Новые гены ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты

Новые гены ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании заявок на выдачу патента Японии № 2007-139046 (поданной 25 мая 2007 г.) и 2007-323965 (поданной 14 декабря 2007 г.).

Настоящее изобретение относится к новым генам ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Жирные кислоты являются важными компонентами липидов, таких как фосфолипиды и триацилглицерины. Жирные кислоты, содержащие две или более ненасыщенных связи, обобщенно называют полиненасыщенными жирными кислотами (PUFA), и известно, что к ним относятся арахидоновая кислота, дигомо-γ-линоленовая кислота, эйкозапентаеновая кислота и докозагексаеновая кислота. Сообщалось о различных физиологических активностях таких жирных кислот (непатентный документ 1).

Среди указанных кислот арахидоновая кислота привлекает внимание как промежуточный метаболит, превращаемый в простагландин, лейкотриен и т.д., и было предпринято множество попыток использовать арахидоновую кислоту в качестве материала для продуктов здорового питания и фармацевтических средств. Кроме того, обнаружено, что арахидоновая кислота содержится в материнском молоке и необходима для роста новорожденных, особенно для роста и развития головного мозга плода. По этой причине арахидоновая кислота также привлекает внимание в качестве ингредиента, необходимого для роста новорожденных с точки зрения питания, также как в случае DHA (докозагексаеновой кислоты).

Предполагается, что указанные полиненасыщенные жирные кислоты применимы в различных областях, но некоторые из них не могут быть синтезированы в организме животного. Таким образом, были разработаны микробиологические методики для получения полиненасыщенных жирных кислот посредством культивирования различных микроорганизмов. Также были предприняты другие попытки, чтобы получить полиненасыщенные жирные кислоты в растениях. Известно, что в таких случаях полиненасыщенные жирные кислоты накапливаются, например, в виде компонентов липидов хранения, таких как триацилглицерины, в клетках микроорганизмов или семенах растений.

Более конкретно, триацилглицерины образуются in vivo следующим образом. А именно, глицерол-3-фосфат ацилируется ацилтрансферазой глицерол-3-фосфата с образованием лизофосфатидной кислоты, которая затем дополнительно ацилируется ацилтрансферазой лизофосфатидной кислоты с образованием фосфатидной кислоты. Указанная фосфатидная кислота, в свою очередь, дефосфорилируется фосфатазой фосфатидной кислоты с образованием диацилглицерина, который затем ацилируется ацилтрансферазой диацилглицерина с образованием триацилглицерина. Также известно, что другие ферменты, такие как ацилCoA:холестерин-ацилтрансфераза и лизофосфатидилхолинацилтрансфераза, опосредованно вовлечены в биосинтез триацилглицеринов.

Как описано выше, известно, что реакция, в которой лизофосфатидная кислота (далее называемая «LPA» или «1-ацилглицерол-3-фосфат») ацилируется с образованием фосфатидной кислоты (далее называемой «PA» или «1,2-диацил-sn-глицерол-3-фосфат»), опосредована ацилтрансферазой лизофосфатидной кислоты (далее «LPAAT»).

Указанная LPAAT также известна как 1-ацилглицерол-3-фосфатацилтрансфераза (E.C. 2.3.1.51). До настоящего времени сообщалось о генах LPAAT нескольких организмов. В качестве гена LPAAT Escherichia coli клонирован ген plsC (непатентный документ 2). У грибов клонирован ген SLC1 Saccharomyces cerevisiae (непатентный документ 3). Подобным образом также были клонированы гены LPAAT животных и растений (патентный документ 1).

Что касается LPAAT у продуцирующего липиды гриба Mortierella alpina (далее также называемого «M. alpina»), то имеется сообщение, свидетельствующее, что микросомальная фракция такого гриба обладает активностью ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты (непатентный документ 4). Кроме того, сообщается о двух гомологах гена LPAAT M. alpina (патентные документы 2 и 3).

Патентный документ 1: международная публикация патента № WO2004/076617.

