Способ диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя и диагностический набор

Способ диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя и диагностический набор

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и касается способа диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя, а также диагностического набора, позволяющего определять состояние вирулентности популяции В.pertussis на основе количественной регистрации событий интеграции IS- элементов в оперон bvgAS бактерий B.pertussis. Уровень техники

Коклюш - инфекционное заболевание человека, передающееся воздушно-капельным путем, вызывается грамотрицательными бактериями В.pertussis и характеризующееся приступообразным судорожным кашлем и высокой летальностью детей раннего возраста. Несмотря на массовую вакцинацию, проводимую во всем мире с начала 1950-х годов прошлого столетия, элиминации возбудителя в популяции не происходит. Ежегодно в мире регистрируется более 48,5 миллионов случаев заболевания коклюш, из которых около 300000 заканчиваются летальным исходом [Mattoo S., James D., Clinical Microbiology Reviews. 2005, v.l8, p.326-382]. В последние годы отмечается значительный рост числа лабораторно подтвержденных случаев заболевания коклюшем и смешанными с коклюшем инфекциями среди подростков и взрослых [Mattoo S., James D. Clinical Microbiology Reviews. 2005, v.18, p.326-382; Wood N., McIntgre P. Pediatric respiratory reviews. 2008, v.9, p.201-212]. В виду высокой контагиозности заболевания (индекс контагиозности - 70-100%), такие больные представляют особую эпидемиологическую опасность в семейных очагах и детских коллективах. Выявлены случаи бессимптомного носительства бактерий В.Pertussis [Mattoo S., James D. Clinical Microbiology Reviews. 2005. v.18, p.326-382; Cherry J.D. Clin. Infect. Dis.1999, v.28 (Suppl.2), p.S112-S117.; Mink С.М, Cherry J. D., Christenson P. et al. Clin. Infect. Dis, 1992, v.l4, p.464-471; Nelson J.D., Am. J. Dis. Child, 1978, v.132, p.371-373; Wood N., Mclntgre P. Pediatric respiratory reviews, 2008. v.9, p.201-212].

Уже на первых этапах изучения патогенеза, эпидемиологии и клиники коклюша было замечено, что наряду с вирулентными бактериями B.pertussis, в процессе развития заболевания выделяются бактерии разной степени вирулентности, отличающиеся по составу агглютиногенов, гемолитической активности и специфической токсичности [Трушина-Туманова Е.Ф. Журнал микробиология, 1949, т.5, стр.61-68; Lacey В.W.J. Hyg., 1960, v.31, p.423-434; Preston N.W. Pertussis today. Pathogenesis and immunity in Pertussis. Ed. by Wardlaw A.C. and Parton R., J.Willey and Sons Ltd., 1988, p.1-18]. Эти факты указывали на возможность накопления бактерий со сниженной вирулентностью в процессе заболевания. Тогда же возникло предположение о существовании у бактерий B.pertussis генетического механизма, регулирующего их вирулентность (фазовые состояния). Более поздние исследования показали, что регуляция вирулентности возбудителя коклюша осуществляется на уровне транскрипции белковых факторов вирулентности (коклюшного токсина, филаментозного гемагглютинина, дермонекротического токсина, агглютиногенов, пертактина и др.), контролируемой продуктами экспрессии оперона bvgAS. Состояние вирулентности возбудителя коклюша (фазовое состояние) определяется функционированием оперона bvgAS. Нарушение его структуры ведет к прекращению синтеза факторов вирулентности и переходу бактерии в авирулентное состояние (фазовый переход) [Gerlach G, Janzen S, Beier D, Gross R. Microbiology, 2004, v.150, p.3715-3729; Mattoo S., James D. Clinical Microbiology Reviews, 2005, v.18, p.326-382]. Высказываются предположения, что фазовые переходы бактерий B.pertussis служат защитным механизмом, позволяющим избежать губительного воздействия иммунной системы хозяина, обеспечить переживание бактерий в организме человека и передачу возбудителя новому хозяину [Kinnear S.М., Boucher Р.Е, Stibitz S., Carbonetti N.Н.J. Bacteriol., 1999, v.181, р.5234-5241; Mattoo S., James D. Clinical Microbiology Reviews, 2005, v.18, p.326-382].

