Биологические материалы и их применение

Биологические материалы и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к полипептидам, образованным из шаперонина 60.1, и к их применению для лечения заболеваний и в качестве средств для смягчения боли.

Полипептиды теплового шока представляют собой семейство молекул, распространенных во всех организмах, функцией которых является поддержка биологического процессинга и стабильности биологических молекул (Zugel & Kauffman (1999) Role of heat shock polypeptides in protection from and pathogenesis of infection diseases. Clin. Microbiol. Rev. (12)1: 19-39; Ranford et al. (2000) Chaperonins are cell signalling polypeptides: - the unfolding biology of molecular chaperones. Exp. Rev. Mol. Med., 15 September, www.ermn.cbcu.cam.ac.uk/00002015h.htm).

Полипептиды теплового шока расположены в каждом клеточном компартменте и обладают способностью взаимодействовать с широким диапазоном биологических молекул. В частности, полипептиды теплового шока способствуют сворачиванию полипептида и транслокации полипептида, и влияют на них, в любой момент времени после сборки путем разборки полипептида и любых его комплексов. Помогающая природа полипептидов теплового шока привела к тому, что они также известны как молекулярные шапероны (Laskey et al. (1978) Nucleosomas are assembled by an acidic polypeptide, which binds histones and transfers them to DNA. Nature (275): 416-420).

Полипептиды теплового шока синтезируются клетками в ответ на воздействия внешней среды, которые включают, но не ограничиваются ими, изменения температуры (как повышение, так и снижение) и патофизиологические сигналы, такие как цитокины. В ответ на воздействия внешней среды полипептиды теплового шока используют их способность осуществлять процессинг других полипептидов для защиты таких полипептидов от какой-либо денатурации, которая может произойти вследствие воздействия. Этот механизм служит для защиты клеток, которые содержат этот белок.

Полипептиды шаперонинов представляют собой подгруппу полипептидов теплового шока, роль которых в сворачивании полипептидов хорошо известна. Существует два семейства полипептидов шаперонинов, семейства шаперонина 60 (приблизительно 60 кДа) и шаперонина 10 (приблизитенльно 10 кДа) (Ranford, 2000). Наиболее охарактеризованные шаперонины представляют собой шаперонины, происходящие из E. coli, из которых была установлена характерная структура шаперонина 60 и шаперонина 10. Комплексы шаперонинов большинства других организмов также по существу соответствуют этой характерной структуре.

Характерная структура шаперонинов представляет собой комплекс, образованный из двух гептамерных колец (состоящих из семи мономеров шаперонина 60), которые обращены друг к другу и накрыты гептамерным кольцом, состоящим из мономеров шаперонина 10.

Обычно шаперонины способствуют сворачиванию полипептидов, когда полипептид-мишень проникает в сердцевину кольцевых гептамеров, и при последующем высвобождении энергии из ATP полипептид-мишень высвобождается из сердцевины путем конформационных изменений структуры шаперонинов (Ranson et al. (1998) Review Article: Chaperones. Biochem. J (333): 233-242).

Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) продуцируют шаперонин 60.1 (cpn 60.1), полипептид, который так назван, исходя из идентичности его аминокислотной последовательности с другими известными шаперонинами. Другими полипептидами шаперонинов M. tuberculosis являются шаперонин 10 (cpn 10) и шаперонин 60.2 (cpn 60.2). Шаперонин 60.2 проявляет 59,6% идентичность аминокислотной последовательности и 65,6% идентичность последовательности нуклеиновой кислоты с cpn 60.1.

Настоящее изобретение относится к применению фрагментов шаперонина 60.1 или функционально эквивалентных молекул из Mycobacterium tuberculosis или сходных прокариот для профилактики и/или лечения злокачественных и незлокачественных состояний. Примеры незлокачественных состояний включают аутоиммунные нарушения, остеопороз, аллергические нарушения или состояния иммуноактивации, в частности астму и/или состояния, типичным представителем которых является иммунный ответ по типу T-хелперных лимфоцитов 2 (Th2), и/или состояния, ассоциированные с эозинофилией и способами стимуляции продукции медиаторов иммунного ответа, например цитокинов, in vitro или in vivo.