Патентный документ 2: публикация патента США № 2006/174376.

Патентный документ 3: публикация патента США № 2006/0094090.

Непатентный документ 1: Lipids, 39, 1147 (2004).

Непатентный документ 2: Mol. Gen. Genet., 232, 295-303, 1992.

Непатентный документ 3: J.B.C., 268, 22156-22163, 1993.

Непатентный документ 4: Biochemical Society Transactions, 28, 707-709, 2000.

Непатентный документ 5: J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998.

Непатентный документ 6: J. Bacteriology, 173, 2026-2034, 1991.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Однако даже если гены LPAAT, о которых сообщалось ранее, введены и экспрессированы в клетках-хозяевах, композиции жирных кислот, продуцируемых хозяевами, ограничены вследствие субстратной специфичности экспрессированных ферментов. Поэтому существует необходимость в идентификации нового гена, который позволяет получить композицию жирных кислот, соотношение жирных кислот в которой отличается от композиции, о которой сообщалось ранее. В частности, существует необходимость в идентификации гена белка, который позволяет получать композицию жирных кислот, обогащенную полезными жирными кислотами.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ

Целью настоящего изобретения является получение белка или нуклеиновой кислоты, которые позволяют получать жиры и масла с требуемым соотношением жирных кислот и/или позволяют обогатить требуемыми жирными кислотами, в случае экспрессии или введения в клетки-хозяева.

Для достижения указанной выше цели авторы настоящего изобретения провели обширные и тщательные исследования. Во-первых, осуществили анализ EST на продуцирующем липиды грибе Mortierella alpina, чтобы выделить последовательности, высокоидентичные известным генам LPAAT. Затем, чтобы получить полную открытую рамку считывания (ORF), кодирующую LPAAT, гены клонировали, используя скрининг библиотеки кДНК или ПЦР. В результате попыток ввести такие гены в высокопролиферативные клетки-хозяева (например, дрожжевые клетки), чтобы таким образом получить требуемую композицию жирных кислот, авторы изобретения с успехом клонировали ген, относящийся к новой LPAAT с другой субстратной специфичностью, который позволяет продуцировать композицию жирных кислот, отличную от композиций, продуцируемых хозяевами, экспрессирующими обычные LPAAT, и который обеспечивает более высокое содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах по сравнению с клетками-хозяевами, которые не трансформированы геном. Такие исследования привели к осуществлению настоящего изобретения. А именно, настоящее изобретение представляет собой следующее.

(1) Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, указанную в любом из пунктов (a)-(e) ниже:

(a) нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4, и обладающий активностью ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты;

(b) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36 или 37, и которая кодирует белок, обладающий активностью ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты;

(c) нуклеотидную последовательность, которая состоит из нуклеотидной последовательности, которая на 67% или более идентична нуклеотидной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36 или 37, и которая кодирует белок, обладающий активностью ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты;

(d) нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, на 69% или более идентичную аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, и которая кодирует белок, обладающий активностью ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты; или

(e) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4, и которая кодирует белок, обладающий активностью ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты.

(2) Нуклеиновая кислота по п. (1), приведенному выше, которая содержит нуклеотидную последовательность, указанную в любом из пунктов (a)-(c) далее:

(a) нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-10 аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4, и обладающий активностью ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты;

(b) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 36 или 37, и которая кодирует белок, обладающий активностью ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты; или

(c) нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, на 90% или более идентичную аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, и которая кодирует белок, обладающий активностью ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты.

(3) Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, показанную в любом из пунктов (a)-(c) ниже, или ее фрагмент:

(a) нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 36 или 37;

(b) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4; или

(c) нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 3.

