Способы получения волосяных микрофолликулов и de novo сосочков и их применение для in vitro тестов и in vivo имплантаций

Способы получения волосяных микрофолликулов и de novo сосочков и их применение для in vitro тестов и in vivo имплантаций

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение касается способа получения волосяных микрофолликулов совместным культивированием de navo сосочков с другой клеточной популяцией волосяного фолликула в сосудах с ультранизким прикреплением культуры. Данное изобретение также касается способа получения de novo сосочков, применяемых в способе получения волосяного микрофолликула. Целью данного изобретения также являются волосяные микрофолликулы и de novo сосочки, полученные вышеупомянутыми способами. Волосяные микрофолликулы и/или de novo сосочки можно использовать как имплантаты для лечения состояния уменьшения волос и для in vitro тестирования модулирующих волосы эффектов или токсических эффектов веществ.

Из-за критической роли, которую волос играет в невербальном общении человека, пострадавшему индивидууму требуется помощь, когда рост волос уменьшается. Конечная терапия, конечно, заключается в восстановлении или регенерации новых, здоровых, циклических волосяных фолликулов. До недавнего времени медицина не могла предложить какое-либо действенное лечение таким пациентам. В двадцатом веке имелись в продаже некоторые лекарственные средства, которые, однако, слабо и несовместимо стимулировали рост волос. Примерами являются миноксидил, финастерид и латанопрост. Сложный тайминг и бесчисленные изменения экспрессии генов, необходимых для управления развитием волосяных фолликулов и циклирования, вероятно, препятствуют простому фармацевтическому подходу к лечению развившейся алопеции. Следовательно, эти эффекты не достигают конечной цели образования новых волосяных фолликулов на лишенной волос коже головы. Использующая типы клеток, известные как формирующие волосяной фолликул, основанная на клетках терапия будет признана в клинике скорее, чем чисто молекулярный подход.

Один подход основанной на клетках волосяных фолликулов терапии будет заключаться в удалении небольшого числа волосяных фолликулов, выделении компетентных и/или индуктивных клетки из них, а затем наращивании этих клеток ex vivo при поддерживании их особой способности образовывать новые волосяные фолликулы. Очевидно, необходимы условия клеточной культуры, которые поддерживают индуктивную способность кожных фолликулярных клеток и компетентность эпителиальных клеток волосяных фолликулов, чтобы основанная на клетках любого типа терапия алопеции могла развиваться. Поскольку ранние исследования показали, что индуктивная способность кожных клеток ослабевает со временем in vitro, изучение сосредотачивалось на поддерживании трихогенных свойств клеток волосяных фолликулов в культуре. Большое количество недавних достижений являются результатом успехов методологии культур для интактных волосяных фолликулов и их клеточных компонентов. Человеческие клетки волосяных фолликулов, растущих в культуре, включают фибробласты фолликулярных сосочков, кератиноциты наружной корневой оболочки (ORS) и герминативные эпидермальные клетки из волосяной матрицы (Tobin et al., J. Invest. Dermatology 104(1), 86-88, 1995).

Целью текущих биоинженерных усилий является образование или воссоздание полностью организованных и функциональных систем органов, начинающихся от диссоциированных клеток, которые размножены при определенных условиях тканевых культур. Уже давно признано, что волосяной фолликул обладает сильной регенеративной способностью, заключающейся в том, что он проходит цикл развития за время жизни индивидуума и воспроизводит свою нижнюю половину цикл за циклом. Фибробласты кожного волосяного сосочка и соединительнотканевой оболочки подобны стволовым клеткам по характеру и обладают специфическими индуцирующими рост волоса свойствами. Волосяной фолликул восстанавливает себя посредством взаимодействий между компетентными эпителиальными стволовыми клетками и мощными индуктивными кожными клетками в течение их цикла роста. Можно воспроизвести полный волосяной фолликул из эпителиальных и мезенхимальных стволовых клеток волосяных фолликулов.

