Способы лечения интерлейкин-6-зависимых заболеваний

Способы лечения интерлейкин-6-зависимых заболеваний

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение.

Настоящее изобретение имеет отношение к способам лечения интерлейкин-6(IL-6)-зависимых заболеваний с помощью комбинации антагониста интерлейкина-6 (антагонист IL-6), в особенности антитела к рецептору интерлейкина-6 (IL-6R) (антитело к IL-6R), и иммунодепрессантов, и с помощью введения антитела к IL-6R в высокой дозировке.

Уровень техники.

IL-6 представляет собой цитокин, который также называют фактором-2, стимулирующим В-клетки (BSF2, В cell stimulating factor-2), или интерфероном β2. IL-6 был открыт как фактор дифференцировки, вовлеченный в активацию клеток, происходящих из В-лимфоцитов (Hirano Т. et al., Nature, 324:73-76, 1986), и впоследствии было обнаружено, что IL-6 является полифункциональным цитокином, который влияет на функции различных клеток (Akira S. et al., Adv. in Immunology, 54:1-78, 1993). Было показано, что IL-6 индуцирует созревание клеток, происходящих из Т-лимфоцитов (Lotz М. et al., J. Exp. Med., 167:1253-1258, 1998).

IL-6 сообщает клеткам свою биологическую активность через два типа белков. Один из них - рецептор IL-6 (IL-6R), который является лиганд-связывающим белком с молекулярной массой около 80 кДа, к которому присоединяется IL-6 (Taga Т. et al., J. Exp. Med., 166:967-981, 1987; Yamasaki K. et al., Science, 241:825-828, 1987). Помимо мембрано-связанного типа, который проникает и экспрессируется в клеточной мембране, рецептор IL-6 также был обнаружен в виде растворимого рецептора IL-6, состоящего в основном из экстраклеточной части рецептора.

Международная публикация WO 92/19759 описывает различные типы антител к IL-6R, таких как гуманизированные антитела к IL-6R и химерные антитела к IL-6R. WO 96/11020 описывает терапевтическое средство при ревматоидном артрите и ингибитор роста синовиальных клеток (клетки внутренней оболочки суставов), первичным ингредиентом которого является антагонист IL-6, такой как антитело к IL-6R. WO 96/12503 описывает лечение заболеваний, для которых свойственно продуцирование IL-6, таких как плазмоцитоз, гипериммуноглобулинемия, анемия, нефрит, кахексия, ревматоидный артрит, болезнь Кастлемана (Castleman's disease) и мезангиальный пролиферативный нефрит. WO 98/42377 описывает защитные/терапевтические средства при заболеваниях, имеющих отношение к сенсибилизированным Т-клеткам, таким как множественный склероз, увеит, хронический тиреоидит, замедленная гиперчувствительность, контактный дерматит и атопический дерматит, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R.

WO 98/42377 описывает терапевтические средства при системном эритематозе, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R. WO 99/47170 описывает терапевтические средства при болезни Крона, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R. WO 00/10607 описывает терапевтические средства при панкреатите, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R. WO 02/3492 описывает терапевтические средства при псориазе, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R. Кроме того, WO 02/080969 описывает терапевтические средства при ювенильном идиопатическом артрите, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R.

Раскрытие изобретения.

Как было описано выше, были известны различные профилактические и терапевтические средства, активным ингредиентом которых является антитело к IL-6R. Однако не было известно, что при лечении IL-6-зависимых заболеваний комбинацией антитела к IL-6R и иммунодепрессантов, таких как метотрексат (МТХ), можно получить синергические эффекты, что иммунодепрессант, такой как метотрексат (МТХ) может ослабить или предупредить аллергические реакции при лечении ревматоидного артрита с помощью антитела к IL-6R, и что антитело к IL-6R в высокой дозировке может снизить или предупредить аллергические реакции при лечении ревматоидного артрита с помощью метотрексата.

Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для лечения IL-6-зависимых заболеваний, включающую антагонист интерлейкина-6 (антагонист IL-6) и иммунодепрессанты.

Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую иммунодепрессанты, для усиления эффекта при использовании антагониста IL-6R при лечении IL-6-зависимых заболеваний.

Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую иммунодепрессанты, для предупреждения или ослабления аллергических реакций при лечении IL-6-зависимых заболеваний с помощью антагониста IL-6.

Изобретение также обеспечивает терапевтическое средство, включающее антагонист IL-6, для лечения IL-6-зависимых заболеваний путем приема в высокой дозы препарата.

Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую антагонист IL-6 в высокой дозе, для предупреждения или ослабления аллергических реакций при лечении IL-6-зависимых заболеваний.

Антагонист IL-6 предпочтительно является антителом к IL-6R. Антитело к IL-6R предпочтительно является моноклональным антителом к IL-6R. Предпочтительно, чтобы антитело к IL-6R было моноклональным антителом к IL-6R человека. Или предпочтительно, чтобы антитело к IL-6R было моноклональным антителом к IL-6R мыши. Предпочтительно, чтобы антитело к IL-6R было антителом рекомбинантного типа. Предпочтительно, чтобы моноклональное антитело к IL-6R человека было, например, антителом РМ-1. Предпочтительно, чтобы моноклональное антитело к IL-6R мыши было, например, антителом MR16-1. Кроме того, антитело может быть химерным антителом, гуманизированным антителом или человеческим антителом к IL-6R. Особенно предпочтительным антителом к IL-6R является, например, гуманизированное антитело РМ-1.

При совместном использовании антагониста IL-6, в особенности антитела к IL-6R, и иммунодепрессанта, дозировка антагониста IL-6, в особенности антитела к IL-6R, составляет, например, при внутривенном введении от 0,02 до 150 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R, предпочтительно использование от 0,5 до 30 мг/кг/за 4 недели или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R, и наиболее предпочтительно использование от 2 до 8 мг/кг/за 4 недели или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.

При введении антагониста IL-6, в особенности антитела к IL-6R в высокой дозе, дозировка антагониста IL-6, в особенности антитела к IL-6R, составляет, например, при внутривенном введении не менее чем 4 мг/кг/за 4 недели или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R, предпочтительно использование от 6 до 16 мг/кг/за 4 недели или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R, или наиболее предпочтительно использование от 6 до 10 мг/кг/за 4 недели или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация антитела к IL-6R.

При использовании в качестве иммунодепрессанта МТХ дозировка МТХ составляет, например, от 1 до 100 мг/человек/неделя или дозировку, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация МТХ, предпочтительно использование от 4 до 50 мг/человек/неделя или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация МТХ, или особенно предпочтительно использование от 10 до 25 мг/человек/неделя или дозировки, при которой в крови достигается эквивалентная концентрация МТХ.

Дозировка, при которой в крови обнаруживают лекарственное средство (например, антитело к IL-6R или МТХ), означает дозировку, дающую эквивалентный терапевтический эффект, и даже в том случае, когда достижение определенной концентрации в крови различается из-за способа введения средства, например, при внутривенной инъекции или подкожной инъекции, ее расценивают как дозировку, при которой в крови обнаруживают такую концентрацию лекарственного средства (например, антитела к IL-6R или МТХ), при которой достигается эквивалентный терапевтический эффект.

Примеры IL-6-зависимых заболеваний включают

острые хронические воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания: нефрит, мезангиальный пролиферативный нефрит, болезнь Крона, язвенный колит, панкреатит, ювенильный идиопатический артрит или системный ювенильный идиопатический артрит, васкулит, болезнь Кавасаки, ревматоидный артрит, системный эритематоз, псориаз, синдром Шегрена, болезнь Стилла у взрослых;

опухолевые заболевания: множественная миелома, болезнь Кастлемана, злокачественная лимфома, рак почек;

инфекционные заболевания: инфекция ВИЧ, инфекция вирусом Эпштейна-Барр (EBV);

кахексию: кахексия;

другие заболевания: плазмоцитоз, гипериммуноглобулинемия, анемия и т.д., и предпочтительно это ревматоидный артрит, плазмоцитоз, гипериммуноглобулинемия, анемия, нефрит, кахексия, множественная миелома, болезнь Кастлемана, мезангиальный пролиферативный нефрит, системный эритематоз, болезнь Крона, панкреатит, псориаз, ювенильный идиопатический артрит или системный ювенильный идиопатический артрит.