(4) Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, показанную в любом из пунктов (a)-(e) ниже:

(a) нуклеотидную последовательность, которая кодирует следующий белок:

белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4, и который обладает способностью давать соотношение жирных кислот, обеспечивающее более высокий относительный показатель, по меньшей мере, для одного или нескольких из следующих компонентов i)-iv), показанных ниже, в соотношении жирных кислот у хозяина, экспрессирующего белок, чем в соотношении жирных кислот у хозяина, не экспрессирующего белок:

i) содержания олеиновой кислоты;

ii) отношения содержания пальмитолеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

iii) отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; и

iv) отношения общего содержания стеариновой кислоты и олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

(b) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36 или 37, и которая кодирует следующий белок:

белок, который обладает способностью давать соотношение жирных кислот, обеспечивающее более высокий относительный показатель, по меньшей мере, для одного или нескольких из следующих компонентов i)-iv), показанных ниже, в соотношении жирных кислот у хозяина, экспрессирующего белок, чем в соотношении жирных кислот у хозяина, не экспрессирующего белок:

i) содержания олеиновой кислоты;

ii) отношения содержания пальмитолеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

iii) отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; и

iv) отношения общего содержания стеариновой кислоты и олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

(c) нуклеотидную последовательность, которая состоит из нуклеотидной последовательности, на 67% или более идентичной нуклеотидной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36 или 37, и которая кодирует следующий белок:

белок, который обладает способностью давать соотношение жирных кислот, обеспечивающее более высокий относительный показатель, по меньшей мере, для одного или нескольких из следующих компонентов i)-iv), показанных ниже, в соотношении жирных кислот у хозяина, экспрессирующего белок, чем в соотношении жирных кислот у хозяина, не экспрессирующего белок:

i) содержания олеиновой кислоты;

ii) отношения содержания пальмитолеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

iii) отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; и

iv) отношения общего содержания стеариновой кислоты и олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

(d) нуклеотидную последовательность, которая кодирует следующий белок:

белок, который состоит из аминокислотной последовательности, на 69% или более идентичной аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, и который обладает способностью давать соотношение жирных кислот, обеспечивающее более высокий относительный показатель, по меньшей мере, для одного или нескольких из следующих компонентов i)-iv), показанных ниже, в соотношении жирных кислот у хозяина, экспрессирующего белок, чем в соотношении жирных кислот у хозяина, не экспрессирующего белок:

i) содержания олеиновой кислоты;

ii) отношения содержания пальмитолеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

iii) отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; и

iv) отношения общего содержания стеариновой кислоты и олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

(e) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4, и которая кодирует следующий белок:

белок, который обладает способностью давать соотношение жирных кислот, обеспечивающее более высокий относительный показатель, по меньшей мере, для одного или нескольких из следующих компонентов i)-iv), показанных ниже, в соотношении жирных кислот у хозяина, экспрессирующего белок, чем в соотношении жирных кислот у хозяина, не экспрессирующего белок:

i) содержания олеиновой кислоты;

ii) отношения содержания пальмитолеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

iii) отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; и

iv) отношения общего содержания стеариновой кислоты и олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты.

(5) Нуклеиновая кислота по пункту (4), указанному выше, которая содержит нуклеотидную последовательность, показанную в любом из пунктов (a)-(c) ниже:

(a) нуклеотидную последовательность, которая кодирует следующий белок:

белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-10 аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4, и который обладает способностью давать соотношение жирных кислот, обеспечивающее более высокий относительный показатель, по меньшей мере, для одного или нескольких из следующих компонентов i)-iv), показанных ниже, в соотношении жирных кислот у хозяина, экспрессирующего белок, чем в соотношении жирных кислот у хозяина, не экспрессирующего белок:

i) содержания олеиновой кислоты;

ii) отношения содержания пальмитолеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

iii) отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; и

iv) отношения общего содержания стеариновой кислоты и олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

(b) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36 или 37, и которая кодирует следующий белок:

белок, который обладает способностью давать соотношение жирных кислот, обеспечивающее более высокий относительный показатель, по меньшей мере, для одного или нескольких из следующих компонентов i)-iv), показанных ниже, в соотношении жирных кислот у хозяина, экспрессирующего белок, чем в соотношении жирных кислот у хозяина, не экспрессирующего белок:

i) содержания олеиновой кислоты;

ii) отношения содержания пальмитолеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

iii) отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; и

iv) отношения общего содержания стеариновой кислоты и олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