Основные трудности, которые необходимо преодолеть с любым типом основанного на клетке лечения алопеции, включают эффективность формирования волосяных фолликулов и выбор типа клеток, которые подытожены Stenn & Cotsarelis, Curr. Opinion Biotech. 16, 493-497, 2005. Для биоинженерии волосяного фолликула можно было бы начать с кожных элементов из диссоциированных фолликулов с или без компетентных клеток из фолликула или других эпителиальных источников. Ряд диссоциированных клеток можно наращивать в культуре, а затем кожные клетки отдельно или в комбинации с компетентными эпителиальными клетками повторно вводить в лысеющую кожу головы. Предшествующие исследования показали, что из правильно помещенных индукторных кожных клеток будут формироваться новые фолликулы. Кроме того, из комбинации диссоциированных или агрегированных, трихогенных эпителиальных и кожных клеток, как также доказано, эффективно получаются новые волосяные фолликулы.

Первые попытки в основанных на клетках подходах в лечении алопеции заключаются в применении аутологической ткани для биоинженерии волосяных фолликулов, чтобы избежать иммунного отторжения донорных клеток. Однако, существует вероятность, что гетерологичную (аллогенную) ткань волосяного фолликула можно было бы разработать для тканевой трансплантации на основе концепции, что волосяной фолликул является иммунно-привилегированным участком, который не экспрессирует антигены класса I MHC (главный комплекс гистосовместимости). Тем не менее, безопасное тестирование и нормативные препятствия для подхода такого типа потребует огромных финансовых ресурсов.

Другой возможный подход биоинженерии волосяных фолликулов включает фактически формирование волосяных фолликулов как мини органов in vitro, a затем трансплантацию заново образованных фолликулов обратно на лысеющую кожу головы. Из патента Германии №10162814 В4 известно, что эквивалент кожи и волоса может быть получен путем обеспечения псевдодермиса или препарата псевдодермиса, а также псевдососочков, включая культивированные клетки кожных сосочков на приемлемом носителе или в приемлемой матрице, или псевдососочковых предшественников, включая культивированные клетки кожных сосочков на приемлемой формирующей матрицу среде, способной формировать матрицу in situ, и введения псевдососочков или псевдососочкового предшественника в псевдодермис или препарат псевдодермиса. Для подхода такого рода будет требоваться намного более сложная система клеточной культуры, включающая трехмерные матрицы, возможно встроенные с соответствующими ростовыми факторами, чтобы позволить и кожным, и эпидермальным клеткам дифференцироваться для трехмерной структуры нормального волосяного фолликула. В частности, структура сосочка получается только путем формирования полостей, например, путем перфорирования или пробивания, в указанном псевдодермисе и помещения туда указанных псевдососочков, которые сформированы так, что их размеры соответствуют полостям, сформированным в PD. В подходе отсутствует свободная организация клеток в приблизительной физиологической структуре сосочка, а также прямые клеточные контакты.

Недавно был показан другой способ получения популяции мультипотентных стволовых клеток или их потомства, которые происходят от волосяного фолликула или его части, содержащей кожный сосочек. Способ по WO 2005/071063 А1 включает культуру указанного волосяного фолликула или части, содержащей кожный сосочек, в условиях, при которых мультипотентные стволовые клетки растут и пролиферируют неприкрепленными. Кожные сосочки не получаются с помощью этой процедуры, но выделенные мультипотентные стволовые клетки непосредственно используются для индуцирования роста волоса или регенерации кожи у млекопитающего. Однако, также признается в этом документе, что определенное количество прикрепленных клеток сформировано по WO 2005/113747 А2, которая раскрывает способ получения многоклеточных совокупностей, по меньшей мере, от двух мультипотептных или плюрипотентных типов зрелых стволовых клеток путем культивирования в стерильных условиях. В настоящее время органоидные тела ограничены вышеупомянутыми стволовыми клетками, собранными из экзокринной железистой ткани.

Поэтому, техническая проблема, составляющая основу данного изобретения, заключается в преодолении вышеупомянутых недостатков известного уровня техники и в обеспечении способа образования восстановленного волосяного фолликула и сосочов, которые свободно и легко принимают размер и форму физиологического кожного сосочка (DP). Другой проблемой, которой занимается данное изобретение, является поиск эквивалента волоса или заместителя кожи, которые были бы приемлемыми как in vitro модель, конкретнее для тестирования и/или оценивания активных веществ, наиболее конкретно в волосяном фолликуле.