Фармацевтическую композицию настоящего изобретения можно вводить перорально или парентерально и систематически или при необходимости. Например, можно выбрать внутривенную инъекцию, такую как введение с помощью капельницы, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, подкожную инъекцию, суппозиторий, инъекцию в прямую кишку, пероральные лекарственный средства, покрытые кишечно-растворимой оболочкой, и т.п., и подходящий способ введения лекарственных средств можно выбирать правильным образом в зависимости от возраста и состояния пациента. Верхний и нижний пределы эффективной дозировки зависят от частоты ввода средства, например, дозировку средства на один прием увеличивают при длительном интервале между приемами, тогда как дозировку средства снижают при коротком интервале между приемами.

Предпочтительной эффективной дозировкой и способом введения антитела к рецептору IL-6, например, является такое количество, при котором в крови обнаруживают свободное антитело. В качестве типичных примеров существуют способы введения лекарственного средства с разделением дозы на несколько приемов, например, с помощью внутривенной инъекции, такой как капельное введение, и подкожной инъекции, которые проводят в соответствии с расписанием приема дважды в неделю, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в 4 недели, один раз в 6 недель, один раз в 8 недель и т.п. Расписание приема можно регулировать путем увеличения интервала между приемами от двух раз в неделю или одного раза в неделю до одного раза в 2 недели, одного раза в 3 недели, одного раза в 4 недели, одного раза в 6 недель и одного раза в 8 недель при контроле за состоянием заболевания и изменениями результатов лабораторных исследований крови.

При совместном приеме с МТХ дозировка антитела к IL-6R является обычной, например, при лечении ревматоидного артрита это дозировка более чем 0,5 мг/кг в неделю или дозировка, при которой в крови достигается эквивалентный или более высокий антиревматический эффект. Например, при внутривенном введении, проводимом один раз в четыре недели, дозировка составляет от 0,02 до 150 мг/кг, предпочтительно от 0,5 до 30 мг/кг и более предпочтительно от 2 до 8 мг/кг.

Антитело к IL-6R и иммунодепрессант вводят одновременно или с временным интервалом.

Иммунодепрессанты также включают антиревматические средства, адренокортикоидные гормональные средства и т.п.и включают, например, следующие лекарственные средства.

Иммунодепрессанты, антиревматические средства, средства, включающие адренокортикоидные гормоны

Иммунодепрессанты

Алкилирующие средства

Циклофосфамид

Метаболические антагонисты

Азатиоприн, метотрексат, мизорибин

Ингибиторы активности Т-клеток

Циклоспорин, такролимус

Антиревматические средства:

Гидроксихлороквин, сульфасалазин, лефлуномид, этанерсепт, инфликсимаб, адалимумаб, D-пеницилламин, пероральные препараты золота, инъецируемые препараты золота (для внутримышечной инъекции), миноциклин, золота натрия тиомалат, ауранофин, лобензарит, буцилламин, актарит;

Средства, включающие адренокортикоидные гормоны:

Кортизон, гидрокортизоны

Кортизона ацетат, гидрокортизон, гидрокортизона натрия фосфат, гидрокортизона натрия сукцинат, фторкортизона ацетат,

Преднизолон, преднизолоны

Преднизолон, преднизолона натрия сукцинат, преднизолона натрия фосфат, галопредона ацетат

Метилпреднизолон

Метилпреднизолон, метилпреднизолона ацетат, метилпреднизолона натрия сукцинат

Триамцинолоны

Триамцинолон, триамцинолона ацетат, триамцинолона актинид

Дексаметазоны

Дексаметазон, дексаметазона ацетат, дексаметазона натрия фосфат, дексаметазона пальмитат

Бетаметазоны

Бетаметазон, бетаметазона натрия фосфат

Параметазоны

Параметазона ацетат

Дозировка иммунодепрессанта, например, при совместном приеме МТХ для лечения ревматоидного артрита, например, при пероральном приеме, составляет от 1 до 100 мг/человек в неделю, предпочтительно от 4 до 50 мг, и наиболее предпочтительно от 7,5 до 25 мг/человек.