Исследованиями последних 10-15 лет, продемонстрирована возможность переживания бактерий рода Bordetella в различных эукариотических клетках, культивированных in vitro [Banemann A., Gross R. Infect. Immun., 1997, v.65, p.3469-3473; Guzman C.A., Rohde M., Timmis K.M. Infect. Immun., 1994, v.62, p.5528-5537; Lee C.K., Roberts A.L, Finn T.M. et al. Infect. Immun., 1990, v.58, p.2516-2522; Steed L.L., Setareh M., Friedman R.L.. J.Leukocyte BioL, 1991. v.50, p.321-330]. Изучение иммунного ответа организма животных, инфицированных бактериями рода Bordetella, выявило Th1-тип клеточного ответа, характерный для внутриклеточных возбудителей, и показало возможность переживания бактерий этого рода в организме хозяина [Bamard A., Mahon В.Р., Watkins J. et al. Immunology, 1996, v.87, p.372-380; Gueirard P., Minoprio P., Guiso N. Scand. J.ImmunoL, 1996, v.43, p.181-192]. Установлено также, что проникновение бактерий рода Bordetella в эукариотические клетки и переживание в них зависит от наличия у возбудителя специфических факторов адгезии, инвазии и токсинов, определяющих патогенность бактерий [Bassinet L., Gueirard P., Maitre В. et al. Infect and Immun., 2000, v.68, p.934-1941; Guzman C. A., Rohde M., Timmis K.M. Infect. Immun., 1994, v.62, p.5528-5537; Lee C.K., Roberts A.L, Finn T.M. et al. Infect. Immun., 1990, v.58, p.2516-2522; Masure H.R. Microb. Pathog., 1993, v.14, p.253-260].

Наличие в хромосоме бактерий B.pertussis значительного числа IS-элементов, участвующих в формировании делеций, инверсий, псевдогенов, обуславливает высокую степень изменчивости возбудителя коклюша [Parkhill J., Sebaihia M., Preston A. et al. Nat. Genet., 2003. v.35, p.32-40].

В процессе культивирования бактерий B.pertussis на искусственных питательных средах зарегистрировано перемещение IS481 в специфический cctagg сайт оперона bvgAS и выявлена зависимость частоты траспозиции от условий культивирования бактерий [Синяшина Л.Н., Воронцов В.В, Семин Е.Г., и др. Генетика, 2005, т.12, стр.1-9; Sinyashina L.N., Medkova A.Yu., Semin E.G., et al. In "National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH: Frontiers in Research" Ed. Vassil St. Georgiev, Humana Press, Totowa, NJ., 2008, p.227-231].

События перемещения регистрировали с помощью метода ПЦР при использовании фланкирующего праймера, комплементарного последовательности, расположенной слева от сайта CctagG оперона bvgAS, и праймера, комплементарного части последовательности IS481, который в сочетании с фланкирующим праймером способен образовывать продукты амплификации специфического фрагмента ДИК В. pertussis, содержащего инсерцию IS481 в cctagg сайт оперона bvgAS.

Однако описанный подход позволяет лишь регистрировать перемещение IS481 в специфический cctagg сайт оперона bvgAS, но не позволяет определять частоту встречаемости (относительное количество) бактерий, содержащих инсерцию IS481 в cctagg сайте оперона bvgAS исследуемой популяции бактерий возбудителя коклюша.

В публикации WO/2009/055239 описан метод диагностики Bordetella pertussis и Bordetella parapertussis по идентификации последовательностей IS481 и IS 1001, соответственно. Диагностический набор включает праймеры для амплификации фрагментов последовательностей IS481 и IS1001. Данный метод лишь позволяет идентифицировать присутствие или отсутствие Bordetella в биологическом образце по обнаружению присутствия или отсутствия последовательностей IS481 и IS1001 и не позволяет определять состояние вирулентности популяций B.pertussis.

Значительный рост числа лабораторно подтвержденных случаев заболевания коклюшем среди подростков и взрослых во всем мире, в том числе со стертой клинической картиной, выявление бессимптомного носительства бактерий В. pertussis и их внутриклеточного переживания in vivo, а также зависимость этого процесса от состояния вирулентности возбудителя указывают на возможность персистенции бактерий рода Bordetella в организме хозяина и требует совершенствования не только методов лабораторной диагностики коклюша, но и разработки методов анализа его вирулентности.

Раскрытие изобретения

Авторами настоящего изобретения разработан способ диагностики коклюша на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ), который впервые позволяет не только идентифицировать бактерии В. pertussis в клинических образцах, но и количественно характеризовать состояние вирулентности популяций выявленных бактерий возбудителя коклюша.

Следовательно, в одном аспекте изобретение обеспечивает способ диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя, основанный на количественной регистрации интеграции IS-элементов в оперон bvgAS бактерий, предусматривающий осуществление ПЦР-РВ с использованием ПНР реакционной смеси, которая включает две пары праймеров, подходящих для амплификации фрагментов последовательностей IS481 и IS1002, пару праймеров для амплификации последовательности, сформированной в результате инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS, два флуоресцентных зонда, специфичных к последовательностям IS481, IS1002 и последовательностям, сформированным в результате инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvg.

