Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности

Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к биотехнологической промышленности, микробиологическому производству, к генной инженерии микроорганизмов, в частности к способу получения L-аминокислоты методом ферментации с помощью подвижной бактерии семейства Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия гена(ов) каскада образования флагелл и клеточной подвижности изменена; в частности к способу получения L-треонина и L-фенилаланина с помощью указанной бактерии, в которой экспрессия одного или нескольких генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности усилена.

Уровень техники

Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе получают методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США №4,278,765) и модификации регуляторных последовательностей генов, таких как промотор, лидерная последовательность и/или аттенюатор или других, известных специалисту (патент США №20060216796 и WO 9615246 A1). Другие методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез L-аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию (также известному как ингибирование по принципу обратной связи) продуцируемой L-аминокислотой (WO 9516042 A1, ЕР 0685555 А1 или патенты США №4,346,170; 5,661,012 и 6,040,160).

Известны штаммы, используемые для получения L-треонина методом ферментации, включая штаммы, в которых усилена активность ферментов, участвующих в биосинтезе L-треонина (ЕР 0219027А2 или патенты США №5,175,107; 5,661,012; 5,705,371 и 5,939,307); штаммы, обладающие устойчивостью к таким химическим веществам, как L-треонин и его аналоги (WO 0114525A1, ЕР 301572А2, патент США №5,376,538); штаммы, в которых целевые ферменты не чувствительны к ингибированию по типу обратной связи синтезирующимися аминокислотами и побочными продуктами их синтеза (патенты США №5,175,107 и 5,661,012); и штаммы с инактивированными ферментами, катализирующими деградацию L-треонина (патенты США №5,939,307 и 6,297,031).

В литературе описаны подвижные бактерии, такие как Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Yersinia enterocolitica и другие подобные им, которые могут существовать в различных формах и встречаться в природе как в подвижном одноклеточном состоянии (состояние планктона), так и в состоянии оседлых клеток, которые за счет адгезии фимбрий образуют клеточные кластеры и поверхностные биопленки (O'Toole G.A. et al., Annu. Rev. Microbiol., 2000: 54, 49-79). Клетки Е. coli, например, обладают высокой подвижностью в период фазы постэкспоненциального роста (Amsler C.D. et al., J. Bacteriol., 1993: 175, 6238-6244), в то время как при входе в стационарную фазу происходит индукция фимбрий вида «керли» (ворсинки вида «керли»), обладающих адгезивными свойствами, что приводит к агрегации бактерий или их прилипанию к поверхности с образованием пленок (Olsen A. et al., Nature, 1989: 338,652-655).

Известно, что у Escherichia coli (далее Е. coli) образование флагелл и подвижность, а также «керли»-опосредованная адгезия контролируются регуляторными каскадами с прямой связью (каскадами регуляторов), где вершиной каждого каскада является свой мастер-регулятор, который действует как глобальный интегратор сигналов окружающей среды (Pesavento С. et al., Gen. Dev., 2011: 22, 2434-2446). Каскад, контролирующий образование фимбрий вида «керли», является элементом системы общего стрессового ответа, для которого мастер-регулятором является фактор 0^s (sigmaS, RpoS) (Hengge-Aronis R. 2000, The general stress response in Е. coli. In Bacterial stress responses (eds. G.Storz and R.Hengge-Aronis), pp.161-178. ASM Press, Washington, DC.). Основным активатором оперона, содержащего структурные гены фимбрий вида «керли», является белок CsgD (csgBAC (Gerstel U. et al., Mol. Microbiol., 2003: 49, 639-654).