Аутоиммунитет отражает утрату толерантности к "своему", что приводит к неадекватному разрушению нормальных клеток или ткани. При многих состояниях выявляются аутоантитела, однако они могут отражать эффект, а не причину заболевания. Однако при некоторых заболеваниях аутоантитела являются первым, основным или единственным поддающимся детекции нарушением. Одним из классов вовлеченных в этом отношении молекул являются шаперонины, которые являются высоко иммуногенными. Шаперонины относятся к группе белков, называемых молекулярными шаперонами, которые связывают ненативные белки и помогают им, в зависимом от ATP каталитическом процессе, сворачиваться в правильную трехмерную форму, требуемую для функционального белка.

Полагают, что шаперонины стимулируют иммунную систему на многих уровнях одновременно, включая моноциты, макрофаги, фибробластоподобные клетки, возможно, другие типы клеток, и T-клетки. Иммунная защита у млекопитающих может быть подразделена на "врожденную" и "адаптивную" защиты. Ту, которая уже находится в области действия, например, фагоциты, естественные киллерные клетки и комплемент, считают врожденными. При стимуле, адаптивный иммунитет активируется в форме B- и T-лимфоцитов. Известно, что шаперонины действуют прямо на механизмы врожденной защиты, в частности, на фагоциты. Также они стимулируют мощный адаптивный иммунный ответ, а именно продукцию антитела и стимуляцию T-лимфоцитов, которые в некоторых случаях могут быть защитными. Примечательно, что они индуцируют секрецию цитокинов, которая, как полагают, является важной для защиты хозяина. Однако в некоторых случаях полагают, что присутствие шаперонинов может быть повреждающим для хозяина.

Роль шаперонинов в аутоиммунном заболевании является противоречивой. Хотя инфекция/иммунитет в случае содержащих шаперонин организмов являются повсеместными, и здоровые люди обладают T-клеточными ответами на собственные шаперонины, включая продукцию шаперонин-специфических антител, классическое аутоиммунное заболевание является крайне редким. Так, присутствие иммунных реакций на шаперонины может быть случайным и незначительным.

Однако теория молекулярной мимикрии предполагает вовлечение шаперонинов в аутоиммунное заболевание и основана на высоких уровнях консервативности аминокислотной последовательности в шаперонинах из микроорганизмов и млекопитающих. Теория предполагает, что в процессе инфекции широким диапазоном микроорганизмов, эпитопы шаперонинов, которые являются общими между микроорганизмами и млекопитающими, стимулируют T-лимфоциты. Согласно этой теории высокий уровень представления шаперонинами эпитопов шаперонинов нарушает толерантность к собственным шаперонинам, и развивается аутоиммунное заболевание.

Было выявлено, что шаперонины, полученные из опухолей, приводят к некротическим эффектам на эти опухоли. Предполагается, что это может происходить путем усиления иммунологического распознавания опухолевых антигенов, хотя механизмы этого неизвестны. Таким образом, по-видимому, шаперонины индуцируют защитный адаптивный иммунитет против бактериальной инфекции и злокачественной опухоли.

Аллергические реакции, такие как астма, относятся соответственно к неадекватному или неправильно направленному иммунным ответам. Распространенность, например, астмы, возрастает и эффективные способы лечения всех случаев еще не найдены. В современном лечении часто используются иммунодепрессивные глюкокортикостероиды, бета-агонисты, кромгликат, модификаторы лейкотриена и т.д., которые обладают множеством побочных эффектов.