(c) нуклеотидную последовательность, которая кодирует следующий белок:

белок, который состоит из аминокислотной последовательности, на 90% или более идентичной аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, и который обладает способностью давать соотношение жирных кислот, обеспечивающее более высокий относительный показатель, по меньшей мере, для одного или нескольких из следующих компонентов i)-iv), показанных ниже, в соотношении жирных кислот у хозяина, экспрессирующего белок, чем в соотношении жирных кислот у хозяина, не экспрессирующего белок:

i) содержания олеиновой кислоты;

ii) отношения содержания пальмитолеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

iii) отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; и

iv) отношения общего содержания стеариновой кислоты и олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты.

(6) Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, показанную в любом из пунктов (a)-(e) ниже:

(a) нуклеотидную последовательность, которая кодирует следующий белок:

белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4, и который обладает способностью обеспечивать более высокое содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, экспрессирующих белок, содержащий данную аминокислотную последовательность, чем в клетках-хозяевах, не экспрессирующих белок;

(b) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36 или 37, и которая кодирует белок, обладающий способностью обеспечивать более высокое содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, экспрессирующих белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, чем в клетках-хозяевах, не экспрессирующих белок;

(c) нуклеотидную последовательность, которая состоит из нуклеотидной последовательности, на 67% или более идентичной нуклеотидной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36 или 37, и которая кодирует белок, обладающий способностью обеспечивать более высокое содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, экспрессирующих белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, чем в клетках-хозяевах, не экспрессирующих белок;

(d) нуклеотидную последовательность, которая кодирует следующий белок:

белок, который состоит из аминокислотной последовательности, на 69% или более идентичной аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, и который обладает способностью, обеспечивать более высокое содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, экспрессирующих белок, содержащий данную аминокислотную последовательность, чем в клетках-хозяевах, не экспрессирующих белок; или

(e) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4, и которая кодирует белок, обладающий способностью обеспечивать более высокое содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, экспрессирующих белок, чем в клетках-хозяевах, не экспрессирующих белок.

(7) Нуклеиновая кислота по п. (6), указанному выше, которая содержит нуклеотидную последовательность, показанную в любом из пунктов (a)-(c) ниже:

(a) нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-10 аминокислот в аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4, и обладающий способностью обеспечивать более высокое содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, экспрессирующих белок, содержащий данную аминокислотную последовательность, чем в клетках-хозяевах, не экспрессирующих белок;

(b) нуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 36 или 37, и которая кодирует белок, обладающий способностью обеспечивать более высокое содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, экспрессирующих белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью, чем в клетках-хозяевах, не экспрессирующих белок; или

(c) нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность, на 90% или более идентичную аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, и которая кодирует белок, обладающий способностью обеспечивать более высокое содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, экспрессирующих белок, содержащий данную аминокислотную последовательность, чем в клетках-хозяевах, не экспрессирующих белок.

(8) Белок, описанный в пунктах (a) или (b) ниже:

(a) белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, и который обладает активностью ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты; или

(b) белок, который состоит из аминокислотной последовательности, на 69% или более идентичной аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, и который обладает активностью ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты.

(9) Белок, описанный в пунктах (a) или (b) ниже:

(a) белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в последовательности SEQ ID NO: 2 или 4 и который обладает способностью давать соотношение жирных кислот, обеспечивающее более высокий относительный показатель, по меньшей мере, для одного или нескольких из следующих компонентов i)-iv), показанных ниже, в соотношении жирных кислот у хозяина, экспрессирующего белок, состоящий из данной аминокислотной последовательности, чем в соотношении жирных кислот у хозяина, не экспрессирующего белок:

i) содержания олеиновой кислоты;

ii) отношения содержания пальмитолеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

iii) отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; и

iv) отношения общего содержания стеариновой кислоты и олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; или