Данное изобретение решает проблему путем обеспечения способа получения волосяного микрофолликула млекопитающего, включающего этапы, на которых:

(a) обеспечивают, по меньшей мере, один de novo сосочек,

(b) обеспечивают, по меньшей мере, одну другую клеточную популяцию, выбранную из группы, включающей фибробласты, кератиноциты и меланоциты, и

(c) совместно культивируют de novo сосочек, по меньшей мере, с одной другой клеточной популяцией при условиях неприкрепленной культуры.

Выражения "de novo сосочки" или "неососочки" применяются в данном документе взаимозаменяемо и означают клеточные совокупности фибробластов кожного волосяного сосочка (DPF) млекопитающих, которые имеют, по меньшей мере, половину размера и приблизительную форму физиологического кожного сосочка (DP) волосяного фолликула после выделения. De novo сосочки могут включать покрытие, включающее один или множество разных внеклеточных матричных белков, предпочтительно коллаген IV, фибронектин и/или ламиниы. Такое покрытие может быть образовано с помощью кожного волосяного сосочка (DPF), которые сами формируют de novo сосочек, или может быть добавлено на любой стадии перед тем, как de novo сосочки будут совместно культивироваться согласно этапу (с) способа получения волосяных микрофолликулов.

Выражения "микрофолликул" и "неофолликул" применяются в данном документе взаимозаменяемо и означают неполную структуру волосяного фолликула млекопитающего, которая составляет кожный клеточный каркас, но не имеет других клеточных типов, таких как мышечные клетки, нервы, кровеносные сосуды и т.п., что приводит к уменьшению размера по сравнению с натуральным фолликулом. Микрофолликул данного изобретения включает de novo сосочек, который стабильно покрыт или колонизирован клетками, по меньшей мере, одной другой клеточной популяции, выбранной из группы, включающей фибробласты, кератиноциты и/или меланоциты. Фибробласты, кератиноциты и/или меланоциты не должны происходить от волосяного фолликула млекопитающего, но могут быть получены из других тканей млекопитающего. Предпочтительно микрофолликул данного изобретения включает de novo сосочек, который стабильно покрыт или колонизирован клетками, по меньшей мере, одной другой клеточной популяции, которая является получаемой и/или полученной из волосяного фолликула млекопитающего, например, выбранная из группы, включающей фибробласты соединительнотканевой оболочки, кератиноциты и/или меланоциты. Трехмерная форма указанного микрофолликула имитирует трехмерный вид физиологического волосяного фолликула млекопитающего. Микрофолликулы, в частности, могут быть сформированными трехмерно, факультативно пространственно разделенными, восстановленными de novo сосочками с подобными фолликулу структурами на поверхности de novo сосочков, включая напоминающие раннюю стадию морфогенеза волоса и включая клетки кожных сосочков.

Данное изобретение касается способа получения волосяных микрофолликулов, включающего несколько этапов.

Эти этапы включают обеспечение de novo сосочков. По данному изобретению de novo сосочки, которые должны быть обеспечены, можно получить любым приемлемым способом, предпочтительно используются de novo сосочки, полученные по одному из способов получения de novo сосочков по данному изобретению, раскрытых ниже.

Этапы включают далее обеспечение других клеточных популяций. Другая клеточная популяция может быть получена из волосяного фолликула млекопитающего, предпочтительно из того же волосяного фолликула, что используется для получения кожного сосочка (DP), и совместного культивирования de novo сосочков, по меньшей мере, с одной другой клеточной популяцией в сосудах с отсутствием прикрепления культуры. По меньшей мере, 4 разных клеточных популяции, т.е. Кожные волосяные сосочки (DPF), фибробласты соединительнотканевой оболочки (CTSF), кератиноциты (КС) и меланоциты (МС), могут быть выделены из волосяного фолликула млекопитающего определенным способом, отдельно культивированы при стандартных условиях и впоследствии размножены. Также можно формировать клеточные культуры с длительной жизнеспособностью из таких изолятов и использовать их, например, для способов скрининга.

В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения другие клеточные популяции выбраны из группы, включающей фибробласты, кератиноциты и меланоциты. Фибробласты, кератиноциты и/или меланоциты не должны происходить от волосяного фолликула млекопитающего, а могут быть получены из других тканей млекопитающего. Фибробласты происходят предпочтительно из соединительнотканевой оболочки.