При таких аллергических реакциях выявляются высокие уровни IgE, и иммунные ответы T-хелперных лимфоцитов-2 (Th2) преобладают над ответами Th1, что приводит к воспалительному ответу. Полагают, что Th1-ответы, главным образом, являются защитными против микробной инфекции и запускаются цитокинами, в частности, интерлейкином-12 (IL-12), IL-2 и интерфероном-γ. Напротив, Th2-ответы, в соответствующем генетическом фоне, ассоциированы с вредным аллергическим повреждением тканей.

Однако было предположено, что при других состояниях, таких как аутоиммунные нарушения, например, адъювантный артрит, сверхреактивные ответы Th1 являются причиной нарушения. Таким образом, преобразование ответов Th1 в Th2 или Th2 в Th1 может быть пригодным для лечения описанных выше нарушений.

Хотя известно, что бактерии, такие как L. monocytogenes, M. bovis и M. tuberculosis, могут преобразовывать ответы Th2 в Th1, молекулы, которые отвечают за это преобразование, не были идентифицированы.

Однако существующие в данной области предположения касаются и белка теплового шока, hsp65, из M. leprae, который способен индуцировать Th1-ответы (Lowrie et al., 1999, Nature, 400, p269-271; Bonato et al., 1998, Infect. Immun., 66, p169-175). Гомолог hsp65, из M. tuberculosis, обладает способностью стимулировать в моноцитах человека синтез провоспалительных цитокинов и активировать моноциты и эндотелиальные клетки сосудов человека (Friedland et al., 1993, Clin. Exp. Immunol., 91, p5862; Peetermans et al., 1995, Infect. Immun., 63, p3454-3458; Verdegaal, et al., 1996, J. Immunol., 157, p369-376).

Также настоящее изобретение относится к применению фрагментов шаперонина 60.1 или функционально эквивалентных молекул из Mycobacterium tuberculosis или родственных прокариот для смягчения боли.

Смягчение боли обычно осуществляют пероральным или парентеральным лечением. Эффективного смягчения боли можно достигать в большинстве случаев с помощью широко известных лекарственных средств для смягчения боли, таких как парацетамол, аспирин и другие нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID), такие как ибупрофен, и селективные ингибиторы циклооксигеназы-2 (CSI). Наркотические анальгетики действуют на определенные рецепторы в центральной нервной системе (CNS). Кодеин и дигидрокодеин являются наркотическими анальгетиками умеренного действия и имеют низкий потенциал к возникновению зависимости. Другие более сильные наркотические анальгетики, такие как морфин и метадон, можно использовать для борьбы с тяжелой болью.

Существует множество проблем с известными в настоящее время средствами для смягчения боли. Эти лекарственные средства имеют относительно кратковременное действие, и обезболивание продолжается в течение только нескольких часов. Обычно для борьбы с болью требуются многократные дозы лекарственного средства. Другой распространенной проблемой является субоптимальное смягчение боли, ведущее к повышению у пациента дозы или смене лекарственного средства. В случае NSAID распространены неприятные желудочно-кишечные побочные действия, такие как диспепсия и язвы, и приблизительно две трети потребителей меняют вид NSAID по меньшей мере один рез вследствие неблагоприятных побочных действий и слабой эффективности (Steinfeld S. and Bjorke P.A. Results from a patient survey to assess gastrointestinal burden of non-steroidal anti-inflammatory agent therapy contrasted with a review of data from EVA to determine satisfaction with rofecoxib. Rheumatology (Oxford) 2002, 41 (S1), 23-27.). Кроме того, NSAID и CSI могут приводить к сердечно-сосудистым осложнениям (Hillis W. S, (2000) Areas of emerging interest in analgesia: cardiovascular complications. Am. J. Then 9 (3) 259-69). Аспирин может вызывать синдром Рея у небольшой доли детей, и, таким образом, аспирин непригоден для применения у детей. Парацетамол необходимо использовать с осторожностью, поскольку передозировка им является гепатотоксической (Cranswick, N., Coghlan D. Paracetamol efficacy and safety in children: the first 40 years (2000) Am. J. Ther. 7(2) 135-41). Наркотические анальгетики имеют множество побочных действий, включая сонливость, запор, тошноту, головную боль и головокружение. Многократное введение сильнодействующих наркотических анальгетиков, таких как морфин, может вызывать зависимость.

