Ассоциация штаммов бактерий-нефтедеструкторов и способ ремедиации нефтезагрязненных объектов

Ассоциация штаммов бактерий-нефтедеструкторов и способ ремедиации нефтезагрязненных объектов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии защиты окружающей среды, в частности для ремедиации почв, загрязненных нефтепродуктами.

Биопрепараты, созданные на основе ассоциаций микроорганизмов-нефтедеструкторов, способных окислять широкий спектр углеводородов нефти - от длинноцепочечных алканов до полиароматических соединений, успешно используются в технологии ремедиации (очистки) нефтезагрязненных объектов. Биопрепараты предназначены для очистки от нефти и нефтепродуктов почв и акваторий, для восстановления функций самоочищения почвы и водоемов, очистки сточных вод промышленных предприятий, очистки стоков автомоек, СТО, АЗС, территорий предприятий нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности, депарафинизации скважин, технических резервуаров.

Известны коммерческие препараты на основе нефтеокисляющих микроорганизмов. В состав препаратов входят монокультуры (препараты «Путидойл», «Экойл», «Дестройл» и др.) или ассоциации с двумя и более чем двадцатью видами различных нефтеокисляющих микроорганизмов: бактерий, грибов, дрожжей («Деворойл», «Simbinal», «Родоторин») (таблица 1).

В последнее время все чаще используют биопрепараты, состоящие из 2 и более штаммов, поскольку использование монокультуры не может полностью решить проблему очистки. Нефть - сложный многокомпонентный субстрат, содержащий несколько сотен различных химический соединений (Барышникова Л.М., Грищенков В.Г., Аринбасаров М.У., Шкидченко А.Н., Воронин A.M. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде // Прикл. биохим. и микробиол. - 2001. - Т.37. - №5. - С.542-548), и один штамм не способен обладать всем спектром ферментов, необходимых для биодеградации. Использование же нескольких штаммов, отличающихся по спектру потребляемых субстратов, может приводить к полной деструкцией нефти (Кобзев Е.Н., Петрикевич С.Б., Шкидченко А.Н. Исследование устойчивости ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов в открытой системе // Прикл. биохим. и микробиол. - 2001. - Т.37. - №4. - С.413-418).

В условиях природного микробиоценоза наблюдается одновременная ассимиляция разных фракций нефти различными группами микроорганизмов (Шкидченко А.Н., Аринбасаров М.У. Изучение нефтедеструктивной активности микрофлоры прибрежной зоны Каспийского моря // Прикл. биохим. и микробиол. - 2001. - Т.38. - №5. - С.509-512).

При совместном использовании нескольких штаммов-деструкторов в консорциуме их нефтеутилизирующий эффект усиливается. Причинами этого являются:

- разное приоритетное использование составляющих компонентов нефти различными штаммами;

- разная скорость роста микроорганизмов;

- продуцируемые штаммом метаболиты, которые могут являться факторами роста для других штаммов консорциума.

Условия применения большинства биопрепаратов требуют организации доступа кислорода в почву, поддержания влажности грунта не ниже 40% регулярным дождеванием и переворачиванием. Рабочий рН биопрепаратов обычно от 5 до 9, рабочая температура от +10 до +40°С. При понижении температуры окружающего воздуха до +5°С рост бактерий замедляется, вплоть до полной остановки биологической активности. При последующем повышении температуры микроорганизмы вновь начинают размножаться.

При выборе штамма для разработки препарата обычно следует учитывать такие критерии, как высокая нефтеокисляющая активность, устойчивость к солям тяжелых металлов, непатогенность и нетоксичность штамма для человека и животных (Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде // Прикл. биохим. и микробиол. - 1996. - Т.32. - №6. - С.579-585). В связи с тем, что технологии микробиологической очистки загрязненных почв предусматривают аэробные условия, необходимо вести выбор микроорганизма-деструктора среди аэробных и факультативно-анаэробных штаммов. Кроме того, клетки штамма должны обладать высокой жизнестойкостью, чтобы быть способными к росту и утилизации нефтепродукта в условиях широкого диапазона температур, рН среды, влажности, нехватки питательных элементов (Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В. Н. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв. // Прикл. биохим. и микробиол. - 1995. - Том 31. - №5. - С.534-539).