Предпочтительно, по меньшей мере, одна другая клеточная популяция является получаемой и/или полученной из волосяного фолликула млекопитающего, которая выбрана из группы, включающей фибробласты соединительнотканевой оболочки, кератиноциты и/или меланоциты.

В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения de novo сосочки совместно культивируют с кератиноцитами, по меньшей мере. Кератиноциты являются дополнением для основной регенерации микрофолликулов. В еще одном предпочтительном варианте осуществления данного изобретения кератиноциты и меланоциты одновременно обеспечены для культуры сосочка. Добавление меланоцитов особенно полезно для исследований пигментации волос или для цели будущей имплантации с желаемым цветом волос. Другие отдельно нарощенные клеточные компоненты могут быть добавлены в сосуд с отсутствием прикрепления культуры, описанный ниже, для способа получения de novo сосочков, такой как сосуды с ультранизким прикреплением культуры, в котором неососочки уже получены. Кератиноциты или смеси кератиноцитов и меланоцитов добавлены к покрытым неососочкам при специфическом соотношение смешивания и инкубируются в приемлемой среде в сосудах с отсутствием прикрепления культуры в течение нескольких дней. Предпочтительные соотношения КС к МС составляют 2:1, 5:1, 10:1 или 20:1. Совместное культивирование длится, по меньшей мере, 12 часов, предпочтительно от 1 дня до 5 недель, более предпочтительно от 2 дней до 3 недель, наиболее предпочтительно 1 неделя или в основном 2 дня. Для разработки многослойного неофолликула, который еще лучше имитирует структуру и функцию волосяного фолликула, его можно получить путем покрытия образованного неофолликула CTSF в течение определенного периода времени, выбранного из 12 часов - 10 дней, предпочтительно 1-5 дней, наиболее предпочтительно в основном 2 дня. При этих условиях смесь клеток развивается в фолликулярную структуру, формирующую типичные признаки волосяного фолликула, такие как развитие ости волоса. Подобная органу структура называется микрофолликуломом для формирования приблизительной ости волоса.

В предпочтительном варианте осуществления способа данного изобретения получения волосяного микрофолликула

(a) обеспечивают de novo сосочки;

(b) de novo сосочки приводят в контакт с КС, МС или смесью КС и МС с заранее определенным соотношением и совместно культивируют в сосуде с отсутствием прикрепления культуры в течение заранее определенного времени;

(b') факультативно повторяют этап (b), предпочтительно, где для контакта и совместного культивирования применяют клетки другого клеточного типа, чем применяемые в первом цикле;

(c) факультативно покрытые de novo сосочки этапа (b) или (b') могут быть покрыты внеклеточным матричным белком, предпочтительно коллагеном IV, до и/или одновременно с этапом (d);

(d) покрытые de novo сосочки этапа (b), (b') или (с) совместно культивируют с CTSF в течение заранее определенного времени в сосуде с отсутствием прикрепления культуры.

Данное изобретение также направлено на обеспечение способа получения de novo сосочков, включающего этапы, на которых:

(a) обеспечивают, по меньшей мере, один кожный сосочек (DP), по меньшей мере, из одного волосяного фолликула млекопитающего,

(b) выделяют фибробласты кожного волосяного сосочка (DPF) из кожного сосочка (DP) механическим фиксированием указанного кожного сосочка (DP) на поверхности сосуда для клеточной культуры, посредством чего базальная пластинка перфорируется, чтобы позволить указанным кожным волосяным сосочкам (DPF) выходить,

(c) наращивают выделенные кожные волосяные сосочки (DPF) в монослойной культуре без коллагенового покрытия, где указанные кожные волосяные сосочки (DPF) пересевают, по меньшей мере, один раз,

(d) сгущают нарощенные кожные волосяные сосочки (DPF) в клеточные совокупности, которые проявляют размер и форму физиологического кожного сосочка (DP), где указанные кожные волосяные сосочки (DPF) дифференцируются в сосудах с отсутствием прикрепления культуры при концентрации клеток на поверхности сосуда от 1000 до 100000 DPF/см², факультативно нарощенные кожные волосяные сосочки (DPF) сгущаются в течение, по меньшей мере, 48 часов, и

(е) покрывают de novo сосочки внеклеточными матричными белками, предпочтительно коллагеном IV, фибронектином и/или ламинином.