Преимущество шаперонинов в качестве средств для смягчения боли над современными лекарственными средствами для смягчения боли состоит в том, что они могут иметь меньшие побочные действия. Согласно оценке, два миллиарда человек являются носителями M. tuberculosis без развития Tuberculosis. Носительство M. tuberculosis не ассоциировано с побочными эффектами, которые наблюдаются в случае широко известной медикаментозной терапии, такими как желудочно-кишечные побочные действия, сердечно-сосудистые осложнения, гепатотоксичность, синдром Рея или зависимость.

Следующим преимуществом над ранее известными средствами для смягчения боли является то, что болеутоляющее действие шаперонинов может длиться больше.

На этом фоне, авторы настоящего изобретения неожиданно идентифицировали пептиды и полипептидные фрагменты белка шаперонина 60.1 (также называемого Cpn60.1) Mycobacterium tuberculosis, которыми можно лечить как злокачественные, так и незлокачественные состояния, а также обеспечивать смягчение боли in vivo и in vitro.

Таким образом, в первом аспекте изобретение относится к выделенной или рекомбинантной пептидной молекуле, содержащей полипептидную последовательность или состоящей из полипептидной последовательности, выбранной из группы:

(xi) полипептидной последовательности, которая обладает более чем 66%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95% идентичностью с полипептидной последовательностью, определенной в любом из (i)-(x) и имеет функцию, эквивалентную полипептидной последовательности, определенной в любом из (i)-(x); и

(xii) фрагмента полипептидной последовательность, определенной в любом из (i)-(xi), который имеет функцию, эквивалентную полипептидной последовательности, определенной в любом из (i)-(xi).

В "полипептид" также включены пептиды, белки и соединения пептидомиметиков. Термин "пептидомиметик" относится к соединению, которое имитирует конформацию и желаемые признаки конкретного пептида как лекарственного средства, но в котором отсутствуют нежелательные признаки.

"Функция, эквивалентная полипептидной последовательности, определенной в любом из (i)-(x)," включает любой пептид, полипептид и/или их фрагмент, которые обладают функциональной активностью, идентичной или по существу сходной с любой функцией, проявляемой определенной полипептидной последовательностью или свойственной ей. Например, полипептидные последовательности, определенные в (i)-(x), могут проявлять противовоспалительные свойства (как проиллюстрировано в прилагаемых примерах), позволяя их применения для профилактики и/или лечения незлокачественного состояния, или для смягчения боли.

Функциональную эквивалентность можно измерять с использованием, например, способов, описанных в прилагаемых примерах (например, путем измерения латентного периода для подушечек лап на нагретой плите; или измерения высвобождения воспалительных цитокинов in vivo или in vitro).

Термины "полипептид" или "пептид" или "аминокислотная последовательность" относятся к олигопептиду, пептиду, полипептиду или белковой последовательности или их фрагменту и к встречающимся в природе или синтетическим молекулам. Полипептидный "фрагмент", "часть" или "сегмент" представляет собой участок аминокислотных остатков по меньшей мере приблизительно из 5 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере приблизительно из 7 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно из 9 аминокислот и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно из 17 или более аминокислот. Пептид предпочтительно имеет не более чем приблизительно 200 аминокислот, более предпочтительно менее чем 150 аминокислот и наиболее предпочтительно менее чем 100 аминокислот. Предпочтительно пептид имеет от приблизительно 5 до приблизительно 200 аминокислот. Для того чтобы он был активным, любой полипептид должен обладать достаточной длиной для проявления биологической и/или иммунологической активности.

Термин "встречающийся в природе полипептид" относится к полипептидам, продуцированным клетками, которые созданы способами генетической инженерии, и конкретно охватывает различные полипептиды, появляющиеся после посттрансляционных модификаций полипептида, включающих, но не ограничивающихся ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидацию и ацилирование.