В России имеются разнообразные биопрепараты, разработанные для очистки почв от нефтяных загрязнений (коммерческие названия препаратов: Авалон, Бациспецин, Валентис, Деворойл, Достроил, Нафтокс, Никаойл, Петролан, Путидойл, Родер, Универсал и др.) (Патент РФ №2077397); (Дядечко В.Н. Толстокорова Л.Е. Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья //Почвоведение, 1990, N 9, с.148-151); (патенты РФ №№2114071, 2053205).

Самыми известными из них и давно применяющимися на практике являются биопрепараты Путидойл (Дядечко В.Н. Толстокорова Л.Е. Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтеагрязненных песочных почв Среднего Приобья // Почвоведение, 1990, N 9, с.148-151) и Деворойл (патент №2114071 от 22.05.97).

Известно, что препарат Путидойл состоит из одного штамма бактерии Pseudomonas putida 36. Препарат получают глубинным культивированием бактерии в питательной среде при 30°С, в аэробных условиях, с последующей распылительной сушкой либо лиофилизацией полученной культуральной жидкости (патент РФ 2053205). Поскольку препарат Путидойл является монокультурой, он обладает меньшим потенциалом и более узким спектром действия на углеводороды, чем препараты, состоящие из двух и более штаммов микроорганизмов, например Деворойл.

Известно, что в состав препарата Деворойл входят штаммы Pseudomonas stutzeri, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus maris, Rhodococcus sp., Yarrowia lipolytica (ранее Candida sp.) (патент РФ №2114071 от 22.05.97). В соответствии с патентом Деворойл также получают глубинным культивированием в питательной среде входящих в его состав микроорганизмов и последующим высушиванием полученной биомассы. Однако Деворойл состоит из микроорганизмов различной таксономической и видовой принадлежности, требующих раздельного выращивания, что существенно усложняет и удорожает процесс наработки препарата. С другой стороны, при совместном культивировании микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам и различающимся по скорости роста, субстратной специфичности, температурному оптимуму роста и пр., возникает конкурентная борьба за источники питания, и в результате в таком препарате выживают не все виды из заявленных, и, соответственно, уменьшается эффективность такого препарата.

Недостатком биопрепарата "Деворойл", помимо необходимости раздельного выращивания, входящих в него микроорганизмов, является применение дорогостоящей углеводной среды для получения биомассы препарата и более высокая температура культивирования 20-40°С, что ограничивает область применения только в средней и южной полосе России.

Известен консорциум штаммов микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species, используемый для очистки воды и почв от нефти и нефтепродуктов (патент РФ №2232806). Недостатком способа следует признать его низкую эффективность в случаях высокой степени загрязненности нефтью.

Природное микробное сообщество почвы, включающее большое количество бактерий-деструкторов, при небольших дозах загрязнения справляется с разложением нефтяных углеводородов, поэтому при небольших загрязнениях (менее 10%) в средней полосе России рациональнее создавать подходящие условия для деятельности аборигенных бактерий, чем интродуцировать новые виды. Однако, в случае северных экосистем с обедненным видовым разнообразием и лимитирующими количествами питательных веществ, даже при загрязнениях около 10% целесообразнее использование биопрепаратов. Внесение адаптированных микроорганизмов, разрушающих нефтепродукты, также рекомендуется в случае, если физико-химические характеристики места загрязнения делают невозможным рост естественной микробиоты (высокие концентрации тяжелых металлов, засоленность почвы, экстремальные значения рН и др.).