Мастер-регулятором каскада образования флагелл и клеточной подвижности является комплекс FlhDC, оперон которого flhDC определен как флагеллярный оперон 1 класса. Флагеллярный мастер-регулятор функционирует как гетероолигомерный комплекс белков FlhD и FlhC (комплекс FlhD₄C₂), кристаллическая структура которого была охарактеризована применительно к бактерии Е. coli (Wang S. et al., J. Mol. Biol., 2006, 355:798-808). Комплекс FlhDC регулирует в бактерии транскрипцию различных флагеллярных и некоторых нефлагеллярных оперонов, в частности, он активирует экспрессию флагеллярных оперонов 2 класса, ответственных за внутреннюю часть флагеллы и ряд флагеллярных о-факторов (FliA, FlgM) (Pesavento С.et al., Gen. Dev., 2011: 22, 2434-2446). После секреции FlgM происходит высвобождение фактора FliA, который активирует опероны 3 класса, кодирующие субъединицы внешней части флагеллы, дополнительные белки, необходимые для функционирования флагелл и хемотаксиса, а также большое количество белков с неустановленной функцией (Aldrigde P.D. et al., Gen. Dev., 2006: 20, 2315-2326).

Другим ключевым регулятором экспрессии генов, ответственных за клеточную подвижность и образование фимбрий вида «керли», является фосфодиэстераза (ФДЭ), расщепляющая сигнальную молекулу бис-(3',5')-циклодигуанозинмонофосфат (цикло-ди-ГМФ) (Romling U. et al., Mol. Microbiol., 2005: 57, 629-639; Jenal U. and Malone J., Annu. Rev. Genet., 2006: 40, 385-407), например, ФДЭ YhjH и YciR (последняя, наряду с цикло-ди-ГМФ-фосфодиэстеразной активностью, также катализирует обратную реакцию, т.е. обладает дигуанилатциклазной активностью). Было показано, что сверхпродукция цикло-ди-ГМФ ФДЭ влияет на подвижность кишечных бактерий посредством значительной инактивации процесса образования фимбрий вида «керли» и целлюлозных компонентов матрикса биопленок (Romling U. et al., Mol. Microbiol., 2005: 57, 629-639; Jenal U. и Malone J., Annu. Rev. Genet., 2006: 40, 385-407). В частности, было показано, что YhjH положительно влияет на подвижность бактерий (Ko М. и Park С., J. Mol. Biol., 2000: 303, 371-382).

Белок FliZ - продукт гена, расположенного в опероне непосредственно после гена fliA, - является высокоэффективным ингибитором процесса образования фимбрий вида «керли» у Е. coli, что обусловлено воздействием на активность σ^S-фактора - мастер-регулятора, контролирующего экспрессию генов, ответственных за образование фимбрий вида «керли» (Pesavento С. et al., Gen. Dev., 2011: 22, 2434-2446). Более детально, FliZ временно обеспечивает приоритет подвижности (и, следовательно, приоритет режима питания) над общей стрессовой реакцией микроорганизма, пока поддерживается экспрессия флагеллярных генов.

Бактерия семейства Enterobacteriaceae, модифицированная таким образом, что экспрессия генов оперонов csgBAC и/или csgDEFG ослаблена (патент РФ №2338782), или таким образом, что не происходит образование белка фимбриллярного адгезина 1 типа (ЕР 1838726 А1), была использована для получения L-аминокислот, в частности, L-треонина.

Более того, известно, что микроорганизмы, имеющие флагеллы, в которых один или несколько генов, обусловливающих строение или подвижность флагелл, инактивирован(ы) или удален(ы), могут быть использованы для получения полезных веществ, в частности, L-аминокислот (WO 2002097089 A1).

Однако, в настоящее время нет сообщений о том, что усиление экспрессии бактериальных генов (flhDC, yhjH и fliZ), вовлеченных в каскад образования флагелл и клеточной подвижности, оказывает положительный эффект на продукцию L-аминокислот и, в особенности, L-треонина и L-фенилаланина.

Раскрытие сущности изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae, в частности, относящейся к роду Escherichia, Enterobacter или Pantoea, модифицированной таким образом, что экспрессия одного или нескольких генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности усилена, а также предоставление способа получения L-аминокислоты, в частности, L-треонина и L-фенилаланина с использованием указанной бактерии. Вышеупомянутая цель была достигнута за счет неожиданного обнаружения того факта, что усиление экспрессии гена(ов) каскада образования флагелл и клеточной подвижности, например, генов оперона flhDC у Е. coli, кодирующего парные регуляторы транскрипции FlhD и FlhC, образующие флагеллярный мастер-регулятор FlhD4C2, приводит к повышению продукции L-аминокислот. Авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили, что использование генов оперона flhDC в комбинации с другими генами каскада образования флагелл и клеточной подвижности, такими как yhjH и fliZ, имеющими повышенный уровень экспрессии, также способствует повышенной продукции L-аминокислоты.