Термин "производное" относится к полипептидам, химически модифицированным такими способами, как убиквитинилирование, мечение (например, радионуклидами или различными ферментами), ковалентное присоединение полимеров, такое как пэгилирование (преобразование в производное с полиэтиленгликолем) и встраивание аминокислот или замена аминокислотами, такими как орнитин, которые не встречаются в норме в белках человека, химическим синтезом.

Термин "вариант" (или "аналог") относится к любому полипептиду, отличающемуся от встречающихся в природе полипептидов вставками, делециями и заменами аминокислот, внесенными с использованием, например, способов рекомбинантных ДНК. Те аминокислотные остатки, которые могут быть заменены, добавлены или удалены без устранения представляющей интерес активности, могут быть определены путем сравнения последовательности конкретного полипептида с последовательностями гомологичных пептидов и минимизации изменений аминокислотной последовательности, внесенных в области высокой гомологии (консервативные области) или путем замены аминокислот консенсусной последовательностью.

Альтернативно можно синтезировать или отбирать рекомбинантные варианты, кодирующие эти или сходные полипептиды, с использованием "избыточности" генетического кода. Для оптимизации клонирования в плазмиду или вирусный вектор или для экспрессии в конкретной прокариотической или эукариотической системе можно вносить различные замены кодонов, такие как молчащие изменения, которые образуют различные участки рестрикции. Мутации в полинуклеотидной последовательности могут отражаться на полипептиде или доменах других пептидов, добавленных к полипептиду для модификации свойств любой части полипептида в целях изменения характеристик, таких как аффинность связывания лиганда, межцепочечная аффинность или скорость деградации/обновления.

Предпочтительно аминокислотные "замены" являются результатом замены одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей сходные структурные и/или химические свойства, т.е. консервативных аминокислотных замен. "Консервативные" аминокислотные замены можно проводить на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы вовлеченных остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин; полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин; положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин; и отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Размер "инсерций" или "делеций" предпочтительно находится в диапазоне приблизительно от 1 до 20 аминокислот, более предпочтительно от 1 до 10 аминокислот. Допустимое изменение может быть экспериментально определено систематическим внесением инсерций, делеций или замен аминокислот в полипептидной молекуле с использованием способов рекомбинантных ДНК и анализом активности полученных рекомбинантных вариантов.

Альтернативно, когда является желательным изменение функции, для получения измененных полипептидов можно вносить способами инженерии вставки, делеции или неконсервативные замены. Такие изменения могут, например, изменять одну или несколько биологических функций или биохимических характеристик полипептидов по изобретению. Например, такие изменения могут изменять характеристики полипептида, такие как аффинность связывания лиганда, межцепочечная аффинность или скорость деградации/обновления. Кроме того, такие изменения можно отбирать так, чтобы получить полипептиды, которые являются более пригодными для экспрессии, масштабирования и т.д. в клетках-хозяевах, выбранных для экспрессии. Например, остатки цистеина можно удалять или заменять другим аминокислотным остатком для устранения дисульфидных связей.

Фрагменты белков по настоящему изобретению, которые способны проявлять биологическую активность, также охватываются настоящим изобретением. Фрагменты белка могут иметь линейную форму или они могут быть замкнуты с использованием известных способов, например, как описано в H. U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992) и в R. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992), оба из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок. Такие фрагменты можно подвергать слиянию с молекулами носителей, такими как иммуноглобулины, для многих целей, включая повышение валентности участков связывания белка.