Данное изобретение также направлено на обеспечение способа получения de novo сосочков, включающего этапы, на которых:

(а) обеспечивают, по меньшей мере, один кожный сосочек (DP), по меньшей мере, из одного волосяного фолликула млекопитающего,

(b) выделяют фибробласты кожного волосяного сосочка (DPF) из кожного сосочка (DP) механическим фиксированием указанного кожного сосочка (DP) на поверхности сосуда для клеточной культуры, посредством чего базальная пластинка перфорируется, чтобы позволить указанным кожным волосяным сосочкам (DPF) выходить,

(c) наращивают выделенные кожные волосяные сосочки (DPF) в монослойной культуре без коллагенового покрытия, где указанные кожные волосяные сосочки (DPF) пересевают, по меньшей мере, один раз,

(d) сгущают нарощенные кожные волосяные сосочки (DPF) в клеточные совокупности, которые проявляют размер и форму физиологического кожного сосочка (DP), где указанные кожные волосяные сосочки (DPF) дифференцируются в сосудах с отсутствием адгезии культуры при концентрации клеток на поверхности сосуда от 1000 до 100000 DPF/см², и где нарощенные кожные волосяные сосочки (DPF) сгущаются в течение, по меньшей мере, 48 часов;

(e) факультативно покрывают de novo сосочки внеклеточными матричными белками, предпочтительно коллагеном IV, фибронектином и/или ламинином.

Особенно наращивание выделенных DPF и форма физиологического введения являются ограничивающими факторами для применения этих клеток в индукции роста волос в известном уровне техники. Необходимо несколько циклов размножения для достижения необходимого количества клеток, в ходе которых клетки культивируются в монослойных культурах, особенно из фибробластов кожного сосочка, теряют свои индуктивные способности, а именно, как показал опыт, через 5-8 циклов размножения. Клетки, обработанные таким образом, дедифференцируют и экспрессируют маркеры стволовых клеток, но не могут больше использоваться для образования волосяных фолликулов.

В данном изобретении показано, что клетки достигают уровня дифференциации и стабилизации или снова обретают свою способность индуцировать рост волос после от нескольких дней до нескольких недель в специфических условиях культуры данного изобретения, где DPF, нарощенные вследствие культивирования клеток, переносятся при хорошо определенной концентрации в специальные сосуды с отсутствием адгезии клеточной культуры. В добавок к вновь приобретенным индуктивным свойствам, обнаружили, что, как результат активных контактов клетки с клеткой и обмена сигнальными молекулами, клетки впоследствии формируют клеточные совокупности и дифференцируются. При таких специфических условиях клетки, обработанные таким образом, уплотняются до приблизительной формы и размера, соответствующих физиологической форме кожного сосочка в волосяном фолликуле после выделения. С этой целью соотношение используемых клеток к поверхности сосуда для культуры является критически важным.

До этапа (а) волосяной фолликул берут у млекопитающего, являющегося пациентом или донором. Особенно образец берут у человека, грызуна, свиньи, псовых, обезьяны, овцы, кошки или собаки, предпочтительно человека. Особенно предпочтительно брать образец ткани путем кожной биопсии, особенно взятой близко к месторасположению заболевания. В данном изобретении образец волосяного фолликула предпочтительно взят из волос головы, бороды, бровей, генитальных волос или других волос тела. Взятие волосяного фолликула происходит в соответствии с медицинской практикой. Образец может быть очищен для удаления разрушающих веществ.

Обеспечение DP из волосяных фолликулов и выделение DPF согласно этапу (а) происходит по вновь разработанным из ранее существующих стандартных протоколов. При использовании небольших кусочков биопсий кожи эпидермис отделяется от лежащей в основе дермы и жировой ткани, например, с использованием скальпеля. Жировая ткань слегка сжимается, например, с использованием пинцета, так, что расположенные там волосяные луковицы, легко препарируются под препаровальной лупой. Такие выделенные волосяные фолликулы фиксируются на ости волоса, например, опять посредством пинцета, и соединительнотканевая оболочка аккуратно отделяется диаметральным способом, например, посредством еще одного пинцета, так, что луковица выворачивается, чтобы показать DPF и ость волоса с волосяной матрицей. Таким путем проксимальная часть луковицы вместе с фибробластами соединительнотканевой оболочки и кожные сосочки легко отделяются от остальной части волосяного фолликула, например, путем использования иглы или канюли. Также ость волоса, которая включает также необходимые кератиноциты и меланоциты волосяной матрицы, оптимально подготовлена для дальнейшего культивирования.