Объектом настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, включающего выращивание в питательной среде бактерии, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae и способной производить L-аминокислоту, и выделение указанной L-аминокислоты из культуральной жидкости, отличающегося тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия по крайней мере одного из генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности усилена.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что экспрессия гена(ов) каскада образования флагелл и клеточной подвижности усилена путем усиления экспрессии по крайней мере одного из генов, выбранных из группы, состоящей из гена(ов) оперона flhDC, гена yhjH и гена fliZ, или их комбинации.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что экспрессия гена(ов) оперона flhDC усилена путем изменения регуляторной области, контролирующей экспрессию указанного(ых) гена(ов).

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что экспрессия гена(ов) оперона flhDC усилена путем увеличения числа копий гена(ов) оперона flhDC.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанная бактерия является Escherichia coli.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Enterobacter.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что ген flhD кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из:

(А) белка, включающего аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2;

(B) белка, включающего аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:2, но в которой один или несколько аминокислотных остатков замещен, удален, вставлен, добавлен или инвертирован, причем указанный белок имеет активность ДНК-связывающего парного регулятора транскрипции согласно последовательности SEQ ID NO:2; и

(C) их комбинации.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что renflhC кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из:

(D) белка, включающего аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:4;

(Е) белка, включающего аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:4, но в которой один или несколько аминокислотных остатков замещен, удален, вставлен, добавлен или инвертирован, причем указанный белок имеет активность ДНК-связывающий парного регулятора транскрипции согласно последовательности SEQ ID NO:4; и

(F) их комбинации.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что ген yhjH кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из:

(G) белка, включающего аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:6;

(Н) белка, включающего аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:6, но в которой один или несколько аминокислотных остатков замещен, удален, вставлен, добавлен или инвертирован, причем указанный белок имеет активность цикло-ди-ГМФ фосфодиэстеразы согласно последовательности SEQ ID NO:6; и

(I) их комбинации.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что ген fliZ кодирует белок, выбранный из группы, состоящей из;

(J) белка, включающего аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:8;

(K) белка, включающего аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO:8, но в которой один или несколько аминокислотных остатков замещен, удален, вставлен, добавлен или инвертирован, причем указанный белок имеет активность регулятора согласно последовательности SEQ ID NO:8; и

(L) их комбинации.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что L-аминокислота есть ароматическая L-аминокислота.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что ароматическая L-аминокислота есть L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что L-аминокислота есть неароматическая L-аминокислота.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что неароматическая L-аминокислота есть L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-глутаминовая кислота, L-пролин, L-аргинин и глицин.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что L-аминокислота есть L-фенилаланин.

Следующим объектом настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, отличающегося тем, что L-аминокислота есть L-треонин.

Настоящее изобретение более подробно будет описано ниже со ссылкой на последующие, но не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.

Фигуры и их краткое описание

На Фигуре 1 изображена схема конструирования ДНК-фрагмента kan-P_tac7.

На Фигуре 2 изображена схема конструирования ДНК-фрагмента cat-P_yhjH7-yhjH.

На Фигуре 3 изображена схема конструирования ДНК-фрагмента cat-P_tac7.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

1. Бактерия согласно настоящему изобретению

Используемый в настоящем изобретении термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» может означать бактерию, в том числе и более предпочтительно подвижную бактерию, которая способна продуцировать и вызывать накопление L-аминокислоты в культуральной жидкости, когда указанная бактерия выращивается (культивируется) в питательной среде. Способность бактерии продуцировать L-аминокислоту может означать способность бактерии продуцировать L-аминокислоту в питательной среде или в бактериальных клетках, что приводит к накоплению L-аминокислоты в количествах, достаточных для ее выделения из культуральной жидкости или из бактериальных клеток, когда указанная бактерия выращивается (культивируется) в питательной среде.