Задача изобретения - создание ассоциации бактерий, окисляющих нефть и нефтепродукты, и способ ремедиации нефтезагрязненных объектов Сибирского Севера с использованием этой ассоциации, компоненты которой являются аборигенными штаммами, не проявляют антагонизма в отношении эндогенных микроорганизмов, способны расти при пониженных температурах (4-10°С), низких значениях рН (4,5-6), повышенном содержании NaCl (1-4%), утилизировать широкий спектр компонентов нефти при температурах 10-15°С.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности очистки нефтезагрязненных объектов при низкой температуре окружающей среды (3-15°С).

Поставленная задача решена созданием ассоциации выделенных из нефтезагрязненной почвы Сибирского Севера бактерий, депонированых в коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор":

Acinetobacter species, регистрационный номер В-1037; Pseudomonas species, регистрационный номер В-989; Bacillus species, регистрационный номер В-1040, взятых примерно в равных количествах. Для ремедиации нефтезагрязненных объектов используют водную суспензию леофильно высушенных бактерий ассоциации из расчета 10⁹ клеток на м².

Сбор образцов. Для того чтобы не нарушать биоразнообразие экосистемы, для каждого региона необходима своя охарактеризованная композиция микроорганизмов.

В качестве субстратов для выделения штаммов, имеющих широкий спектр ферментов, разрушающих сложные органические вещества, использовали нефтезагрязненные почвы в местах нефтедобычи (Ханты-Мансийский автономный округ, Ямало-Ненецкий автономный округ). Образцы воды и иловых отложений помещали в стерильные пластиковые пробирки объемом 50 мл, образцы почвы и грунта помещали в стерильные бумажные пакеты и в стерильные пластиковые пробирки объемом 50 мл.

Выделение микроорганизмов-деструкторов нефти. Образцы природных субстратов инкубировали в жидкой селективной питательной среде 8Е (г/л): (NH₄)₂HPO₄ - 1.5; KH₂PO₄ - 0.7; MgSO₄×7Н₂О - 0.8; NaCl - 0.5; pH 7.2 с добавлением нефтепродукта по весу (до 0,5 - 2%) на качалке при температурах 10°С; затем полученные накопительные культуры переносили на агаризованную среду 8Е. Микроорганизмы, обладающие способностью к активному росту на селективных питательных средах с нефтью, были выделены в чистые культуры. Всего выделено 34 штамма, из них были отобраны 3 штамма, обладающие высокой нефтеутилизирующей способностью, относительно высокой скоростью роста при температуре 10°С, кислых значениях pH и повышенном содержании солей в среде. Штаммы были идентифицированы по биохимическим и физиологическим признакам. Первичная биодеградация нефти в пробирках оценивалась по следующим параметрам: разбиванию поверхностной пленки нефти, помутнению питательной среды за счет роста биомассы, образованию однородной эмульсии нефти в среде, газообразованию.

Морфологические признаки полученных изолятов-деструкторов изучали с помощью световой микроскопии живых и окрашенных клеток с использованием микроскопа Carl Zeiss Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия). Изучение физиологических, биохимических свойств, проводили стандартными методами (Методы общей бактериологии, 1983; Определитель бактерий …, 2001).

Селекционированные штаммы имеют следующие морфологические, физиолого-биохимические свойства.

Штамм Acinetobacter species В-1037на плотных питательных средах образует белесые, полупрозрачные, блестящие, гладкие колонии с ровным краем; клетки штамма представляют собою грамотрицательные, подвижные палочки, размером 0.8×1,7-2 мкм. Штамм Acinetobacter species В 1037 является аэробом, растет в диапазоне температур от 4-6 до 35°С; не гидролизует крахмал, казеин, не обладает протеолитической активностью, каталазоположительный, сбраживает глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, сахарозу, сорбит с газообразованием, не разжижает желатин. Обладает цитратной активностью, растет на РПА с концентрацией NaCl 5%; не обладает гемолитическими свойствами.