Затем на этапе (b) выделенные кожные сосочки переносятся в сосуд для клеточной культуры и механически фиксируются на поверхности сосуда. Предпочтительно DPF получают путем механического задерживания выделенных кожных сосочков на дне сосуда для культуры, предпочтительнее с использованием острия иголки или скальпеля, а не подвергая их ферментативному отделению. Предпочтительно инкубировать 1-8 DP на сосуд для культуры. В частности, 2-4 DP переносятся в каждую лунку 6-луночных или 12-луночных планшетов для клеточной культуры, например, и фиксируются на дне планшета. В результате базальная пластинка слегка перфорируется, но морфология сосочка приблизительно поддерживается, и DPF могут выходить из кожного сосочка и пролиферировать.

Культивирование DPF на этапе (с) осуществляется без коллагенового покрытия в стандартной среде, предпочтительно включающей пониженное количество фетальной бычьей сыворотки (FCS), например, 10% по сравнению с традиционными 20% FCS, и дополнительно дополненной антибиотиками, такими как 1х пенициллин/стрептомицин. После выделения первая замена среды предпочтительно производится через 1 неделю, как минимум, и через 2 недели, как максимум. Как только клетки вырастают из DP, среда может заменяться один - два раза в неделю, в зависимости от плотности клеток. Когда клетки достигают 70-80% слияния, они отделяются от дна планшета, например, путем использования трипсина/EDTA при комнатной температуре, и пересеваются в другие сосуды для культуры, такие как колбы Т25 для клеточной культуры. В ходе культивирования клетки могут быть далее нарощены для непосредственного применения в экспериментах или заморожены в жидком азоте для будущего использования. Хотя число пересевов не ограничено, так что клетки могут быть нарощены до любой высокой плотности, если дана жизнеспособность, предпочтительно указанные DPF пересевать, по меньшей мере, два раза, более предпочтительно, по меньшей мере, пять раз, наиболее предпочтительно не более девяти раз. Для высокопроизводительной процедуры предпочтительны восемь пересевов. Следовательно, в другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения способ выполняется путем сгущения неиндуктивных DPF. Обнаружено, что такие DPF, у которых отсутствуют индуктивные свойства, еще можно использовать для тканевой инженерии.

Следующей является фаза сгущения этапа (d), где отделенные, размноженные DPF культивируются в сосудах с отсутствием прикрепления культуры со средой, включающей хорошо определенные компоненты, т.е. стандартной культуральной средой. В этой системе поверхность специального сосуда или специальное покрытие поверхности сосуда, особенно поверхность дна, снижает прикрепление клеток или даже препятствует прикреплению клеток к поверхности. Предпочтительно сосуды с отсутствием адгезии культуры сделаны из стекла, полистирола, и/или поверхность обработана с противоадгезивным слоем. Более предпочтительно в сосудах применяется PTFE- или поли-НЕМА-покрытая поверхность. Применение сосудов с ультранизким прикреплением культуры особенно предпочтительны в объеме данного изобретения, которые, например, доступны от Coming, Inc., США. Такие сосуды с отсутствием прикрепления и покрытия известны специалисту в данной области, и их можно легко купить или изготовить.

В результате свободного контакта клеточная совокупность определенного размера через несколько дней формирует совокупности, которые похожи на оригинальный сосочек размером и формой. Нарощенные DPF предпочтительно сгущаются в течение, по меньшей мере, 48 часов, 2-5 дней, более предпочтительно в течение 2-3 дней, наиболее предпочтительно в основном 2 дня и факультативно далее культивируются в течение 3-15 дней, предпочтительно в течение 5-10 дней или 2-21 дней. Размер и форма формирующихся скоплений, кроме того, зависят от области, из которой были отделены кожные биопсии. DPF, которые отделены из бороды, волоса тела, бровей, генитального волоса или волоса головы и подвержены наращиванию, формируют клеточные совокупности разного размера, которые, в свою очередь, определяют соответствующую форму, размер и длину волоса. Еще более важным является начальное число клеток, инокулированных в сосуде, которое должно быть пропорционально поверхности сосуда. В другом варианте осуществления способа концентрация клеток на поверхности сосуда составляет 2000-50000 DPF/см² на этапе (d), предпочтительно 3000-20000 DPF/см², более предпочтительно 5000-10000 DPF/см², наиболее предпочтительно в основном 6666 DPF/см².