Кроме того, изобретение относится к выделенной или рекомбинантной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотидную последовательность или состоящей из полинуклеотидной последовательности, выбранной из группы:

(a) полинуклеотидной последовательности, которая кодирует полипептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

(b) полинуклеотидной последовательности, которая обладает более чем 66%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95% идентичностью с полинуклеотидной последовательностью, определенной в (a); или полинуклеотидной последовательности, которая гибридизуется с полинуклеотидной последовательностью, определенной в (a) в условиях 2xSSC, 65°C, которая кодирует полипептидную последовательность, обладающую функцией, эквивалентной полипептидной последовательности, определенной в любом из (i)-(x); и

(c) фрагмента полинуклеотидной последовательности, определенной в (a) или (b), который кодирует полипептидную последовательность, обладающую функцией, эквивалентной полипептидной последовательности, определенной в любом из (i)-(x).

Термины "нуклеотидная последовательность" или "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" или "олигонуклеотид" используют взаимозаменяемо, и они относятся к гетерополимеру нуклеотидов или к последовательности этих нуклеотидов. Эти выражения также относятся к ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять собой смысловую или антисмысловую цепь для пептидной нуклеиновой кислоты (PNA) или для любого ДНК-подобного или РНК-подобного материала. В последовательностях A представляет собой аденин, C представляет собой цитозин, T представляет собой тимин, G представляет собой гуанин, и N представляет собой A, C, G или T (U). Предусматривается, что когда полинуклеотид представляет собой РНК, T (тимин) в последовательности, представленной в настоящем документе, заменен U (урацилом). Как правило, сегменты нуклеиновых кислот по изобретению могут быть собраны из фрагментов генома и коротких олигонуклеотидных линкеров, или из серий олигонуклеотидов, или из отдельных нуклеотидов, для получения синтетической нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована в рекомбинантном транскрипционном элементе, содержащем регуляторные элементы, происходящие из микробного или вирусного оперона, или эукариотического гена.

Полинуклеотиды по изобретению включают встречающуюся в природе или полностью или частично синтетическую ДНК, например, кДНК и геномную ДНК, и РНК, например, мРНК. Полинуклеотиды могут включать всю кодирующую область кДНК или могут представлять собой часть кодирующей области кДНК.

Настоящее изобретение также относится к генам, соответствующим последовательностям кДНК, описанным в настоящем документе. Соответствующие гены можно выделять известными способами с использованием информации последовательности, описанной в настоящем документе. Такие способы включают получение зондов или праймеров на основе информации описанной последовательности для идентификации и/или амплификации генов в соответствующих геномных библиотеках и других источниках геномных материалов. Кроме того, 5'- и 3'-последовательность можно получить с использованием способов, известных в данной области. Например, полноразмерную кДНК или геномную ДНК, которая соответствует любому из полинуклеотидов по изобретению, можно получать скринингом соответствующих библиотек кДНК или геномной ДНК в пригодных условиях гибридизации с использованием любого из полинуклеотидов по изобретению или их частей в качестве зондов. Альтернативно полинуклеотиды по изобретению можно использовать в качестве основы для пригодного праймера(ов), который позволяет идентификацию и/или амплификацию генов в соответствующих библиотеках геномной ДНК или кДНК.

Последовательности нуклеиновых кислот по изобретению можно собирать из EST и последовательностей (включая последовательности кДНК и геномные последовательности), полученных из одной или нескольких общественных баз данных, таких как dbEST, gbpri и UniGene. Последовательности EST могут обеспечить идентификацию информации последовательности, информации репрезентативного фрагмента или сегмента, или информации нового сегмента для полноразмерного гена.

К полинуклеотидам по изобретению также относятся полинуклеотиды, включающие нуклеотидные последовательности, которые являются по существу эквивалентными полинуклеотидам, приведенным выше. Полинуклеотиды по изобретению могут иметь, например, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, более конкретно по меньшей мере приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, более конкретно по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, и еще более конкретно по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичность последовательности с указанным выше полинуклеотидом.