Штамм Bacillus species 1040 на плотных питательных средах образует белесые, полупрозрачные, блестящие, гладкие колонии с ровным краем; клетки штамма представляют собою грамположительные палочки, размером 1×1.2-1.5 мкм. Штамм Bacillus species 1040 является аэробом, растет в диапазоне температур от 4-6 до 35°С; не гидролизует крахмал, не разжижает желатин, не образует ацетоин, не утилизирует глюкозу, галактозу, ксилозу, рамнозу, дульцит, маннит, мальтозу, арабинозу, сахарозу, сорбит, инозит, лактозу. Обладает цитратной, каталитической, фибринолитической активностью, не обладает липазной, плазмокоагулазной, оксидазной, лецитиназной, уреазной, казеинолитической активностью на молочном агаре, гемолитическими свойствами.

Штамм Pseudomonas species 989 на плотных питательных средах образует белесые, полупрозрачные, блестящие, гладкие колонии с ровным краем; клетки штамма представляют собою грамотрицательные укороченные палочки по 1-2 и в коротких цепочках, размером 0.9-1.0×1,5-1.8 мкм. Штамм Pseudomonas species 989является аэробом, растет в диапазоне температур от 4-6 до 35°С; не гидролизует крахмал, не разжижает желатин, не образует ацетоин, не утилизирует глюкозу, лактозу, галактозу, ксилозу, рамнозу, дульцит, маннит, мальтозу, арабинозу, сахарозу, сорбит, инозит. Обладает каталитической, оксидазной активностью, казеинолитической на молочном агаре, не обладает цитратной, лецитиназной, липазной, уреазной активностью, гемолитическими, фибринолитическими, плазмокоагулазными свойствами. Pseudomonas species устойчив к пенициллину, ампициллину, олеандомицину, оксациллину, ристомицину, карбенициллину, линкомицину, рифампицину, левомицетину; чувствителен к эритромицину, мономицину, тетрациклину, стрептомицину, канамицину, неомицину, гентамицину, полимиксину.

Характер взаимоотношений штаммов ассоциации с эндогенной микробиотой почв изучали в эксперименте. Отсутствие антагонизма иллюстрируется фотографиями, приведенными на Рис.1, где горизонтальные полосы - посев аборигенных микроорганизмов, выделенных из образцов нефтезагрязненной почвы ЯНАО, вертикальная полоса - посев ассоциации микроорганизмов Acinetobacter species 1037, Bacillus species 1040 и Pseudomonas species 989. Как видно, ассоциация микроорганизмов Acinetobacter species 1037, Bacillus species 1040 и Pseudomonas species 989 не угнетает рост аборигенных микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненной почвы ЯНАО, т.к. эндогенные бактерии растут одинаково интенсивно как в присутствии ассоциации (фото слева), так и в контроле (фото справа). Следовательно, при внесении больших количеств биомассы штаммов не будет наблюдаться угнетения местной микробиоты и вытеснения эндогенных видов микроорганизмов.

Пример 1. Получение ассоциации

Из бактерий Acinetobacter species 1037, Bacillus species 1040 и Pseudomonas species 989 была составлена ассоциация. Для этого бактерии, выращенные в мясо-пептонном бульоне до концентрации 1-3×10⁹ клеток/мл, смешивали таким образом, чтобы количество бактерий каждого штамма было в смеси не менее чем 30%. После этого бактериальную массу разливали в ампулы по 3 мл, замораживали при 70°С в течение суток, затем переносили в аппарат лиофильной сушки, включали вакуум и сушили в течение 2 суток. Запаянные ампулы хранили при 4°С.