Термин «L-аминокислота» обозначает и может включать в себя такие белок-образующие L-аминокислоты, как L-аланин, L-аргинин, L-аспарагин, L-аспарагиновую кислоту, L-цитруллин, L-цистеин, L-глутаминовую кислоту, L-глутамин, глицин, L-гистидин, L-изолейцин, L-лейцин, L-лизин, L-метионин, L-орнитин, L-фенилаланин, L-пролин, L-серин, L-треонин, L-триптофан, L-тирозин и L-валин.

Термин «ароматическая L-аминокислота» может включать в себя L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан. Термин «неароматическая L-аминокислота» может включать в себя L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-метионин, L-лейцин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, глицин, L-серин, L-аланин, L-аспарагин, L-аспартат, L-глутамин, L-глутаминовую кислоту, L-пролин, L-цитруллин, L-орнитин и L-аргинин. L-треонин, L-лизин, L-цистеин, L-лейцин, L-гистидин, L- глутаминовую кислоту, L-фенилаланин, L-триптофан, L-пролин и L-аргинин более предпочтительны.

Бактерия может обладать способностью к продукции аминокислот изначально, в соответствии со своими природными характеристиками, или может быть модифицирована с помощью мутаций (мутагенеза) или технологий рекомбинантных ДНК таким образом, чтобы она получила способность продуцировать аминокислоты.

Подвижная бактерия, принадлежащая семейству Enterobacteriaceae, может быть выбрана из бактерий, относящихся к родам, входящим в состав этого семейства, таких как Enterobacter, Envinia, Escherichia, Morganella, Pantoea, Salmonella, Yersinia и т.д., и способных продуцировать L-аминокислоты. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=^:543). Предпочтительна для модификаций согласно данному изобретению бактерия, относящаяся к роду Escherichia, Enterobacter или Pantoea.

Выбор штаммов бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть модифицированы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, в качестве примеров, бактерии рода Escherichia, описанные в книге Neidhardt et al. (Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-12, p.2460-2488. In F.C. Neidhardt et al. (ed.), E. coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2^nd ed. ASM Press, Washington, D.C., 1996) могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению. В качестве конкретного примера могут быть взяты штаммы E. coli., включая E. coli W3110 (АТСС 27325), E. coli MG1655 (АТСС 47076), и т.д., которые происходят из исходного штамма дикого типа, т.е. штамма E. coli K-12. Этот штамм может быть получен, в частности, из Американской коллекции типовых культур «American Type Culture Collection, (АТСС)» (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). Каждому штамму присвоен индивидуальный регистрационный номер, и штаммы могут быть заказаны согласно регистрационному номеру (см. ссылку www.atcc.org). Регистрационные номера штаммов находятся в списке каталога Американской коллекции типовых культур «American Type Culture Collection, АТСС».

Примеры бактерий Enterobacter включают Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, и т.д. Примеры бактерии Pantoea включают Pantoea ananatis, и т.д. Недавно некоторые виды Enterobacter agglomerans были переклассифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis или Pantoea stewartii на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств. Бактерии, относящиеся к роду Enterobacter или Pantoea, могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, так как принадлежат семейству Enterobacteriaceae. Полученные с использованием технологий генной инженерии штаммы Pantoea ananatis, такие как штамм Pantoea ananatis AJ 13355 (FERM ВР-6614), штамм AJ 13356 (PERM BP-6615), штамм AJ 13601 (PERM BP-7207) и их производные могут быть использованы по данному изобретению. Эти штаммы были классифицированы как Enterobacter agglomerans при выделении, и они депонированы как Enterobacter agglomerans. Однако позднее они были классифицированы как Pantoea ananatis на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и других доказательств.