Также высокая дозировка антитела к IL-6R подразумевает дозировку, способную предупредить или ослабить аллергическую реакцию, эта дозировка эквивалентна или превышает минимальную дозировку, эффективную для лечения IL-6-зависимых заболеваний. Например, при лечении ревматоидного артрита при внутривенном капельном вливании, производимом каждые четыре недели, дозировка включает 4 мг/кг или более, предпочтительно от 6 до 16 мг/кг и наиболее предпочтительно от 6 до 10 мг/кг.

Описанные выше способы приема, интервал между приемами и дозировка представляют собой иллюстрацию предпочтительных примеров, и подходящим образом можно выбрать способ приема, интервал и дозировку, при которой достигается сходный терапевтический эффект. Например, измеряя концентрации различных лекарственных средств в крови, можно выбрать способ приема, интервал и дозировку, при которых достигаются эффекты, сходные с теми, которые приведены выше в качестве примеров. Изобретение включает в себя способ приема, интервал и дозировку, при которых в крови достигаются концентрации, эквивалентные тем, которые описаны в приведенных выше примерах.

Осуществление изобретения.

Антагонисты IL-6, применяемые в настоящем изобретении, могут быть использованы независимо от их происхождения, типа и формы до тех пор, пока они демонстрируют профилактический или терапевтический эффект при IL-6-зависимых заболеваниях.

Антагонисты IL-6 представляют собой вещества, которые ингибируют биологическую активность IL-6. Антагонисты IL-6 предпочтительно являются веществами, обладающими ингибирующей активностью связывания любых белков из IL-6, IL-6R или gp130. Антагонисты IL-6 включают антитело к IL-6, антитело к IL-6R, антитело к gp130, модифицированный IL-6, модифицированный растворимый IL-6R или неполные пептиды IL-6 или IL-6R, а также вещества с низкой молекулярной массой, обладающие подобной активностью.

Антитело к IL-6, применяемое в настоящем изобретении, можно получить в виде поликлональных или моноклональных антител, используя средства, известные в этой области техники. В качестве антитела к IL-6, применяемого в настоящем изобретении, предпочтительными являются моноклональные антитела, происходящие от млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомами, и антитела, продуцируемые клетками-хозяевами, которые были трансформированы с помощью экспрессионного вектора, включающего генетически сконструированный ген антитела. Это антитело, связываясь с IL-6, блокирует связывание IL-6 с рецептором IL-6 и, таким образом, блокирует передачу биологически активного сигнала IL-6 в клетки.

Примеры таких антител включают антитело МН166 (Matsuda Т. et al., Eur. J. Immunol., 18:951-956, 1988) и антитело SK2 (Sato K. et al., The 21 st Proceedings of the Japanese Society for Immunology, 21:166, 1991).

Гибридомы, продуцирующие антитела к IL-6, можно в основном сконструировать, используя известную процедуру, описанную ниже. То есть, гибридомы можно получить, проводя иммунизацию, используя в качестве сенсибилизирующего антигена IL-6, в соответствии с традиционным методом иммунизации; сливая полученные иммунные клетки с известными в технологии родительскими клетками в обычном методе слияния клеток; и отбирая клетки, продуцирующие моноклональное антитело, с помощью традиционного метода скрининга.

В частности, антитело к IL-6 можно получить следующим способом. Например, человеческий IL-6, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя ген/аминокислотную последовательность IL-6, подробно описанную в Eur. J. Biochem., 168:543-550, 1987; J. Immunol., 140:1534-1541, 1987; или в Agr. Biol. Chem., 54:2685-2688, 1990.

