Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека

Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека

Реферат

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса.

Известен способ иммуноферментного определения функциональной активности компонента С3 [1], который предусматривает сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулина G, затем внесения в лунки микропанели комплемента морской свинки, служащего в качестве источника компонентов С1, С2 и С4 (присутствующий компонент С3 морской свинки не обнаруживается специфическими антителами против С3 человека) и анализируемой пробы, содержащей компонент С3 человека с неизвестной активностью, и проведения инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит связывание С3 на молекулах активатора - сорбированного иммуноглобулина. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 человека определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3, конъюгированных с ферментом.

Известен также способ [2], позволяющий определять функциональную активность компонента С3 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата дерината для использования в качестве активатора классического пути комплемента и заменой комплемента морской свинки гомологичным реагентом R3 - сыворотки крови человека, лишенной активности С3.

Наконец, для активации компонента С3, необходимой для связывания на микропанели с последующим определением количества связавшегося теми же приемами, в способе [3] используется альтернативная С3 конвертаза, формируемая в результате активации альтернативного пути с помощью сорбируемого на микропанели лизоцима - активатора альтернативного пути и реагента R3, как источника факторов В и D человека, необходимых для формирования С3 конвертазы альтернативного пути комплемента.

Недостатком всех этих способов является участие в процессе активации компонента С3, С3 конвертазы, формируемой из компонентов комплемента морской свинки в первом случае, либо из компонентов или факторов комплемента реагента R3, во втором и в третьем случаях, поскольку при проведении определения активности компонента С3 в сыворотках крови неизбежно создаются условия активации комплемента по классическому или альтернативному пути, что затрагивает и другие компоненты комплемента и может приводить к их неспецифической сорбции на поверхности лунок микропанели.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента С3 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата тромбина для использования в качестве активатора компонента С3 без активации комплемента и без применения источников других компонентов или факторов комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения и набора. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата тромбина, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесение в лунки микропанели раствора, содержащего компонент С3 комплемента человека с неизвестной активностью, проведение инкубации в присутствии этилендиаминатетраацетата натрия (ЭДТА) для блокирования всех путей активации комплемента, в ходе которой происходит активация функционально активного С3 и ковалентное связывание последнего на сорбированном тромбине, выливание содержимого лунок, а затем внесение конъюгата фермента с антителами против компонента С3 человека, отмывание несвязавшегося конъюгата, внесение субстрата конъюгиро-ванного фермента и проведение расчета активности компонента С3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Тем самым достигается определение функциональной активности С3 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным тромбином, конъюгат фермента с антителами к компоненту С3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью С3 в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов и отсутствием необходимости активации всей системы комплемента.

Пример 1. Иммуноферментное определение функциональной активности компонента С3 комплемента человека. Растворяют препарат тромбина быка в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, с конечной концентрацией 100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Три раза отмывают микропанель 0,2 М натрий-фосфатным буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 50 мМ ЭДТА (эти-лендиаминтетраацетат натрия), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл того же буферного раствора, содержащего ЭДТА. В лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый компонент С3 в том же буфере. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трехкратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество активного компонента С3 рассчитывают по стандартной кривой (рис.1).

На рис.1 представлено определение функциональной активности компонента С3 комплемента человека методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента СЗ. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным тромбином, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту СЗ комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известным содержанием активного компонента С3 в качестве стандарта. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента С3 с коэффициентом корреляции R=0.9998, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента С3 в концентрациях от 0,6 мкг/мл описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Козлов Л.В., Романов С.В., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека по классическому пути. 2005. Патент РФ 2251697. Бюл. №13. 10.05.2005.

2. Козлов Л.В., Гора Н.В., Бичучер A.M. Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека. Патент РФ 2417375. Бюл. №12. 27.04.2011.

3. Козлов Л.В., Гора Н.В. Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента С3 комплемента человека по альтернативному пути активации. Патент 2380707. 27.01.2010.

1. Способ иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека, отличающийся тем, что в лунках микропанели сорбируют тромбин, затем в лунки микропанели вносят анализируемую пробу, содержащую компонент C3 комплемента человека с неизвестной активностью, проводят инкубацию в присутствии этилендиаминтетраацетата натрия, выливают содержимое лунок, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента C3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности компонента C3 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента C3 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным тромбином, конъюгат фермента с антителами к компоненту C3 комплемента человека, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови с известной активностью С3 в качестве стандарта.