Термин «подвижная бактерия», используемый в настоящем изобретении, может означать бактерию в одноклеточном или планктонном состоянии, проявляющую способность к самопроизвольному движению, но не ограниваясь этим, в подходящих условиях при помощи пропеллерного движения флагеллы или флагелл, причем эта способность проявляется в определенной фазе клеточного роста, например, фазе выраженного роста, постэкспоненциального роста или при вхождении в указанные фазы при культивировании клеток в питательной среде. В частности, может быть использована подвижная бактерия, описанная в «Bergey's Manual of Systematic Bacteriology» (2^nd ed., Springer, New York). Термин «подвижная бактерия», используемый в настоящем изобретении, также может означать бактерию, обладающую способностью к поступательному перемещению в культуральной среде и вращению со скоростью, такой же, или более низкой, или более высокой, чем немодифицированная родительская бактерия или бактерия дикого типа.

Настоящее изобретение может быть реализовано путем усиления или повышения экспрессии гена(ов), ассоциированных с каскадом образования флагелл и клеточной подвижности.

Используемый в данном изобретении термин «гены, ассоциированные с каскадом образования флагелл и клеточной подвижности» может означать любой ген или гены каскада образования флагелл и клеточной подвижности, которые кодируют белок или белки, прямо или опосредованно вовлеченный(е) в процессы образования или сборки функциональных флагелл или в процессы стимуляции или поддержания клеточной подвижности различными механизмами. Примером генов, ассоциированных с каскадом образования флагелл и клеточной подвижности, могут являться, не ограничиваясь ими, гены оперона flhDC, кодирующие ключевой регуляторный комплекс FlhD₄C₂ (мастер-регулятор), который является положительным регулятором образования флагелл. Другими примерами генов, ассоциированных с каскадом образования флагелл и клеточной подвижности, могут являться ген yhjH, кодирующий цикло-ди-ГМФ ФДЭ, снижающий пул сигнальных молекул цикло-ди-ГМФ в бактерии (и являющийся положительным регулятором подвижности), а также ген fliZ, кодирующий регулятор FliZ, влияющий на активность σ^S-фактора.

Используемый в настоящем изобретении термин «функциональная флагелла» может означать правильно сформированную флагеллу, способную к вращательным и другим формам движения, что позволяет считать бактерию подвижной бактерией.

Термин «бактерия, модифицированная таким образом, что экспрессия по крайней мере одного гена каскада образования флагелл и клеточной подвижности усилена», используемый в данном изобретении, может означать, что количество молекул, кодируемых генами оперона flhDC и/или геном yhjH и/или геном fliZ, содержащихся в бактериальной клетке (количество молекул в пересчете на одну клетку) или активность этих молекул (специфическая активность) в бактериальной клетке увеличены относительно соответствующих показателей для немодифицированного бактериального штамма (дикого или родительского штамма). Бактерия может быть модифицирована таким образом, что активность белков в клетке возрастает до 150% или более, или до 200% или более, или до 300% или более по сравнению с активностью немодифицированного штамма. Примерами немодифицированных штаммов, являющимися референсными для сравнения указанной выше активности, являются, например, дикие штаммы микроорганизма Enterobacteriaceae, такие как штаммы Е. coli MG1655 (АТСС 47076) и W3110 (АТСС 27325) и штамм Pantoea ananatis AJ 13335 (FERM ВР-6614) и т.п.

Методы, которые могут быть использованы для усиления экспрессии отдельных генов или генов оперонов, включают, например, увеличение числа копий генов или оперонов в бактериальной хромосоме и/или вставку генов или оперонов в вектор, способный функционировать в бактерии семейства Enterobacteriaceae, и увеличивать число копий гена. Усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем введения множества копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации. Число копий генов может быть увеличено методом лигирования фрагментов ДНК, содержащих целевой ген, в вектор, способный функционировать в бактерии-хозяине, такой как мультикопийный вектор, получить рекомбинантную ДНК, ввести в бактериальную клетку и трансформировать бактерию. Примеры векторов, автономно реплицирующихся в клетках Е. coli, включают, но не ограничиваются ими, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184 (серии векторов pHSG и pACYC доступны от Takara Bio Inc.), RSF1010, pBR322, pMW219 (pMW219 доступны от Nippon Gene Co., Ltd.), pSTV29 (доступны от Takara Bio Inc.) и т.п.