В объем последовательностей нуклеиновых кислот по изобретению включены фрагменты последовательностей нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в строгих условиях с любой из нуклеотидных последовательностей по изобретению, или комплементарных им последовательностей, где фрагмент превышает приблизительно 5 нуклеотидов, предпочтительно 7 нуклеотидов, более предпочтительно 9 нуклеотидов и наиболее предпочтительно 17 нуклеотидов. Предусматриваются фрагменты, например 15, 17 или 20 нуклеотидов или более, которые являются селективными в отношении любого из полинуклеотидов по изобретению (т.е. специфично гибридизуются с ними). Зонды, способные специфично гибридизоваться с полинуклеотидом, могут отличать полинуклеотидные последовательности по изобретению от других полинуклеотидных последовательности в том же семействе генов, или они могут отличать гены человека от генов других видов, и предпочтительно они основаны на уникальных нуклеотидных последовательностях.

Последовательности, находящиеся в объеме настоящего изобретения, не ограничены этими конкретными последовательностями, но также они включают их аллельные и видовые варианты. Аллельные и видовые варианты можно определять общепринятыми способами путем сравнения последовательности по изобретению, ее репрезентативного фрагмента или нуклеотидной последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной, предпочтительно на 95% идентичной с последовательностью из другого изолята того же вида. Более того, для учета вариабельности кодонов изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие те же аминокислотные последовательности, что и конкретные ORF, описанные в настоящем документе. Иными словами, в кодирующей области ORF прямо предусматривается замена одного кодона другим кодоном, который кодирует ту же аминокислоту.

Термин "строгий" используют для обозначения условий, которые обычно понимают в данной области как строгие. Строгие условия могут включать высоко строгие условия (т.е. гибридизацию со связанной с фильтром ДНК в 0,5 M NaHPO₄, 7% додецилсульфате натрия (SDS), 1 мМ ЭДТА при 65°C, и промывание в 0,1x SSC/0,1% SDS при 68°C) и умеренно строгие условия (т.е. промывание в 0,2x SSC/0,1% SDS при 42°C). Другие иллюстративные условия гибридизации описаны в настоящем документе в разделе "Примеры".

В случаях гибридизации дезоксиолигонуклеотидов, дополнительные иллюстративные строгие условия гибридизации включают промывание в 6x SSC/0,05% пирофосфате натрия при 37°C (для олигонуклеотидов из 14 оснований), 48°С (для олигонуклеотидов из 17 оснований), 55°C (для олигонуклеотидов из 20 оснований) и 60°С (для олигонуклеотидов из 23 оснований).

SSC определяют как 0,15 M NaCl, 0,015 M цитрат натрия, pH 7,2.

Под "идентичностью" понимают количество или процент (в зависимости от представления результатов) аминокислотных остатков или остатков нуклеиновой кислоты, в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам или остаткам нуклеиновой кислоты в представляющей интерес последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения пропусков, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, и не рассматривая какие-либо консервативные замены в качестве части идентичности последовательностей.

Процентную идентичность последовательностей между двумя полинуклеотидами или полипептидами можно определять с использованием пригодных компьютерных программ, например программы GAP University of Wisconsin Genetic Computing Group, и понятно, что процентную идентичность вычисляют в отношении полипептидов, последовательность которых выровнена оптимально. Альтернативно выравнивание можно проводить с использованием программы Clustal W (Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80). Используемые параметры могут быть следующими: параметры быстрого попарного выравнивания: размер K-tuple (слово); 1, размер окна; 5, штраф за делецию; 3, число верхних диагоналей; 5. способ оценки: x процент; параметры множественного выравнивания: штраф за внесение делеции; 10, штраф за продолжение делеции; 0,05, оценочная матрица: BLOSUM.