Последовательность гена IL-6 вставляют в известный экспрессионный вектор, которым трансформируют подходящие для этого клетки-хозяева, затем с помощью известного метода интересующий белок IL-6 очищают из клеток или супернатанта культуры клеток, и очищенный белок IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Также, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать слитый белок, образованный комбинацией белка IL-6 и другого белка.

Антитело к рецептору IL-6, применяемое в настоящем изобретении, может быть получено в виде поликлонального или моноклонального антитела с использованием метода, известного в этой области техники. В качестве антитела к рецептору IL-6, применяемого в настоящем изобретении, предпочтение имеет моноклональное антитело, в особенности, антитело, происходящее от млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомами, и антитела, продуцируемые в клетках-хозяевах, которые были трансформированы с помощью экспрессионного вектора, включающего генетически сконструированный ген антитела. Это антитело, связываясь с рецептором IL-6, блокирует связывание IL-6 с рецептором IL-6 и, таким образом, блокирует передачу биологически активного сигнала IL-6 в клетки.

Примеры таких антител включают антитело MR16-1 (Tamura Т. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:11924-11928, 1993), антитело PM-1 (Hirata Y. et al., J. Immunol., 143:2900-2906, 1989), антитело AUK12-20, антитело AUK64-7 или антитело AUK146-15 (International Patent Application Publication No. WO 92-19759). Среди них наиболее предпочтительным является антитело РМ-1.

Клеточная линия гибридомы РМ-1, которая продуцирует антитело РМ-1, была депонирована для международного признания 12 июля 1989 года по условиям Будапештского договора как FERM ВР-2998 Международным депозитарием для патентуемых микроорганизмов (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.). Клеточная линия крысино-мышиной гибридомы MR16-1, которая продуцирует антитело MR16-1, была депонирована для международного признания 13 марта 1997 года по условиям Будапештского договора как FERM ВР-5875 Международным депозитарием для патентуемых микроорганизмов (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.).

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело к рецептору IL-6, могут быть получены с помощью известной процедуры, описанной ниже. То есть, гибридомы можно получить, проводя иммунизацию, используя в качестве сенсибилизирующего антигена рецептор IL-6, в соответствии с традиционным методом иммунизации; сливая полученные иммунные клетки с известными в технологии родительскими клетками в обычном методе слияния клеток; и отбирая клетки, продуцирующие моноклональное антитело, с помощью традиционного метода скрининга.

В частности, антитело к рецептору IL-6 можно получить следующим способом. Например, человеческие рецепторы IL-6, применяемые в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя генную или аминокислотную последовательности рецептора IL-6, подробно описанные в European Patent Application Publication No. EP 325474 и JP-A-3-155795, соответственно.

Существуют два типа белков рецептора IL-6: один из них экспрессирован на клетках, а другой - отделен от клеточной мембраны (растворимый рецептор IL-6) (Yasukawa K. et al., J. Biochem., 108:673-676, 1990). Растворимый рецептор IL-6 формируется в значительной степени из экстраклеточного участка рецептора IL-6 и отличается от мембрано-связанного рецептора IL-6 тем, что не содержит трансмембранный участок или трансмембранный участок вместе с внутриклеточным участком. Оба белка рецептора IL-6 можно использовать в качестве сенсибилизирующего антигена для продукции антитела к рецептору IL-6, применяемого в настоящем изобретении.

Последовательность гена рецептора IL-6 включают в известный экспрессионный вектор, которым трансформируют подходящие клетки-хозяева, затем интересующий белок рецептора IL-6 очищают из клеток или супернатанта культуры с помощью известного метода, и очищенный белок рецептора IL-6 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Также, в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать клетки, экспрессирующие рецептор IL-6, или слитый белок, образованный комбинацией белка рецептора IL-6 и другого белка.