Усиление экспрессии гена может быть достигнуто также путем введения множества копий гена или оперона в хромосомную ДНК бактерии, например, методом гомологичной рекомбинации. Mu интеграции и т.п. Гомологичная рекомбинация может быть проведена с использованием в качестве целевых последовательностей, присутствующих в хромосоме во множестве копий. Последовательности с множеством копий в хромосомной ДНК включают, но не ограничиваются ими, повторяющиеся ДНК или инвертированные повторы, присутствующие на концах мобильных элементов. Также возможно включить ген или гены оперона в состав транспозона и обеспечить его перенос для введения множества копий гена или оперона в хромосомную ДНК. При использовании Mu интеграции один акт Mu интеграции позволяет ввести в бактериальную хромосому до 3 копий гена.

Усиление экспрессии гена или генов оперона также может быть достигнуто путем подстановки фрагмента ДНК под контроль сильного промотора. Примерами сильных промоторов являются lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_R или P_L промоторы фага λ. Использование сильного промотора, принадлежащего семейству Enterobacteriaceae, может быть использовано в данном изобретении.

С другой стороны, действие промотора может быть усилено, например, введением мутации в промоторный район гена или оперона, ведущей к увеличению уровня транскрипции локализованного за промотором гена или генов оперона. Кроме того, известно, что замена нескольких нуклеотидов в области между сайтом связывания рибосомы (ribosome binding site - RBS) и стартовым кодоном, особенно в последовательности непосредственно перед стартовым кодоном, существенно влияет на трансляционную способность мРНК. Например, обнаружен 20-кратный разброс в уровне экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих стартовому кодону (Gold L. et al., Annu. Rev. Microbiol., 1981: 35, 365-403; Hui A. et al., EMBO J., 1984: 3, 623-629). Использование сильного промотора можно сочетать с увеличением копий гена.

Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook J., Fritsch E.F. и Maniatis Т., «Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed.», Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Методы молекулярного клонирования и экспрессии гетерологичных генов описаны в Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak и Cheryl L. Patten, «Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA», 4^th ed., Washington, D.C: ASM Press (2009); Evans Jr., T.C. and Xu M.-Q., «Heterologous gene expression in E. coli», 1^st ed., Humana Press (2011).

Уровень экспрессии гена можно определить измерением количества транскрибируемой геном мРНК, используя для этого различные известные методы, включая Нозерн-блоттинг, количественную ОТ-ПЦР (RT-PCR) и т.п. Количество белков, кодируемых геном, можно определить известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ (SDS-PAGE) с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) (Western blotting analysis) и подобными.

Термин «ген(ы) оперона flhDC, ген yhjH и ген fliZ в любой комбинации» применительно к данному изобретению может означать, что в предпочтительном варианте осуществления изобретения в частности, но не ограничиваясь этим, изобретение (результат) достигается за счет использования или одного гена, выбранного из гена(ов) оперона flhDC, гена yhjH и гена fliZ, или двух или более различных генов, выбранных из гена(ов) оперона flhDC и генов yhjH и fliZ в различной комбинации.

Термин «по крайней мере один из генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности» может означать один или более генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности и может включать, не ограничиваясь этим, ген(ы) оперона flhDC, гены yhjH и fliZ к любой комбинации.

Оперон flhDC состоит из двух генов - flhD и flhC.

Ген flhD кодирует ДНК-связывающий парный регулятор транскрипции FlhD (KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, инвентарный №bl892). Ген flhD (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам в положении с 1,975,871 по 1,976,221; GenBank, инвентарный №NC_000913.2; Gene ID: 945442) расположен между генами flhC и ins В на хромосоме Е. coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена flhD и аминокислотная последовательность белка FlhD, кодируемого геном flhD, представлены в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, соответственно.

Ген flhC кодирует ДНК-связывающий парный регулятор транскрипции FlhC (KEGG, инвентарный №Ы891). Ген flhC (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам в положении с 1,975,290 по 1,975,868; GenBank, инвентарный №NC_000913.2; Gene ID: 947280) расположен между генами motA и flhD на хромосоме Е. coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена flhC и аминокислотная последовательность белка FlhC, кодируемого геном flhC, представлены в SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, соответственно.