Как используют в настоящем документе, "по существу эквивалентный" или "по существу сходный" может относиться как к нуклеотидным, так и к аминокислотным последовательностям, например к мутантной последовательности, которая отличается от контрольной последовательности одной или несколькими заменами, делециями или вставками, совокупный эффект которых не приводит к неблагоприятному функциональному несходству между эталонной и рассматриваемой последовательностями. Как правило, такая по существу эквивалентная последовательность отличается от последовательностей, приведенных в настоящем документе, не более чем приблизительно на 35% (т.е. количество замен, вставок и/или делеций отдельных остатков в по существу эквивалентной последовательности, по сравнению с соответствующей эталонной последовательностью, деленное на общее количество остатков в по существу эквивалентной последовательности, составляет приблизительно 0,35 или менее). Указывают, что такая последовательность имеет 65% идентичность последовательности с приведенной последовательностью. В одном варианте осуществления по существу эквивалентная, например, мутантная, последовательность по изобретению отличается от приведенной последовательности не более чем на 30% (70% идентичность последовательности); в варианте этого варианта осуществления не более чем на 25% (75% идентичность последовательности); и в следующем варианте этого варианта осуществления не более чем на 20% (80% идентичность последовательности), и в следующем варианте этого варианта осуществления не более чем на 10% (90% идентичность последовательности), и в следующем варианте этого варианта осуществления не более чем на 5% (95% идентичность последовательности). По существу эквивалентные, например, мутантные, аминокислотные последовательности по изобретению предпочтительно имеют по меньшей мере 80% идентичность последовательности с приведенной аминокислотной последовательностью, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 98% идентичность последовательности, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность последовательности. По существу эквивалентная нуклеотидная последовательность по изобретению может иметь более низкую процентную идентичность последовательности, учитывая, например, избыточность или вырожденность генетического кода. Предпочтительно нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере приблизительно 65% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75% идентичность, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% идентичность последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 98% идентичность последовательности, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичность последовательности. Для целей настоящего изобретения, последовательности, имеющие по существу эквивалентную биологическую активность и по существу эквивалентные характеристики экспрессии, считают по существу эквивалентными. Для определения эквивалентности, укорочением зрелой последовательности (например, посредством мутации, которая создает случайный стоп-кодон) следует пренебрегать. Идентичность последовательности можно определить, например, с использованием способа Jotun Hein (Hein, J. (1990) Methods Enzymol. 183: 626-645). Идентичность между последовательностями также можно определять другими способами, известными в данной области, например, варьируя условия гибридизации.

Кроме того, изобретение относится к пептидной молекуле по изобретению для применения в медицине и/или к молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению для применения в медицине.

Предпочтительно изобретение относится к пептидной молекуле по изобретению и/или к молекуле нуклеиновой кислоты по изобретению для применения при профилактике и/или лечении незлокачественного состояния или злокачественного состояния.

Кроме того, изобретение относится к применению пептидной молекулы или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению для изготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения незлокачественного состояния или злокачественного состояния.

В следующем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей пептидную молекулу по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент, или состоящий из них.

В следующем аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент, или состоящий из них.

Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно доставлять с использованием инъецируемой системы для доставки с замедленным высвобождением. Они предназначены конкретно для снижения частоты инъекций. Примером такой системы является Nutropin Depot, которая инкапсулирует рекомбинантный гормон роста человека (rhGH) в биодеградируемые микросферы, которые после инъекции медленно высвобождают rhGH в течение длительного периода. Предпочтительно доставку проводят внутримышечно (i.m.) и/или подкожно (s.c.) и/или внутривенно (i.v.).

Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить с помощью хирургически имплантируемого устройства, которое высвобождает лекарственное средство прямо в требуемую область. Например, Vitrasert высвобождает ганцикловир прямо в глаз для лечения CMV-ретинита. Прямое применение этого токсического средства в пораженной области обеспечивает эффективную терапию без существенных системных побочных действий лекарственного средства.

Также для введения веществ, лекарственных средств и фармацевтических композиций по изобретению можно использовать системы для терапии с электропорацией (EPT). Устройство, которое доставляет импульсное электрическое поле к клеткам, повышает проницаемость клеточных мембран для лекарственного средства, что приводит к значительному повышению внутриклеточной доставки лекарственного средства.

Молекулы, лекарственные средства и фармацевтические композиции по изобретению также можно доста