После хранения в течение месяца определяли концентрацию бактерий каждого штамма в ампуле. Для этого ампулу вскрывали, вносили в нее 3 мл стерильного 0,9% раствора NaCl (физиологический раствор), переносили содержимое ампулы в мерную колбу, физиологическим раствором доводили содержимое до 100 мл. Суспензию выдерживали 12 часов при 18-20°С. Затем делали десятикратные разведения в физиологическом растворе и высевали на чашки Петри. После культивирования в течение 2 суток при комнатной температуре подсчитывали выросшие колонии и определяли концентрацию каждого штамма в ассоциации. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1
Концентрация бактерий Acinetobacter species 1037, Bacillus species 1040и Pseudomonas species 989 в ассоциации после лиофильной сушки и хранении в течение месяца при 4°С
Acinetobacter species 1037	Bacillus species 1040	Pseudomonas species 989
1,20×109	1,05×109	1,15×109
35,29 %	30,88 %	33,82 %

Ассоциация была испытана на способность к утилизации компонентов нефти и на способность к биоремедиации нефтезагрязненных объектов.

Пример 2. Скорость роста ассоциации при 10°С и 30°С

Скорость роста ассоциации бактерий исследовали в жидкой среде 8Е с добавлением 1% глюкозы при температуре 10 и 30°С. Количественный учет микроорганизмов проводили чашечным методом Коха путем подсчета выросших колоний (Методы общей бактериологии, 1983).

Численность и соотношение клеток штаммов определяли микроскопированием суспензий на разных этапах культивирования с использованием фазово-контрастного микроскопа, высевом на агаризованные среды для получения изолированных колоний с дальнейшим их подсчетом и идентификацией (Лабинская, 1978). При оценке активности штаммов в ассоциации учитывали изменение оптической плотности культуральной жидкости при инкубировании штаммов. Результаты представлены на Рис.2, где показана динамика роста ассоциации Acinetobacter species 1037, Bacillus species 1040 и Pseudomonas species 989 при t=30°C и 10°С (минеральная среда, без аэрации).

Как видно из Рис.2, ассоциация бактерий Acinetobacter species 1037, Bacillus species 1040 и Pseudomonas species 989 хорошо растет при 10°С, достигая к 12 дню концентрации 10^8,5 клеток/мл, в то время как при 30°С максимальная концентрация была только 10^7,5 клеток/мл.

После 12 дней культивирования суспензия была исследована на процентное соотношение в среде бактерий разных штаммов. Оно составило приблизительно Acinetobacter species 1037: Bacillus species 1040: Pseudomonas species 989 как 1,2:0,9:1. Таким образом, скорость роста бактерий ассоциации приблизительно одинаковая и при совместном культивировании штаммов Acinetobacter species 1037, Bacillus species 1040 и Pseudomonas species 989 не происходит вытеснения одних бактерий другими.

Пример 3. Окисление бактериями ассоциации компонентов нефти

Биодеградацию нефти штаммами микроорганизмов проводили в условиях периодического культивирования в жидкой минеральной среде 8Е без дополнительной аэрации и с аэрацией, используя термостатируемую качалку ("Sanyo", Япония; "Orbi-safe", Великобритания) со скоростью вращения 200 об/мин. Начальная концентрация клеток штаммов в колбах составляла в среднем 1×10⁷ кл./мл.

Нефтеутилизирующие свойства ассоциации бактерий тестированы методом газовой хроматографии. Определяли содержание н-алканов в среде после культивирования ассоциации в течение 21 дня в среде с нефтью при 10°С по сравнению с контролем (среда с нефтью без ассоциации микроорганизмов). На Рис.3. приведена газовая хроматограмма хлороформного экстракта нефти без добавления деструкторов (А) и после биодеструкции ассоциацией штаммов Acinetobacter sp.1037, Pseudomonas sp.989, Bacillus sp.1040 (Б) в течение 21 дня инкубирования при температуре 10°С и рН среды 7.0.

Исследованные штаммы имели степень деструкции нефти в интервале от 69 до 84% за 21 день культивирования в жидкой среде с нефтью при 10°С.

В разных условиях эксперимента (добавление в питательную среду NaCl, изменение рН, температуры, нефть из разных месторождений) утилизация н-алканов ассоциацией штаммов оставалась высокой.