Ген yhjH кодирует цикло-ди-ГМФ фосфодиэстеразу YhjH (KEGG, инвентарный №Ь3525). Ген yhjH (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам в положении с 3,676,443 по 3,677,210; GenBank, инвентарный №NC_000913.2; Gene ID: 948042) расположен между генами yhjG и kdgK на хромосоме Е. coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена yhjH и аминокислотная последовательность белка YhjH, кодируемого геном yhjH, представлены в SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, соответственно.

Ген fliZ кодирует белок FliZ, являющийся антагонистом RpoS и вероятным регулятором активности FliA (KEGG, инвентарный №В 1921). Ген fliZ (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам в положении с 1,998,497 по 1,999,048; GenBank, инвентарный №NC_000913.2; Gene ID: 946833) расположен между генами fliY and fliA на хромосоме Е. coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена fliZ и аминокислотная последовательность белка FliZ, кодируемого геном fliZ, представлены в SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, соответственно.

Ввиду того, что могут быть некоторые различия в последовательностях ДНК между родами и штаммами бактерий семейства Enterobacteriaceae, гены оперона flhDC и гены yhjH и fliZ не ограничиваются нуклеотидными последовательностями генов, приведенных в SEQ ID NOs:1, 3, 5 и 7, однако могут включать гены, гомологичные нуклеотидным последовательностям SEQ ID NOs:1, 3, 5 и 7, кодирующие варианты белков FlhD, FlhC, YhjH и FliZ.

Термин «вариант белка», используемый в настоящем изобретении, может означать белок, который содержит изменения в последовательности, которыми могут быть делеции, вставки, добавления или замены аминокислотных остатков, при условии, что активность такого белка такая же, как и у белков FlhD, FlhC, YhjH и FliZ, соответственно. Количество изменений в вариантах белков зависит от вида или положения аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15 и еще более предпочтительно от 1 до 5 в SEQ ID NO:2, 4, 6 и 8.

Консервативными заменами могут быть взаимные замены между Phe, Trp и Tyr, если сайт замещения содержит ароматическую аминокислоту; между Leu, Ile и Val, если сайт замещения содержит гидрофобную аминокислоту; между Gln и Asn, если сайт замещения содержит полярную аминокислоту; между Lys, Arg и His, если сайт замещения содержит основную аминокислоту; между Asp и Glu, если сайт замещения содержит кислую аминокислоту; между Ser и Thr, если сайт замещения содержит аминокислоту, имеющую гидроксильную группу. Специфическими примерами консервативных замен могут быть замены Ser или Thr на Ala; замена Gln, His или Lys на Arg; замена Glu, Gln, Lys, His или Asp на Asn; замена Asn, Glu или Gln на Asp; замена Ser или Ala на Cys; замена Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg на Gln; замена Gly, Asn, Gln, Lys или Asp на Glu; замена Pro на Gly; замена Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr на His; замена Leu, Met, Val или Phe на Ile; замена Ile, Met, Val или Phe на Leu; замена Asn, Glu, Gln, His или Arg на Lys; замена Ile, Leu, Val или Phe на Met; замена Trp, Tyr, Met, Ile или Leu на Phe; замена Thr или Ala на Ser; замена Ser или Ala на Thr; замена Phe или Tyr на Tip; замена His, Phe или Trp на Tyr; и замена Met, He или Leu на Val. Описанные выше мутации аминокислотных остатков, такие как делеции, вставки, добавления, замены или подобные также могут включать мутации, происходящие естественным образом ввиду индивидуальных различий видов микроорганизмов, имеющих гены оперона flhDC и гены yhjH и fliZ (мутантные или варианты), и т.п.

В вариантах белков подобные изменения могут быть в областях, не критичных для функции белка, так как некоторые аминокислоты в высокой степени гомологичны другим, и поэтому третичная структура или активность белка не затрагивается ввиду этих изменений. Следовательно, варианты белков, кодируемые генами оперона flhDC и генами yhjH и fliZ, могут иметь гомологию не менее чем 80%, предпочтительно не менее чем 90%, более предпочтительно не менее чем 95% по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NOs:2, 4, 6 и 8, при условии, что активность и/или функция соответствующих белков FlhD и FlhC, а также комплекса FlhD₄C₂, образуемого белками FlhD и FlhC, а также белков YhjH и FlizH сохранена. Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), которая считает три параметра: число аминокислотных остатков, идентичность и сходство.

