподобной активности исследуемых экстрактов №1 и №2 в средней и двойной терапевтических дозах и препарата сравнения при накожном нанесении в течение 7 дней (по лечебно-профилактической схеме).

Исследуемые препараты наносили на предварительно освобожденный участок кожи. У животных определяли протромбиновое время (ПВ) и активированное частичное тромбиновое время (АЧТВ) (базовая линия, спустя 7 дней введение). Также у животных определяли вес для коррекции доз исследуемых препаратов. В ходе эксперимента было установлено наличие у экстракта №1 в средней и двойной терапевтических дозах удлинение ПВ и АЧТВ (умеренного резорбтивного действия) сопоставимого с действием препарата сравнения. Побочных эффектов в виде гиперемии и точечных кровоизлияний при применении исследуемых мазей отмечено не было.

Экстракт фукуса №1

Образец предоставлен в стеклянной банке. Образец представляет собой мягкую лекарственную форму темно-коричневого цвета, густой консистенции с характерным запахом водорослей, растворим в воде. Состав препарата: 1 г мази содержит:

Активные вещества - экстракт фукуса №1 - 0,15 г.

Вспомогательные вещества: ланолин, масло оливковое, вода очищенная, эмульгатор, консерванты.

Экстракт фукуса №2

Образец предоставлен в стеклянной банке. Образец представляет собой мягкую лекарственную форму светло-коричневого цвета, густой консистенции с характерным запахом водорослей, растворим в воде. Состав препарата: 1 г мази содержит:

Активные вещества - экстракт фукуса №2 - 0,15 г.

Вспомогательные вещества: ланолин, масло оливковое, вода очищенная, эмульгатор, консерванты

Средство сравнения: «Гепариновая мазь». Состав препарата: 1 г мази содержит: Активные вещества: гепарин натрия - 100 ME, бензокаин (анестезин) - 0,04 г, бензилникотинат - 0,0008 г.

Вспомогательные вещества: глицерин (глицерол); вазелин; стеарин косметический «Д»; масло персиковое; эмульгатор №1; Lanette®; нипагин (метилгидроксибензоат); нипазол (пропилгидроксибензоат); вода очищенная.

Результаты исследований

ПВ и АЧТВ оценивались в 0-й и 7-й дни эксперимента, кровь забиралась из хвостовой вены в эппендорфы. Результаты представлены в таблицах (см. фиг.6 и 7).

Полученные данные демонстрируют небольшое удлинение АЧТВ в ответ на нанесение гепариновой мази в сравнении с базовой линией в 1,3 раза. Подобное умеренное влияние на данный показатель согласно наблюдениям в клинической практике вполне допустимо, и может являться признаком незначительной резорбции.

Экстракт фукуса №1 в средней терапевтической дозе показал такие же результаты, как и препарат сравнения, удлиняя АЧТВ, в сравнении с базовой линией в 1,3 раза, и на 7-й день исследования имел статистически значимые отличия от интактной группы по данному показателю.

Экстракт фукуса №2 не оказал действия на исследуемый показатель.

Из таблицы видно, что применение гепариновой мази и экстракта фукуса №1 в средней и двойной дозе статистически значимо удлиняло протромбиновое время в сравнении с ПВ в интактной группе. И в сравнении с базовым уровнем ПВ в этих группах выросло в 1,4 раза. Что может говорить о наличие влияния на гемостаз исследуемого экстракта фукуса №1.

Экстракт фукуса №2 в обеих дозах влиял на ПВ незначительно, в виде тенденции к удлинению его.

Выводы:

Экстракт фукуса №2 в средней и терапевтической дозах влиял на удлинение времени в виде тенденции.

Экстракт фукуса №1 как в средней, так и в терапевтических дозах статистически значимо увеличивал показатели обоих тестов, действуя аналогично гепариновой мази.

Согласно полученным данным, а именно, показателям времени свертывания крови (ПВ, АЧТВ), у интактных животных не происходило изменение показателей, что подтверждает адекватность методики. Таким образом, экстракт фукуса №1 в исследуемых дозах (15% и 30%) перспективен и рекомендован для дальнейших расширенных доклинических и клинических исследований.

1. Способ получения сухого экстракта фукуса, обладающего антикоагулянтным действием, путем комплексной переработки фукуса пузырчатого Fucus vesiculosus, заключающийся в том, что сухие слоевища водорослей измельчают, экстрагируют смесью метиленхлорида со спиртом этиловым в соотношении 94,2:5,86% в аппарате Сокслета, концентрируют в вакууме на роторном испарителе, сушат в вакууме на роторном испарителе, сушат в вакуум-сушильном шкафу с получением липидно-пигментного комплекса - густого экстракта, затем шрот экстрагируют методом перколяции 85-90%-ным этанолом с принудительной циркуляцией экстрагента через каждый час настаивания в течение 3-5 ч, фильтруют, концентрируют в вакууме на роторном испарителе, кристаллизуют, фильтруют на нутч-фильтре, сушат и очищают методом колоночной хроматографии с использованием оксида алюминия и получают маннит очищенный, затем оставшийся шрот экстрагируют методом перколяции 5-15%-ным водным этанолом, концентрируют, сушат и получают полисахаридный комплекс - сухой экстракт фукуса, затем шрот экстрагируют 1,5%-ным раствором карбоната натрия, обрабатывают серной кислотой, концентрируют на роторном испарителе, очищают диализом через целлофановую мембрану, сушат в вакуум-сушильном шкафу или лиофилизацией и получают полисахарид альгинат натрия, отличающийся тем, что для получения сухого экстракта фукуса шрот водорослей экстрагируют 4-6 ч при температуре 30-40°С и рН 3-4 методом перколяции с ультразвуковой обработкой, которую осуществляют прикрепленным с наружной стороны перколятора источником ультразвука, при этом включение ультразвука производят на 15-20 мин каждый час настаивания, затем вытяжку фильтруют, концентрируют на ультрафильтрационной установке и сушат в распылительной сушилке.

2. Сухой экстракт фукуса, обладающий антикоагулянтным действием, полученный способом по п.1, представляющий собой полисахаридный комплекс, содержащий фукоидан следующего состава: нейтральные моносахариды - фукоза 41-44%, ксилоза 2-2,5%, манноза 3-3,5%, галакоза 4-4,5%, глюкоза 2%, уроновые кислоты 3-3,5%; а также полифенолы 18-20% и сульфаты 21-25%.

3. Мазь антикоагулянтная, включающая сухой экстракт фукуса по п.2, ланолин, масло оливковое, ТВИН 80, консервант, воду очищенную при следующем соотношении компонентов, мас.%:

сухой экстракт фукуса	0,15-30
ланолин	1-10
оливковое масло	10-30
ТВИН 80	1-5
консерванты	1-1,5
вода очищенная	остальное

4. Мазь по п.3, отличающаяся тем, что она содержит следующее соотношение компонентов, мас.%:

сухой экстракт фукуса	0,15
ланолин	10
оливковое масло	10
ТВИН 80	1
консерванты	1
вода очищенная	остальное