Другой аспект изобретения касается диагностического набора, который позволяет количественно регистрировать события интеграции IS-элементов в оперон bvgAS у бактерий В.pertussis, содержащий ПЦР реакционную смесь, которая включает две пары праймеров, подходящих для амплификации фрагментов последовательностей IS481 и IS1002, пару праймеров для амплификации последовательности, сформированной в результате инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS, два флуоресцентных зонда, специфичных к последовательностям IS481, IS1002 и последовательностям, сформированным в результате инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvg, а также плазмидные ДНК, содержащие клонированные последовательности сформированные в результате инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS, используемые в качестве положительного контроля.

Краткое описание чертежей

Фиг 1. Структура фрагмента хромосомы, содержащего инсерцию IS481 или IS 1002 в cctagg сайт оперона bvg AS В.pertussis.

Заштрихованные прямоугольные стрелки показывают положение интегрированного элемента IS481 или IS1002 в cctagg сайте оперона bvg AS В. Pertussis (обозначен залитыми прямоугольными стрелками).

Маленькими угловыми стрелками обозначено положение праймеров, используемых для амплификации.

Волнистыми линиями обозначено положение ДНК-зондов R6G и Rox 1002, использованных в реакции гибридизации ПЦР-РВ.

Осуществление изобретения

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ диагностики коклюша, позволяющий определять состояние вирулентности популяций бактерий В.pertussis на основе количественной регистрации событий интеграции IS-элементов в оперон bvgAS бактерий, основанный на использовании технологии полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и регистрации продуктов амплификации с помощью гибридизации с флюоресцентными специфическими ДНК-зондами. Предложенный способ предусматривает осуществление ПЦР в реальном времени с использованием трех пар праймеров, причем две пары праймеров используют для амплификации последовательностей IS481 и IS1002, и третью пару - для амплификации фрагментов, сформированных в результате интеграции IS481 и/или IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS В.pertussis, и флуоресцентных зондов, комплементарных к последовательностям IS481 и IS1002, и определение количества авирулентных мутантов В.pertussis, обусловленных инсерциями IS-элементов в cctagg сайт оперона bvgAS.

В одном из предпочтительных воплощений способа используют праймеры и зонды для определения абсолютного количества бактериальных геномов в образце, и абсолютного и относительного количества бактериальных геном-эквивалентов (бактерий), содержащих интеграции IS481 и IS 1002 в cctagg сайте оперона bvgAS В.pertussis, как представлено на Фиг.1 и в таблице 1.

Реакции амплификации специфических фрагментов и гибридизации с ДНК зондами проводят в двух пробирках. Одна пробирка содержит реакционную смесь, в состав которой входят праймеры и зонды для регистрации специфических фрагментов последовательностей IS481 и IS1002 бактерий В.pertussis. Вторая пробирка содержит реакционную смесь, в состав которой входят праймеры и зонды для регистрации последовательностей, сформированных в результате интеграции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS хромосомы бактерий В.pertussis.

Динамика накопления продуктов амплификации в обеих пробирках, регистрируемая по сигналу флюоресценции, позволяет выявлять и определять количество геномов ДНК В.pertussis в исследуемом образце (первая пробирка) и количество геномов B.pertussis, содержащих инсерцию IS481 и/или IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS (вторая пробирка).

Для количественного определения параметров используют градуировочные кривые, созданные в результате ПЦР-РВ стандартных ДНК, содержащих специфические последовательности IS481 и IS1002, и последовательности, сформированные в результате перемещения IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS. В качестве таких ДНК используют плазмидные ДНК, содержащие клонированные специфические фгаменты, участвующие в реакции амплификации. В качестве положительного стандарта для определения количества IS481 и его инсерций в cctagg сайт оперона bvgAS используют плазмидную ДНК, сконструированную в результате клонирования продукта амплификации ДНК В. pertussis Tohama I с праймеров Sf-Bp2 (табл.1). В качестве положительного стандарта для определения количества IS1002 и его инсерций в cctagg сайт оперона bvgAS используют плазмидную ДНК, сконструированную в результате клонирования продукта амплификации ДНК инсерционного мутанта В. pertussis 14.6, содержащего последовательность IS1002 в cctagg сайте оперона bvgAS, с праймеров Sf-Ar (табл.1).

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает диагностический набор, позволяющий определять состояние вирулентности популяций бактерий B.pertussis на основе количественной регистрации событий интеграции IS-элементов в оперон bvgAS бактерий. Диагностический набор согласно изобретению содержит ПЦР реакционную смесь, которая включает две пары праймеров, подходящих для амплификации фрагментов последовательностей IS481 и IS1002, пару праймеров для амплификации последовательности, сформированной в результате инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS, два флуоресцентных зонда, специфичных к последовательностям IS481, IS1002 и последовательностям, сформированным в результате инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvg AS.

Дополнительно диагностический набор может включать плазмидную ДНК, содержащую клонированные последовательности, сформированные в результате инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS, используемые в качестве положительного контроля в процессе градуировки, а также ПЦР буфер, смесь трифосфатов и Taq-полимеразу в комплексе с моноклональными антителами. Диагностический набор согласно изобретению позволяет регистрировать интеграцию обоих IS элементов.