Штамм E.coli HB101-pIBIBSF2R, клетки которого содержат плазмиду pIBIBSF2R, включающую кДНК, которая кодирует рецептор IL-6 человека, был депонирован для международного признания 9 января 1989 года по условиям Будапештского договора как FERM ВР-2232 Международным депозитарием для патентуемых микроорганизмов (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.).

Антитело к gp130, применяемое в настоящем изобретении, может быть получено в виде поликлонального или моноклонального антитела с использованием известного метода. В качестве антитела к gp130, применяемого в настоящем изобретении, предпочтительно используется моноклональное антитело, происходящее от млекопитающих. Моноклональные антитела млекопитающих включают антитела, продуцируемые гибридомами, и антитела, продуцируемые в клетках-хозяевах, которые были трансформированы с помощью экспрессионного вектора, включающего генетически сконструированный ген антитела. Это антитело, связываясь с gp130, ингибирует связывание комплекса IL-6/рецептор IL-6 с gp130, блокирует передачу биологически активного сигнала IL-6 в клетки.

Примеры таких антител включают антитело АМ64 (JP-A-3-219894), антитело 4В11 и антитело 2Н4 (US 5571513), антитело B-S12 и антитело В-Р8 (JP-A-8-291199).

Гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело к gp130, могут быть получены с помощью известной процедуры, описанной ниже. То есть, гибридомы можно получить, проводя иммунизацию, используя в качестве сенсибилизирующего антигена gp130, в соответствии с традиционным методом иммунизации; сливая полученные иммунные клетки с известными в технологии родительскими клетками в обычном методе слияния клеток; и отбирая клетки, продуцирующие моноклональное антитело, с помощью традиционного метода скрининга.

В частности, моноклональное антитело можно получить следующим способом. Например, gp130, применяемый в качестве сенсибилизирующего антигена для получения антитела, можно получить, используя ген/аминокислотную последовательность gp130, подробно описанную в European Patent Application Publication No. ЕР 411946.

Последовательность гена gp130 включают в известную систему экспрессионного вектора, которым трансформируют подходящие клетки-хозяева, затем интересующий белок gp130 очищают из клеток или супернатанта клеточной культуры с помощью известного метода, и очищенный белок gp130 может быть использован в качестве сенсибилизирующего антигена. Также в качестве сенсибилизирующего антигена можно использовать клетки, экспрессирующие gp130, или слитый белок, образованный комбинацией gp130 и другого белка.

Млекопитающие животные, иммунизированные с помощью сенсибилизирующего антигена, никак не ограничены, но они предпочтительно отбираются из соображений их совместимости с родительскими клетками, используемыми для слияния клеток. Обычно они включают грызунов, таких как мышь, крыса и хомяк.

Иммунизацию животного сенсибилизирующим антигеном проводят, используя известный способ. В качестве основных способов, например, применяют внутрибрюшинную или подкожную инъекцию животного сенсибилизирующим антигеном. В частности, в предпочтительном варианте сенсибилизирующий антиген, который подходящим образом разводят и суспендируют в PBS (фосфатно-солевой буфер) или физиологическом растворе, смешивают для эмульгирования с подходящим количеством обычного адъюванта, например, полного адъюванта Фрейнда, и затем вводят его млекопитающему в течение нескольких приемов с интервалом от 4 до 21 дня. Также во время иммунизации сенсибилизирующим антигеном может быть использован подходящий носитель.

Животное иммунизируют таким способом, и иммунизацию подтверждают тем, что в сыворотке крови повышается уровень интересующего антитела. Затем иммунизированные клетки извлекают из млекопитающего и используют для слияния клеток. Предпочтительными клетками для слияния клеток, в частности, являются клетки селезенки.