(b) белок, который состоит из аминокислотной последовательности, на 69% или более идентичной аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, и который обладает способностью давать соотношение жирных кислот, обеспечивающее более высокий относительный показатель, по меньшей мере, для одного или нескольких из следующих компонентов i)-iv), показанных ниже, в соотношении жирных кислот у хозяина, экспрессирующего белок, состоящий из данной аминокислотной последовательности, чем в соотношении жирных кислот у хозяина, не экспрессирующего белок:

i) содержания олеиновой кислоты;

ii) отношения содержания пальмитолеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

iii) отношения содержания олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; и

iv) отношения общего содержания стеариновой кислоты и олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты.

(10) Белок, описанный в пунктах (a) или (b) ниже:

(a) белок, который состоит из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в последовательности SEQ ID NO: 2 или 4 и который обладает способностью обеспечивать более высокое содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, экспрессирующих белок, состоящий из аминокислотной последовательности, чем в клетках-хозяевах, не экспрессирующих белок; или

(b) белок, который состоит из аминокислотной последовательности, на 69% или более идентичной аминокислотной последовательности, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, и который обладает способностью обеспечивать более высокое содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, экспрессирующих белок, состоящий из данной аминокислотной последовательности, чем в клетках-хозяевах, не экспрессирующих белок.

(11) Белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в последовательности SEQ ID NO: 2 или 4.

(12) Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. (1)-(7), указанных выше.

(13) Трансформант, трансформированный рекомбинантным вектором по п. (12), указанному выше.

(14) Композиция жирных кислот, полученная культивированием трансформанта по п. (13) выше, в котором, по меньшей мере, один или несколько из показателей i)-iv), указанных ниже, в соотношении жирных кислот в данной композиции жирных кислот выше, чем в продукте культивирования, полученном при культивировании хозяина, который не трансформирован рекомбинантным вектором по п. (12), указанному выше:

i) содержание олеиновой кислоты;

ii) отношение содержания пальмитолеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

iii) отношение содержания олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты; и

iv) отношение общего содержания стеариновой кислоты и олеиновой кислоты к содержанию пальмитиновой кислоты;

(15) Композиция жирных кислот, полученная культивированием трансформанта по п. (13), указанному выше, в котором содержание арахидоновой кислоты в композиции жирных кислот выше, чем в продукте культивирования, полученном при культивировании хозяина, который не трансформирован рекомбинантным вектором по п. (12), указанному выше.

(16) Способ получения композиции жирных кислот, который включает сбор композиции жирных кислот по п. (14) или (15), указанному выше, из продукта культивирования, полученного культивированием трансформанта по п. (13), указанному выше.

(17) Пищевой продукт, содержащий композицию жирных кислот по указанному выше п. (14) или (15).

ПРЕИМУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ

LPAAT согласно настоящему изобретению обладает субстратной специфичностью, отличной от субстратной специфичности обычных LPAAT, и позволяет хозяину продуцировать композицию жирных кислот, соотношение жирных кислот в которой отличается от их соотношения в композициях жирных кислот, продуцируемых хозяевами, экспрессирующими обычные LPAAT. В результате LPAAT согласно настоящему изобретению обеспечивает получение липидов, обладающих требуемыми свойствами и эффектами, и применима в качестве подходящей для получения продуктов питания, косметических средств, фармацевтических препаратов, мыла и т.д.

Содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, экспрессирующих LPAAT согласно настоящему изобретению, выше, чем содержание арахидоновой кислоты в клетках-хозяевах, не экспрессирующих LPAAT согласно настоящему изобретению. Предполагают, что композиция жирных кислот, полученная из продукта культивирования таких экспрессирующих LPAAT клеток, обеспечивает более высокий пищевой эффект и поэтому является предпочтительной.

Кроме того, LPAAT согласно настоящему изобретению позволяет улучшить способность продуцировать жирные кислоты и запасаемые липиды и поэтому является предпочтительной в качестве средства повышения продуктивности микроорганизмов и растений в отношении полиненасыщенных жирных кислот.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1 представляет собой дендрограмму, показывающую взаимосвязь между двумя гомологами LPAAT3 и LPAAT4 согласно настоящему изобретению и известными гомологами LPAAT1 и LPAAT2.