В предпочтительном воплощении диагностический набор согласно изобретению включает праймеры (Вр481-42-Вр111), (Вр 1002-33-Bp111) и зонды (R6G-481 и ROX-1002) для определения количества бактериальных геном-эквивалентов (бактерий) в единице объема образца, как представлено на Фиг.1 и в таблице 1. Праймеры (S_F-Bp111) и специфические флуоресцентные зонды R6G-481 и ROX-1002 согласно изобретению, позволяют регистрировать интеграцию IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS.

С помощью диагностического набора, методом ПЦР РВ исследованы клинические образцы, взятые у детей с лабораторно подтвержденным диагнозами ОРВИ или бактериальная респираторная инфекция; у детей и взрослых с симптомом «длительный кашель»; у детей и взрослых с предварительным диагнозом коклюш; у «практически здоровых» детей и взрослых из семей, в которых выявлены больные коклюшем или смешанной с коклюшем бактериальной или вирусной инфекцией, и у «практически здоровых» пациентов, у которых контактов с больными коклюшем не установлено.

Результаты исследований выявили ДНК B.pertussis в смывах назофарингеальных тампонов у 50% детей с клиническим диагнозом «ОРВИ», у 7% «практически здоровых» детей и взрослых, у 31% «длительно кашляющих» детей, и у 78% взрослых, контактировавших с больными детьми. Высокие показатели регистрации ДНК B.pertussis у детей с клиническим диагнозом «ОРВИ» свидетельствуют о наличии стертой формы коклюша или смешанной с коклюшем инфекции, что в ряде случаев подтверждено результатами бактериологического анализа.

Выявление ДНК возбудителя коклюша методом ПЦР в смывах с назафарингеальных тампонов у «практически здоровых» детей и взрослых, в том числе у персонала учебных заведений и детских лечебных учреждений, указывает на распространенное носительство (персистенцию) возбудителя коклюша. Очевидно, представители этих групп могут являться резервуаром бактерий B.pertussis для наиболее восприимчивых к этой инфекции детей младшего возраста. До 60% заболеваний тяжелой формой коклюша у детей и до 90% смертей приходится на детей в младенческом возрасте, и многие из них получают инфекцию от окружающих их взрослых [Baron S.E., Njamkepo E., Grimprel P. et al. Pediatr. Infect. Dis. J., 1998, v.17, p.412-418; Cherry J.D. Clin. Infect. Dis., 1999, v.28 (Suppl. 2), p.S112-S117; Crowcroft N.S, Booy R, Harrison T. et al.. Arch. Dis. Child, 2003, v.88, p.802-806; Mattoo S., James D. Clinical Microbiology Reviews, 2005, v.18, p.326-382; Wood N., Mclntgre P. Pediatric respiratory reviews, 2008, v.9, p.201-212].

Для анализа состояния вирулентности популяций бактерий B.pertussis, обнаруженных у больных коклюшем, острыми и хроническими респираторными инфекционными заболеваниями верхних и нижних дыхательных путей и у «практически здоровых» людей, обследованных пациентов распределили на три группы. Первая группа включала 4 взрослых и 7 детей с диагнозом коклюш. Во всех случаях количество ДНК возбудителя коклюша, обнаруженное в препаратах смывов с назофарингеальных тампонов, составляло 10⁶-10⁷ молекул в 5 мкл образца. Несмотря на разный возраст и наличие смешанных инфекций, все пациенты имели характерную клиническую картину заболевания коклюшем, в некоторых случаях клинический диагноз был подтвержден бактериологическими исследованиями (15%). Относительное количество инсерций IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvg AS хромосомы бактерий В.pertussis, обнаруженное в соответствии со способом согласно изопбретению, колебалось от 4×10^-6 до 10^-4.

Вторая группа включала 13 пациентов с диагнозом ОРВИ, а также «практически здоровых» взрослых и детей, находившився в контакте с больными, у которых была обнаружена ДНК возбудителя коклюша, содержащая инсерций IS-элементов в cctagg сайт оперона bvgAS с частотой 10^-2-10^-3. Количество ДНК В. pertussis в 5 мкл препарата у пациентов второй группы составляла 10³-10⁴ молекул.

Третья группу составляли 20 обследованных с диагнозом ОРВИ и «практически здоровые» взрослые и дети, контактировавшие с больными ОРВИ, а также «практически здоровые» обследованные, у которых контакты с больными не были выявлены. В исследуемых образцах, взятых у обследуемых этой группы, в 5 мкл раствора ДНК было обнаружено менее 1000 молекул ДНК возбудителя коклюша, содержащих от 10 до 100% инсерций IS-элементов в опероне bvgAS.