В качестве клеток миеломы млекопитающих, применяемых в виде родительских клеток-партнеров для слияния с описанными выше иммунизированными клетками, предпочтительно используют уже известны клеточные линии, такие как P3X63Ag8.653 (Kearney J.F. et al., J. Immunol., 123:1548-1550, 1979), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology, 81:1-7, 1978), NS-1 (Kohler G. and Milstein C., Eur. J. Immunol., 6:511-519, 1976), MOC-11 (Margulies D.H. et al., Cell, 8:405-415, 1976), SP2/0 (Shulman M. et al., Nature, 276:269-270, 1978), FO (de St. Groth S.F. et al., J. Immunol. Methods, 35:1-21, 1980), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med., 148:313-323, 1978) и R210 (Galfre G. et al., Nature, 277:131-133, 1979).

Слияние указанных выше иммунных клеток с клетками миеломы по существу может быть проведено в соответствии с известным способом, таким как способ, описанный в работе Milstein et al. (Kohler G. and Milstein C., Methods Enzymol., 73:3-46, 1981).

Более конкретно, указанное слияние клеток проводят, например, в обычной питательной культуральной среде в присутствии катализатора слияния клеток. В качестве катализатора слияния клеток, например, можно использовать полиэтиленгликоль (PEG), вирус Сендай (HVJ) и нечто подобное, и, кроме того, чтобы усилить эффективность слияния, затем по желанию можно добавить/использовать вспомогательное средство, такое как диметилсульфоксид.

Предпочтительное соотношение иммунных клеток и клеток миеломы составляет, например, от 1- до 10-кратного избытка иммунных клеток по отношению к клеткам миеломы. В качестве среды, применяемой для слияния клеток, возможно использование среды RPMI 1640, среды MEM, подходящей для роста клеточной линии миеломы, и другой стандартной среды, применяемой для такого типа клеточной культуры, и, помимо этого, можно вводить сывороточные добавки, такие как фетальная сыворотка теленка (FCS).

Для слияния клеток целевые слитые клетки (гибридомы) получают путем тщательного смешивания определенного количества описанных выше иммунизированных клеток с клетками миеломы в указанной выше среде, добавляя раствор PEG, например, раствор PEG с молекулярной массой от 1000 до 6000, предварительно прогретый до 37°C, в стандартной концентрации от 30 до 60% (вес/объем), с последующим перемешиванием. Затем, с помощью процедуры повторного, последовательного добавления подходящей культуральной среды и центрифугирования можно удалить супернатант, агенты слияния клеток и т.д., присутствие которых нежелательно для роста гибридомы.

Гибридомы могут быть отобраны с помощью культивирования в обычной селекционной среде, например, в культуральной среде HAT (среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Культивирование в среде HAT продолжают обычно от нескольких дней до нескольких недель, в течение времени, достаточного для гибели клеток (не слившихся клеток), отличающихся от желаемых гибридом. Затем применяют обычный метод предельного разведения и проводят скрининг и клонирование гибридом, продуцирующих желаемое антитело.

Кроме получения указанной выше гибридомы, иммунизируя антигеном животное (но не человека) с помощью сенсибилизирования лимфоцитов человека белком-антигеном или клетками, экспрессирующими антиген in vitro, и слияния сенсибилизированных В-лимфоцитов с клетками миеломы человека, например, с клетками U266 (см. JP-B-1-59878), можно получить желаемое человеческое антитело, обладающее активностью связывания с желаемым антигеном или клетками, экспрессирующими антиген. Кроме этого, антиген или клетки, экспрессирующие антиген, можно ввести трансгенным животным, имеющим набор генов антител человека, чтобы получить желаемое человеческое антитело в соответствии со способом, описанным выше (см. International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).

Сконструированную таким образом гибридому, продуцирующую моноклональное антитело, можно культивировать в стандартной культуральной среде или можно хранить длительное время в замороженном состоянии при температуре жидкого азота.

Чтобы получить моноклональное антитело из гибридом, можно использовать способ, в котором гибридомы культивируют обычным образом и получают моноклональное антитело в виде супернатанта клеточной культуры, или с помощью способа, в котором гибридому вводят и выращивают в животных, совместимых с указанной гибридомой, а антитела получают в виде асцитов. Первый способ подходит для получения высокоочищенных антител, тогда как последний способ подходит для производства больших количеств антител.