Фигура 2 показывает последовательность кДНК LPAAT3 согласно настоящему изобретению наряду с рассчитанной аминокислотной последовательностью.

Фигура 3 показывает последовательность кДНК LPAAT4 наряду с рассчитанной аминокислотной последовательностью.

На фигуре 4 показано сравнение последовательностей ДНК областей CDS LPAAT3 и LPAAT4.

На фигуре 5 показано сравнение рассчитанных аминокислотных последовательностей LPAAT3 и LPAAT4.

На фигуре 6 показаны рассчитанные аминокислотные последовательности LPAAT3p и LPAAT4p в сравнении с известными аминокислотными последовательностями.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым генам ацилтрансферазы лизофосфатидной кислоты, полученным из рода Mortierella, характеризуемой ацилированием лизофосфатидной кислоты с образованием фосфатидной кислоты.

Ацилтрансфераза лизофосфатидной кислоты (LPAAT) согласно настоящему изобретению является ферментом, который катализирует реакцию, в которой лизофосфатидная кислота ацилируется с образованием фосфатидной кислоты. Донором ацила обычно является ацил-CoA, но донор не ограничен указанным. Акцептор ацила в реакции переноса ацила, катализируемой белком согласно настоящему изобретению, не ограничен LPA, и в качестве акцепторов ацила могут служить различные лизофосфолипиды.

LPA (в дальнейшем также называемый «1-ацил-sn-глицерол-3-фосфатом») согласно настоящему изобретению является определенным видом глицерофосфолипида. LPA представляет собой лизофосфолипид, имеющий только одну жирную кислоту, которая образуется при ацилировании гидроксильной группы в положении 1 (α-положении) глицерол-3-фосфата (далее также называемого «sn-глицерол-3-фосфатом»). LPA не только является промежуточным продуктом биосинтеза липидов, но также служит в качестве внутриклеточного и межклеточного липидного медиатора, имеющего очень широкий диапазон биологических и фармакологических эффектов, включая влияние на пролиферацию клеток, агрегацию тромбоцитов, сокращение гладких мышц и стимуляцию инвазии злокачественной опухоли.

Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению, кодирующие ацилтрансферазу лизофосфатидной кислоты.

Ацилтрансфераза лизофосфатидной кислоты (LPAAT) согласно настоящему изобретению охватывает LPAAT3 и LPAAT4. Соответствие между нуклеиновыми кислотами, кодирующими LPAAT3 и LPAAT4, суммированы на основании их кДНК, CDS, ORF и аминокислотных последовательностей в таблице 1 ниже.

Таблица 1
	LPAAT3	LPAAT4
	SEQ ID NO	Соответствующая область в последовательности SEQ ID NO: 1	SEQ ID NO	Соответствующая область в последовательности SEQ ID NO: 3
кДНК	SEQ ID NO: 1	*****	SEQ ID NO: 3	*****
CDS	SEQ ID NO: 8	Положения 158-1147	SEQ ID NO: 23	Положения 55-996
ORF	SEQ ID NO: 36	Положения 158-1144	SEQ ID NO: 37	Положения 55-993
Аминокислотная последовательность	SEQ ID NO: 2	*****	SEQ ID NO: 4	*****

А именно, последовательности, родственные LPAAT3 согласно настоящему изобретению, включают SEQ ID NO: 2 (аминокислотная последовательность LPAAT3), SEQ ID NO: 36 (последовательность, представляющая область ORF LPAAT3), SEQ ID NO: 8 (последовательность, представляющая CDS-область LPAAT3) и SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность кДНК LPAAT3). Среди указанных последовательностей последовательность SEQ ID NO: 8 соответствует нуклеотидам 158-1147 SEQ ID NO: 1, тогда как последовательность SEQ ID NO: 36 соответствует нуклеотидам 158-1144 SEQ ID NO: 1 или нуклеотидам 1-987 SEQ ID NO: 8.