Кроме того, гены оперона flhDC и гены yhjH и fliZ могут быть вариантами, если они гибридизуются в жестких условиях с нуклеотидными последовательностями, комплементарными нуклеотидным последовательностям, приведенным в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NOs:1, 3, 5 и 7, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанных нуклеотидных последовательностей, при условии, что он кодирует функциональные белки FlhD и FlhC, а также комплекс FlhD4C2, образуемый белками FlhD и FlhC, а также белки YhjH и FliZ.

Под «жесткими условиями» понимаются такие условия, в которых образуются специфические гибриды, например, гибриды, имеющие гомологию, не менее чем 80%, или в другом примере не менее чем 90%, или в другом примере не менее чем 95%, или в другом примере не менее чем 97%, или в другом примере не менее чем 99%, и в которых не образуются неспецифические гибриды, например, гибриды, имеющие гомологию меньшую, чем указанно выше. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, или в другом примере 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С, или в другом примере при 65°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для положительно заряженной нейлоновой мембраны Hybond™-N+(Amersham) при строгих условиях составляет 15 минут. Предпочтительна двух- или трехкратная отмывка.

Гены, кодирующие белки Е. coli FlhD, FlhC, YhjH и FliZ, известны (см. описание выше), поэтому эти гены и гены, кодирующие варианты указанных выше белков, могут быть получены с использованием метода ПЦР (полимеразная цепная реакция; White T.J. et al., Trends Genet., 1989: 5, 185-189) с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности генов flhD, flhC, yhjH и fliZ, соответствующих указанным выше белкам. Более конкретно, в качестве зонда может быть использована часть последовательности, комплементарная последовательности, приведенной в SEQ ID NOs:1, 3, 5 и 7. Подобный зонд может быть получен с помощью ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, приготовленных на основе последовательностей, приведенных в SEQ ID NOs:1, 3, 5 и 7, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность, в качестве матрицы. Рекомендуемая длина зонда составляет >50 п.н., и она может быть подобрана в зависимости от условий гибридизации, в данном конкретном случае она может быть около 100-1000 п.н. Например, при использовании в качестве зонда фрагмента ДНК длиной около 300 п.н. условия отмывки могут быть как 2×SSC, 0.1% SDS при 50°С, или в другом примере при 60°С, или в другом примере при 65°С.

Методы, которые могут быть использованы для придания бактерии семейства Enterobacteriaceae способности продуцировать L-аминокислоту, такую как L-лизин, L-треонин, L-аспарагиновую кислоту, L-аспарагин, L-метионин, L-аланин и/или L-изолейцин, а также методы повышения способности бактерии семейства Enterobacteriaceae производить эти L-аминокислоты, описаны ниже.

Для получения бактерий рода Escherichia или коринеформных бактерий, способных продуцировать L-аминокислоты (в том числе тех, исходные штаммы которых не обладают такой способностью), могут применяться общепринятые методы («Amino acid fermentation», Gakkai Shuppan Center (Ltd.), pp.77-100, 1^st ed., 1986). Эти методы сводятся к получению мутантных штаммов-ауксотрофов; штаммов, устойчивых к аналогам L-аминокислот; штаммов с мутациями, затрагивающими регуляцию метаболизма; или рекомбинантных штаммов, обладающих сверхэкспрессией ферментов биосинтеза L-аминокислот. При получении продуцирующих L-аминокислоты бактерий может достигаться одно или несколько из указанных свойств, таких как ауксотрофия, устойчивость к аналогам L-аминокислот или изменения в регуляции метаболизма с помощью мутагенеза. Экспрессия ферментов биосинтеза L-аминокислот может быть усилена как для одного фермента, так для комбинации двух или более ферментов. Более того, методы приобретения свойств ауксотрофии, устойчивости к аналогам L-аминокислот или мутац