Пример 4. Способ ремедиации нефтезагрязненных объектов

Способность ассоциации к утилизации нефтепродуктов в почве исследовали в модельном эксперименте. Для этого был заложен экспериментальный полигон, разделенный на участки. Каждый участок имел размеры 1,5 м×2 м, между участками была оставлена буферная зона 2 м×2 м. Перед экспериментом участки были вскопаны, чтобы трава не сорбировала на себя загрязнители. Кроме того, были подготовлены 2 участка положительного контроля, один из них вскопан: участки 2 м×2 м, расположенные на удалении от экспериментальных участков, чтобы исключить влияние загрязнителей.

Участки обработаны соляркой или отработанным автомобильным маслом до конечной концентрации в верхнем почвенном слое 10%. Для этого на опытный участок было вылито 40 л отработанного автомобильного масла или солярки.

Через 2 дня опытные участки были обработаны водной суспензией лиофильно высушенных микроорганизмов-нефтедеструкторов Acinetobacter sp.1037, Pseudomonas sp.989, Bacillus sp 1040, взятых в равных количествах. Бактерий внесено в количестве 10⁶ клеток/см². Контрольные участки были политы таким же количеством воды без микроорганизмов.

Обработку опытных участков ассоциацией микроорганизмов-нефтедеструкторов в количестве 10⁶ клеток/см² проводили трижды с интервалом 10 дней. Наблюдения вели в течение 70 дней. Результаты представлены на Рис.4, 5. Результаты высева бактерий из образцов почвы представлены в табл.2.

На Рис.4. - Восстановление почвенного покрова в течение после экспериментального 10% загрязнения отработанным автомобильным маслом (сверху вниз 2-й, 20-й 70-й день эксперимента).

На Рис.5. - Восстановление почвенного покрова в течение 70 дней после экспериментального 10% загрязнения соляркой (сверху вниз 2-й, 20-й 70-й день эксперимента).

Таблица 2
Результаты высева образцов почвы
Загрязнитель	Участок	КОЕ в 1 г почвы
2-й день эксперимента (перед внесением ассоциации)	10-й день эксперимента	20-й день эксперимента
Отработанное автомобильное масло	контроль	1,8×106	4,8×106	1,3×107
опыт	1,5×106	1,5×107	7,5×107
Солярка	контроль	6,6×105	8,5×105	3×106
опыт	6,8×105	8,4×106	1,9×107
	Контроль почвы	4,3×107		2,7×107

Как видно из рисунков 3 и 4 и таблицы 2, использование ассоциации штаммов Acinetobacter sp.1037, Pseudomonas sp.989, Bacillus sp.1040 ускоряло снижение токсичности почвы после загрязнения отработанным автомобильным маслом и соляркой и способствовало восстановлению микробиоценоза и травяного покрова.

Из изложенного выше видно, что ассоциация штаммов Acinetobacter sp.1037, Pseudomonas sp.989, Bacillus sp.1040 хорошо растет при пониженных температурах (10°С), способна утилизировать широкий спектр компонентов нефти, в модельном эксперименте внесение в почву ассоциации ускоряло снижение токсичности после загрязнения отработанным автомобильным маслом и соляркой и способствовало восстановлению микробиоценоза и травяного покрова, бактерии, входящие в ассоциацию, не проявляют антагонизма в отношении эндогенной микробиоты.

1. Ассоциация штаммов бактерий-нефтедеструкторов Acinetobacter species В-1037, Bacillus species В-1040, Pseudomonas species B-989, депонированных в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», для ремедиации нефтезагрязненных почв, причем бактерий каждого штамма в ассоциации содержится не менее 30%.

2. Способ ремедиации нефтезагрязненных почв путем внесения биопрепарата, отличающийся тем, что в качестве биопрепарата используют водную суспензию лиофильно высушенной биомассы ассоциации штаммов бактерий-нефтедеструкторов Acinetobacter species B-1037, Bacillus species B-1040, Pseudomonas species В-989, депонированных в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», из расчета 10⁹ клеток на м².