Результаты анализа состояний вирулентности популяций бактерий B.pertussis, обнаруженных у выборки больных коклюшем, острыми и хроническими респираторными инфекционными заболеваниями верхних и нижних дыхательных путей и у «практически здоровых» людей представлены в таблице 2 (пример 3).

Таким образом, популяции бактерий возбудителя коклюша у больных с характерной клиникой коклюша, атипичным течением заболевания, респираторными заболеваниями, индуцированными смешанной с коклюшем бактериальной и вирусной инфекцией, и у «практически здоровых» детей и взрослых являются гетерогенными. Они включают бактерии с нативной структурой оперона bvgAS B.pertussis, и авирулентные мутанты, несущие инсерционные элементы в опероне вирулентности. Количество инсерционных авирулентных мутантов у больных с типичной клинической картиной коклюша значительно ниже, чем у больных со стертой клиникой, респираторными заболеваниями, индуцированными смешанной с коклюшем инфекцией, и у «практически здоровых» людей, у которых популяция возбудителя почти полностью состоит из авирулентных бактерий B.pertussis.

Возможно, в результате инсерционного мутагенеза в организме человека накапливаются персистирующие фазовые варианты B.pertussis, вызывающие атипичные формы заболевания. Роль инсерционных мутантов B.pertussis в патогенезе коклюша и респираторных заболеваний, вызываемых смешанными инфекциями, и в формировании бактерионосительства, подтверждена наблюдениями, указывающими на накопление мутантных бактерий у больных в процессе развития заболевания, выявлением их у больных с диагнозом острая респираторная вирусная инфекция (ОРВИ) и обнаружением авирулентных Bvg-мутантов у «практически здоровых» людей (таблица 2, пример 3).

В некоторых случаях, выявлено характерное увеличение количества инсерционных Bvg^-мутантов в динамике развития инфекционного процесса (пример 3). Переход бактерий B.pertussis из вирулентной фазы в авирулентную может привести к его персистенции и носительству возбудителя в иммунорезистентном макроорганизме, формированию исключительно антропонозного источника для инфицирования, прежде всего, наиболее уязвимых детей - новорожденных и в возрасте до одного года.

Получены результаты, указывающие на возможность исключения IS-элементов из последовательности оперона bvgAS, восстановления его структуры и вирулентности возбудителя, и связанного с этим нарастанием инфекционного процесса и развитию заболевания (пример 3). Выявление «практически здоровых» носителей указывает на существование антропонозных источников, являющихся носителями как вирулентных, так и авирулентных бактерий, указывает на то, что возбудитель коклюша может передаваться не только от больного коклюшем, но и от «практически здоровых» носителей.

Способ согласно изобретению позволяет идентифицировать бактерии В.pertussis, вызывающие атипичные и бессимптомные формы заболевания, а также популяции персистирующих бактерий, формирующихся в результате интеграции IS-элементов в оперон bvgAS.

Более того, предложенный способ позволяет идентифицировать возбудителя и определять количество его геном-эквивалентов в исследуемом образце в результате амплификации специфических последовательностей двух IS-элементов (IS481 и IS1002), что, в отличие от известных способов, обеспечивает увеличение специфичности реакции и достоверности результатов диагностики возбудителя. Кроме того, предложенный способ позволяет определять абсолютное и относительное количество авирулентных бактерий В.pertussis, содержащих инсерции IS481 и/или IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS. Определение обеих инсерции позволяет провести корректную оценку состояния вирулентности исследуемой популяции бактерий возбудителя коклюша.

Предложенный способ диагностики стертых форм B.pertussis с использованием диагностического набора в соответствии с изобретением открывает возможность дальнейшего изучения факторов, влияющих на частоту перемещения IS-элементов в бактериях B.pertussis и определения стратегии борьбы с персистенцией возбудителя путем использования мишенных лекарственных препаратов, препятствующих транспозиции IS-элементов, приводящей к формированию аиврулентных бактерий.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, представленными для подтверждения, но не ограничения объема притязаний.

Примеры.

Пример 1. Взятие клинического материала, бактериологическая идентификация B.pertussis и выделение ДНК.

Взятие клинического материала для выделения ДНК В.pertussis проводили с помощью назофарингеальных тампонов типа Dacron. Бактериологический анализ клинического материала проводили в соответствии с Инструкцией по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий (М., 1987). Посев клинического материала проводили на селективную среду КУА. Типирование выделенных культур проводили с помощью специфических сывороток.

Смывы с тампонов центрифугировали и обрабатывали раствором гуанидинтиоцианата. ДНК сорбировали на магнитном сорбентом фирмы «Promega» США, смывали с сорбента деионизованной водой и хранили при -20С°. Образцы для анализа поступали из детского инфекционного отделение ЦКБ, института педиатрии РАМН и ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Пример 2. Выявление ДНК В.pertussis и инсерций IS481 и IS1002 в опероне bvgAS.