На этой стадии самостоятельно полученная матрица уже сформирована вокруг скопления. Для ускорения этого процесса и оказания влияния на него целевым образом, физиологические матричные компоненты добавляют в среду в этой точке для формирования капсулы, имитирующей свойства кожного сосочка. На следующем этапе (е) процесса de novo сосочки, полученные таким образом, покрывают композицией внеклеточных матричных белков. Эта композиция сделана так, чтобы имитировать физиологическую. Она может предпочтительно включать коллаген IV, фибронектин и/или ламинин. Особенно предпочтительно, что внеклеточные матричные белки являются смесью коллагена IV, фибронектина и ламинина в долях 2-6:0,5-2:0,5-2 весовых частей, наиболее предпочтительно имеют соотношения в основном 4:1:1,15 весовых частей. Не исключено, однако, что вышеупомянутые внеклеточные матричные белки также могут использоваться отдельно или с переменными объемными процентными соотношениями, или в комбинации с другими матрицами. В другом варианте осуществления данного изобретения внеклеточные матричные белки дополнительно включают другие коллагены (например, 1, 10 Al, 18 Al), глюкозаминогликаны и/или протеогликаны, предпочтительно гепарап сульфат, декорин, кератан сульфат, бигликаны, аггрекан, версикан, перлекан, CD44v3 и/или синдекан. Также такое покрытие неососочков выполняется в сосуде с минимальной адгезией с клеточной культуры, например, в сосудах с ультранизким прикреплением с клеточной культуры. Покрытие выполняется в течение 1-5 дней, предпочтительно в течение 1-2 дней.

Данное изобретение также касается de novo сосочков и волосяных микрофолликулов, получаемых способами по данному изобретению. Изложенное ранее в данном описании, касающемся способов получения неососочков и микрофолликулов, соответственно, расценивается как действующее и применимое без ограничений продуктами способов получения, если целесообразно.

И de novo сосочки, и/или волосяные микр о фолликулы данного изобретения можно использовать для получения кожных эквивалентов. Предпочтительно кожные эквиваленты сконструированы, например, путем использования Matriderm (Dr.Suwelack Skin & Health Care AG), согласно стандартным способам, и участки вставки для микрофолликулов вырезаны с равными интервалами посредством 2-фотонного лазера или предварительно перфорируются пробойником. Следовательно, кожные эквиваленты, включающие de novo сосочки и/или волосяные микрофолликулы данного изобретения составляют другую цель данного изобретения. Кроме восстановленных кожных сосочков они включают один или более слоев кератиноцитов, которые могут сами формироваться в эпидермальной структуре или перидермальной структуре, и факультативно один или более слоев меланоцитов, которые могут накладываться на структуру кожных сосочков.

De novo сосочки и/или волосяные микрофолликулы по данному изобретению также могут использоваться как имплантаты. Поэтому, еще одной целью данного изобретения является имплантат, включающий в качестве активного ингредиента эффективное количество de novo сосочков данного изобретения и/или волосяных микрофолликулов данного изобретения, факультативно вместе с фармацевтически допустимыми адъювантами.

Подобным образом, кожный эквивалент данного изобретения можно использовать как трансплантат. Следующая цель данного изобретения заключается в обеспечении трансплантата, включающего в качестве активного ингредиент эффективное количество кожного эквивалента по данному изобретению, факультативно вместе с фармацевтически допустимыми адъювантами.