Подобным образом последовательности, родственные LPAAT4, включают SEQ ID NO: 4 (аминокислотная последовательность LPAAT4), SEQ ID NO: 37 (последовательность, представляющая область ORF LPAAT4), SEQ ID NO: 23 (последовательность, представляющая область CDS LPAAT4) и SEQ ID NO: 3 (нуклеотидная последовательность кДНК LPAAT4). Среди указанных последовательностей последовательность SEQ ID NO: 23 соответствует нуклеотидам 55-996 SEQ ID NO: 3, тогда как последовательность SEQ ID NO: 37 соответствует нуклеотидам 55-993 SEQ ID NO: 3 или нуклеотидам 1-939 SEQ ID NO: 23.

Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению охватывают однонитевые и двунитевые ДНК, а также комплементарные им РНК, которые могут быть либо природными, либо полученными искусственно. ДНК включают без ограничения геномные ДНК, кДНК, соответствующие геномным ДНК, химически синтезированные ДНК, ПЦР-амплифицированные ДНК, а также их сочетания и гибриды ДНК/РНК.

Предпочтительные варианты нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению содержат (a) нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 36 или 37, (b) нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4, и (c) нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 или 3.

Описанная выше нуклеотидная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 36 или 37, нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, состоящий из аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 2 или 4, и нуклеотидная последовательность, показанная в SEQ ID NO: 1 или 3, представляют собой последовательности, показанные в таблице 1.

Чтобы получить указанные нуклеотидные последовательности, можно использовать данные о нуклеотидных последовательностях EST или геномных ДНК организмов, обладающих активностью LPAAT, для поиска нуклеотидной последовательности, кодирующей белок с высокой идентичностью с известными белками, обладающими активностью LPAAT. Предпочтительными организмами, обладающими активностью LPAAT, являются продуцирующие липиды грибы, включая без ограничения M. alpina.

Для анализа EST сначала получают библиотеку кДНК. Что касается получения библиотеки кДНК, то можно обратиться к публикации «Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3^rd ed.» (Cold Spring Harbor Press (2001)). Альтернативно можно использовать коммерчески доступный набор для получения библиотеки кДНК. В качестве примера можно использовать следующие способы получения библиотеки кДНК, подходящие для настоящего изобретения. А именно, подходящий штамм M. alpina, продуцирующего липиды гриба, высевают в подходящую среду и предварительно инкубируют в течение соответствующего периода времени. Условия культивирования, подходящие для такого предварительного культивирования, включают, например, состав среды: 1,8% глюкоза, 1% дрожжевой экстракт и pH 6,0, период культивирования, составляющий 3 суток, и температуру культивирования 28°C. Затем продукт предварительного культивирования подвергают основному культивированию в подходящих условиях. В состав среды, подходящей для основного культивирования, могут входить, например, 1,8% глюкоза, 1% соевый порошок, 0,1% оливковое масло, 0,01% адеканол, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% Na₂SO₄, 0,05% CaCl₂·2H₂O, 0,05% MgCl₂·6H₂O и pH 6,0. Условия культивирования, подходящие для основной культуры, могут представлять собой, например, культивирование в аэробных условиях с постоянным вращением при 300 об./мин, с аэрацией 1 vvm (объем подаваемого воздуха в минуту), 26°C в течение 8 суток. Во время культивирования может быть добавлено нужное количество глюкозы. Во время основного культивирования отбирают образцы продукта культивирования в соответствующих временных точках, из которых затем собирают клетки, чтобы получить суммарную РНК. Для получения суммарной РНК можно использовать известный способ, такой как способ на основе применения гидрохлорида гуанидина/CsCl. Полученная суммарная РНК может быть обработана с использованием коммерчески доступного набора для очистки поли(A)⁺РНК. Затем может быть получена библиотека кДНК с помощью коммерчески доступного набора. Затем определяют нуклеотидную последовательность любого к