Для выявления ДНК В.pertussis и инсерций IS481 и IS1002 в опероне bvgAS B.pertussis в реакции ПЦР-РВ использовали праймеры, представленные в табл.1.

Таблица 1.
Последовательности праймеров и зондов, использованных в работе
Праймер/зонд	Последовательность нуклеотидов	Примечание*
Вр481-42	GAACCGGATTTGAGAAACTGGAAA	IS481
Bp111	GGTCAATCGGGCATGCTTATGG	IS481, IS1002
Вр1002-33	AGGCCGGACCTGGGATG	IS1002
SF	GTCGCTGGTGGAACTGATAG	bvgAS
Вр2	TTCAGGCACACAAACTTGATGGGCG	IS481
Ar	ACGAGGTGCGAGGTGGTCAG	bvgAS
Rox-1002	(ROX)ACCACGCCATCGCAACTCAGGGCA(RTQ2)	зонд IS1002
R6G-481	(R6G)TCGCCGACCCCCCAGTTCACTCAAG(BHQ2)	зонд IS481
* положение праймеров и зондов изображено на фиг.1

Для обнаружения ДНК возбудителя коклюша и определения количества геном-эквивалентов бактерий В.pertussis в образце использовали праймеры Вр481-42 - Вр111, Вр1002-33 - Bp111 и зонды R6G-481, ROX-1002.

Для обнаружения и определения количества инсерций IS481 и IS1002 в опероне bvgAS использовали праймеры (S_F - Bp111) и зонды R6G-481 и ROX-1002.

Количество геном эквивалентов B.pertussis и интеграции IS481 и IS1002 в опероне bvgAS рассчитывали как среднее значение двух величин, определенных по результатам двух соответствующих ПЦР-РВ. При этом, количество геном эквивалентов определяли как среднее значение, рассчитанное в результате ПЦР-РВ матриц IS481 и IS 1002. ПЦР-РВ проводили на приборе АНК 32™ (Россия) по циклограмме: 95 С - 5 мин., (95 С - 20 с, 62 С - 50 с) - 50 циклов. Реакционная смесь объемом 25 мкл. включала реакционный KCl-ПЦР-буфер, 2,5 мкМ MgCl₂, 250 мкМ каждого из dNTP, 5 пмоль соответствующего зонда, 7,5 пмоль каждого праймера, 2,5 ед. А-Taq-полимеразы и 5 мкл образца ДНК.

Реакции амплификации специфических фрагментов и гибридизации с ДНК зондами проводили в двух пробирках.

Первая пробирка содержала реакционную смесь, в состав которой входили праймеры и зонды для регистрации специфических фрагментов последовательностей IS481 и IS1002 В.pertussis (Вр481-42-Bp111, Вр1002-33-Bp111 и зонды R6G-481, ROX-1002).

Вторая пробирка содержала реакционную смесь, в состав которой входили праймеры и зонды для регистрации последовательностей, сформированных в результате интеграции IS481 и IS 1002 в cctagg сайт оперона bvgAS хромосомы бактерий В.Pertussis (праймеры Sp-Bp111 и зонды R6G-481, ROX-1002).

Положительная динамика изменения флуоресценции в процессе амплификации в первой и второй пробирках и значение пороговых циклов соответствующих реакций указывают на наличие исследуемой матрицы и позволяют определить ее количество с использованием калибровочным кривых, построенных по результатам ПЦР серии разведении стандартных ДНК р481 и р1002 известной концентрации.

Калибровочные кривые для определения количества геном-эквивалентов В.pertussis в образце строятся по результатам ПЦР-РВ ДНК р481 и р1002 с праймерами Вр481-42-Вр111, Вр1002-33-Bp111 и зондами R6G-481, ROX-1002.

Аналогичные кривые для определения количества инсерций IS481 и IS1002 в cctagg сайте оперона bvgAS строили по результатам реакции ПЦР-РВ ДНК р481 и р1002 с праймерами (S_F - Bp111) и зондами R6G-481 и ROX-1002.

Относительное количество молекул ДНК В.pertussis, содержащих инсерций IS481 или IS1002 в cctagg сайте оперона bvgAS, определено из соотношений количество инсерций IS481/количество геном-эквивалентов В.pertussis и количество инсерций IS1002/количество геном-эквивалентов В.pertussis, соответственно.

Таким образом, использование мультиплексных праймеров в реакции ПЦР-РВ согласно изобретению, позволяет выявлять и количественно учитывать авирулентные мутанты В.pertussis, возникающие в результате инсерций IS-элементов в cctagg сайт оперона вирулентности.

Пример 3. Характеристика популяций бактерий В.pertussis, обнаруженных в смывах с назофарингеальных тампонов, взятых от больных коклюшем, другими инфекционными респираторными заболеваниями и у «практически здоровых» людей.