Выражение "эффективное количество" означает количество имплантата или трансплантата, соответственно, обладающее профилактически или терапевтически релевантным эффектом на болезнь или патологические состояния. Профилактический эффект предупреждает начало болезни или даже инфекции патогеном после инфильтрации отдельных представителей так, что последующее распространение патогена строго сокращается, или даже он полностью инактивируется. Терапевтически релевантный эффект облегчает до некоторой степени один или более симптомов болезни или возвращает к норме или частично, или полностью один или более физиологических или биохимических параметров, связанных с или вызывающих болезнь или патологические состояния. Соответствующее количество для введения имплантата или трансплантата, соответственно, является достаточно высоким для того, чтобы достичь желаемого профилактического или терапевтического эффекта уменьшения симптомов снижения количества волос. Будет понятно, что уровень специфической дозы, частота и период введения любому отдельному млекопитающему будет зависеть от ряда факторов, включая активность используемых специфических компонентов, возраст, вес тела, общее состояние здоровья, пол, диету, время введения, способ введения, комбинацию лекарственных средств и серьезность специфической терапии. Используя хорошо известные средства и способы, специалист в данной области сможет определить точное количество, как сущность стандартного эксперимента.

Имплантаты или трансплантаты данного изобретения получены известным путем с использованием общих твердых или жидких носителей, разбавителей, и/или добавок, и обычных адъювантов для фармацевтической инженерии и в соответствующем количестве в зависимости от намеченного способа применения. Эти фармацевтически приемлемые вспомогательные средства включают соли, буферы, наполнители, хелатирующие средства, антиоксиданты, растворители, связывающие средства, смазочные средства, покрытия, добавки, консерванты и суспендирующие средства. В значении данного изобретения "адъювант" означает каждое вещество, которое делает возможным, усиливает или модифицирует специфический ответ организма как результат имплантации или трансплантации, если вводится одновременно, совместно или последовательно. Количество вспомогательного вещества, которое скомбинировано с активным ингредиентом для получения отдельной лекарственной формы варьирует в зависимости от реципиента, которого лечат, и конкретного способа введения.

В зависимости от способа введения имплантат или трансплантат, соответственно, может быть сформулирован рядом способов. Концентрация терапевтически активных ингредиентов в составе может изменяться от около 0,1 до 100 вес.%. Они могут вводиться отдельно или в комбинации с другими видами лечения.

Данное изобретение также касается de novo сосочков, волосяных микрофолликулов и/или кожных эквивалентов по данному изобретению для профилактического или терапевтического лечения состояния снижения количества волос. Вышеупомянутые продукты способов по данному изобретению предпочтительно используются для терапевтического лечения. Терапевтически релевантный эффект облегчает до некоторой степени один или более симптомов снижения количества волос или возвращает к норме, или частично, или полностью, один или более физиологических параметров, связанных с или вызывающих патологические состояния. Мониторинг расценивается как вид лечения, при условии, что продукты способов по данному изобретению вводятся с различными интервалами, например, для активации пролиферационного ответа и полного устранения симптомов состояния. Могут применяться либо идентичные продукты, либо разные продукты. В значении данного изобретения целесообразно профилактическое лечение, если у субъекта есть какая-либо предрасположенность для начала потери волос, такая как семейная предрасположенность, генетический дефект или перенесенная ранее болезнь.

Патологические состояния пониженного количества волос, касающиеся данного изобретения, могут быть результатом алопеции (например, андрогенетическая алопеция, очаговая алопеция и т.д.), наследственной безволосости, рубцевания, ожогов, лучевой терапии, химиотерапии, потери волос, связанной с болезнью, случайного повреждения, повреждения волосяного фолликула, хирургической травмы, оперционной раны или раны донорного участка от кожного трансплантата.

Данное изобретение также касается применения de novo сосочков, волосяных микрофолликулов и/или кожных эквивалентов по данному изобретению для получения имплантата или трансплантата, соответственно, для профилактического или терапевтического лечения состояния снижения количества волос. Имплантат и трансплантат могут либо вводиться для предотвращения начала потери волос млекопитающего, предпочтительно человека, и в результате проблемы заранее, либо для лечения возникших и продолжающихся симптомов.

Другой целью данного изобретения является обеспечение способа лечения состояния снижения количества волос, где de novo сосочки, волосяные микро фолликулы и/или кожные эквиваленты по данному изобретению включены в кожу млекопитающего, нуждающегося в таком лечении. Микроорганоидные фолликулы, особенно аутологические/аллогенные человеческие предшественники волосяных фолликулов, используются для имплантации с целью индуцирования роста волос, тогда как заменители кожи действительно регенерируют кожу, предпочтительно кожу головы. Микроорганоидные фолликулы включаются в от