Для анализа с помощью ПЦР-РВ использованы ПЦР-положительные образцы ДНК, выделенные из смывов с назафарингеальных тампонов, взятых от больных с диагнозом коклюш, другими инфекционными респираторными заболеваниями и «практически здоровых» людей, контактировавших и не контактировавших с больными коклюшем. ПЦР-РВ проводили, как описано в примере 2.

ПЦР-положительные образцы, содержащие в 5 мкл 10³-10⁵ молекул ДНК человека были использованы для дальнейшего изучения. Для определения относительного количества ДНК B.pertussis, содержащих инсерцию IS-элементов в cctagg сайт оперона bvgAS, анализировали также образцы, в 5 мкл которых обнаружено менее 10³ молекул ДНК человека и выявлена ДНК B.pertussis, содержащая инсерции IS-элементов.

Для анализа фазового состояния бактерий B.pertussis, обнаруженных у больных коклюшем, респираторными инфекционными заболеваниями и у «практически здоровых» людей, ДНК B.pertussis, обнаруженная у представителей всех упомянутых выше групп, была проанализирована на наличие IS-элементов в cctagg сайт оперона bvgAS.

По результатам ПЦР-РВ обследованных распределили на три группы (таблица 2). Первая группа (7 детей и 4 взрослых) включала пациентов, у которых обнаружено наибольшее количество копий ДНК B.pertussis - 10⁶-10⁷ молекул в 5 мкл образца и относительное количество инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS В.pertussis составляло 5×10^-5 и менее. Бактерии в популяции в подавляющем большинстве находились в вирулентном состоянии. Независимо от возраста и сопутствующих инфекций в этой группе наблюдали типичную клиническую картину коклюша. В отличие от предложенного способа, стандартный способ диагностики коклюша, предусматривающий бактериологический анализ клинического материала, позволил идентифицировать возбудителя коклюша только в 30% случаев. При повторном обследовании этих больных через 3 недели выявили 10-ти кратное увеличение доли инсерционных мутантов на фоне незначительного изменения количества ДНК B.pertussis, что свидетельствует о накоплении бактерий в авирулентном состоянии.

Ко второй группе отнесли 13 обследованных с острыми и хроническими респираторными инфекциями верхних и нижних дыхательных путей, «длительно кашляющих» и «практически здоровых» взрослых и детей и членов семей, контактировавших с больными коклюшем, в образцах которых было обнаружено 10³-10⁴ молекул ДНК В.pertussis, содержащих 0,1-1,0% IS-элементов в опероне вирулентности bvgAS.

Наибольший интерес представляла динамика накопления бактерий в авирулетном состоянии у взрослого пациента, обратившегося за консультацией по поводу уточнения причины длительного кашля, продолжавшегося более четырех недель. Микробиологическая идентификация клинического образца выявила бактерии В.pertussis, Str.viridians, Candida albicans. Методом ПЦР-РВ было выявлено 50% бактерий B.pertussis в авирулентном состоянии. При обследовании после курса антибиотикотерапии было зарегистрировано увеличение количества ДНК B.pertussis в 100 раз, причем частота инсерций IS481 в cctagg сайте оперона bvgAS составляла 10^-4. Инсерций IS1002 в опероне bvgAS обнаружено не было. Возможно, в результате проведенного курса антибиотикотерапии произошло исключение IS-элементов из cctagg сайта оперона bvgAS и переход значительной части популяции бактерий в вирулентное состояние в связи с вероятной резистентностью B.pertussis к данному антибиотику.

Третью группу составили пациенты, у которых от 10 до 100% бактерий B.pertussis в популяции содержали инсерцию IS-элементов в опероне bvgAS. Суммарное число бактерий B.pertussis в 5 мкл образца колебалось от нескольких десятков до нескольких сотен. В эту группу вошли «практически здоровые» взрослые, контактировавшие и не контактировавшие с больными респираторными инфекциями. К этой группе отнесли также взрослую пациентку и ребенка с симптомом «длительный кашель», при повторном обследовании которых выявлено увеличение доли бактерий (с 1,4% до 90%) в авирулентном состоянии. Полученный результат указывает на то, что «длительный кашель» может быть следствием коклюша, протекающего в стертой форме. Подобное нарастание доли бактерий в авирулентном состоянии выявили и у больных типичной формой коклюша на поздних стадиях заболевания.

Таблица 2.
Анализ фазового состояния бактерий B.pertussis, выделенных от больных с различными диагнозами и от «практически здоровых» детей и взрослых
Группы обследованных пациентов	Клинический диагноз	Лабораторная диагностика коклюша
Метод ПЦР (% обнаруженной ДНК B.pertussis)	Метод ПЦР-РВ	Бактериологический метод
Абсолютное количество бактерий В.pertussis	Относительное количество инсерций (N)	% выявления бактерий В.pertussis	% выявления других бактерий
N IS481	N IS1002
Первая группа	Коклюш	100%	4-9*106-107	2-7*10-7-10-5	4-6*10-5-10-4	-30%	-15%:
St.saprophyticus, St.epidermidis, Sir. pneumoniae, St. aureus
Вторая группа	Острые и хронические респираторные инфекции, «длительный кашель», «практически здоровые» взрослые*	60%	2-3*104-106-107	1,3-6,2*10-3	10-2	<15%	>40%:
St.epidermidis, Candida albicans, Sir. pneumoniae, Str. Viridians, Str. pyogenes, H.influenzae, Chl. pneumoniae, Klebsiella pneumoniae
Третья группа	ОРВИ и смешанная бактериальная инфекция, «практически здоровые» взрослые**	50%	3-6*101-104	1,0-1,6-3*10-2		0-5%	>20%:
P.mirabilis, Str. pneumoniae, Sfr. viridans, Candida albicans, St. aureus, E.faecium, Chl. pneumoniae, Klebsiella pneumoniae
* контактировавшие с больными коклюшем;** контактировавшие и не контактировавшие с больными коклюшем

Таким образом, способ в соответствии с изобретением, впервые позволил обнаружить, что популяции возбудителя коклюша у больных с характерной клиникой, у больных со стертой клиникой коклюша, респираторными заболеваниями, индуцированными смешанной с коклюшем бактериальной и вирусной инфекцией, представлены как вирулентными, так и авирулентными бактериями B.pertussis, содержащими инсерцию одного из IS-элементов в опероне вирулентности. При этом, у больных с типичной клиникой коклюша обнаружены, главным образом, вирулентные бактерии с нативной структурой оперона вирулентности, тогда как больные со стертой формой заболевания, а также больные острыми и хроническими респираторными инфекциями верхних и нижних дыхательных путей, у которых обнаружен возбудитель коклюша, и «практически здоровые» дети и взрослые содержат разное количество авирулентных бактерий В.pertussis.

1. Способ диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя коклюша, предусматривающий осуществление полимеразной цепной реакции в режиме реального времени и регистрацию продуктов амплификации с помощью гибридизации с флюоресцентными специфическими ДНК-зондами, отличающийся тем, что определяют количество бактериальных геномов в образце по наличию последовательностей IS481 и IS 1002 в хромосоме бактерий В.pertussis, и определяют количество авирулентных мутантов возбудителя по наличию инсерции IS481 или IS 1002 в cctagg сайте оперона bvgAS В.pertussis, причем осуществляют полимеразную цепную реакцию с использованием ПЦР реакционной смеси, которая включает две пары праймеров, подходящих для амплификации фрагментов последовательностей IS481 и IS 1002, пару праймеров для амплификации последовательности, сформированной в результате инсерции IS481 и IS 1002 в cctagg сайт оперона bvgAS В.pertussis, два флуоресцентных зонда, специфичных к последовательностям IS481, IS1002 и последовательностям, сформированным в результате инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS В.pertussis.

2. Способ диагностики по п.1, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют последовательности, комплементарные, по крайней мере, 18 последовательным нуклеотидам последовательности, расположенной слева от сайта cctagg оперона bvgAS В.pertussis, и последовательности, комплементарные, по крайней мере, 18 последовательным нуклеотидам последовательности IS481 и/или IS 1002.

3. Способ диагностики по п.1, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют последовательности GAACCGGATTTGAGAAACTGGAAA-TTCAGGCACACAAACTTGATGGGCG (Bp481-42-Bp111), AGGCCGGACCTGGGATG-TTCAGGCACACAAACTTGATGGGCG (Bp1002-33-Bp111) и GTCGCTGGTGGAACTGATAG-TTCAGGCACACAAACTTGATGGGCG (Sf-Bp111).

4. Диагностический набор для диагностики коклюша и определения авирулентных мутантов возбудителя коклюша, содержащий ПЦР-реакционную смесь, отличающийся тем, что ПЦР-реакционная смесь включает две пары праймеров, подходящих для амплификации фрагментов последовательностей IS481 и IS1002, пару праймеров для амплификации последовательности, сформированной в результате инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS, два флуоресцентных зонда, специфичных к последовательностям IS481, IS1002 и последовательностям, сформированным в результате инсерции IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvg.

5. Диагностический набор по п.4, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют последовательности GAACCGGATTTGAGAAACTGGAAA-TTCAGGCACACAAACTTGATGGGCG (Вр481-42-Bp111), AGGCCGGACCTGGGATG-TTCAGGCACACAAACTTGATGGGCG (Bp1002-33-Bp111) и GTCGCTGGTGGAACTGATAG-TTCAGGCACACAAACTTGATGGGCG (Sf-Bp111), и в качестве зондов используют п