Например, получение гибридомы, продуцирующей антитело к рецептору IL-6, можно проводить, используя способ, раскрытый в JP-A-3-139293. Можно применить способ, в котором гибридомы, продуцирующие антитело РМ-1, депонированные для международного признания 12 июля 1989 года по условиям Будапештского договора как FERM ВР-2998 Международным депозитарием для патентуемых микроорганизмов (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki Pref.), вводят внутрибрюшинно мышам BALB/c для получения асцитов, и антитела РМ-1 очищают из этих асцитов. Также, можно применить способ, в котором указанные гибридомы культивируют в подходящей культуральной среде, например, в среде RPMI 1640, в гибридомной среде SFM (производство фирмы GIBCO-BRL), в среде PFHM-II (производство фирмы GIBCO-BRL), содержащих 10%-ную фетальную сыворотку теленка и 5%-ный MB-Condimed H1 (производство фирмы Boehringer Mannheim), и антитело РМ-1 очищают из супернатанта клеточной культуры.

В настоящем изобретении в качестве моноклонального антитела можно использовать антитело рекомбинантного типа, продуцированное с помощью клонирования гена антитела из гибридомы, включения этого гена в подходящий вектор, введения его в клетки-хозяева, и использования генно-инженерных технологий (см., например, Borrebaeck C.A.K., and Larrick J.W. Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United Kingdom by Macmillan Publishers Ltd. 1990).

В частности, мРНК, кодирующую вариабельную (V) область желаемого антитела, выделяют из клеток, продуцирующих интересующее антитело, таких как гибридомы. Для выделения мРНК получают суммарный препарат РНК с использованием известного способа, например, такого как метод ультрацентрифугирования в присутствии гуанидина (Chirgwin J.M. et al., Biochemistry, 18:5294-5299, 1979), метод AGPC (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 162:156-159, 1987), и мРНК получают, используя набор фирмы Pharmacia «mRNA Purification Kit». Также мРНК можно выделить непосредственно, используя набор фирмы Pharmacia «QuickPrep mRNA Purification Kit».

кДНК V-области антитела синтезируют из полученной мРНК, используя обратную транскриптазу. Синтез кДНК проводят, используя набор «AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit» и сходные наборы. Также, для синтеза и амплификации кДНК можно использовать набор «5'-Ampli FINDER RACE kit» (производство фирмы Clontech), и метод 5'-RACE, в котором используется полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Frohman М.А. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:8998-9002, 1988; Belyavsky A. et al., Nucleic Acids Res., 17:2919-2932, 1989). Желаемый фрагмент ДНК очищают из продукта ПЦР и лигируют в ДНК вектора. Затем полученный рекомбинантный вектор вводят в Е.coli, и отбирают колонии для выделения желаемого рекомбинантного вектора. Последовательность оснований желаемой ДНК подтверждают с помощью известного способа, такого как дидезокси-метод секвенирования.

Если получают ДНК, кодирующую V-область желаемого антитела, ее лигируют в молекулу ДНК, кодирующую константную область (С-область) желаемого антитела, и затем ее включают в экспрессионный вектор. Или ДНК, кодирующую V-область антитела, можно включить в экспрессионный вектор, содержащий С-область антитела.

Чтобы продуцировать антитело, применяемое в настоящем изобретении, ген антитела включают в экспрессионный вектор для того, чтобы его экспрессия шла под контролем экспрессионных регуляторных участков, например, энхансера и промотора, как описано ниже. Затем, с помощью этого экспрессионного вектора можно трансформировать клетки-хозяева.

В настоящем изобретении в целях снижения аллогенной антигенности для человека можно применять рекомбинантное антитело с искусственно модифицированным геном, например, химерное антитело, гуманизированное антитело и человеческое антитело. Эти модифицированные антитела можно получить с помощью известных методов.

Химерное антитело можно получить с помощью лигирования полученной, как описано выше, ДНК, кодирующей V-область антитела, в ДНК, кодирующую С-область человеческого антитела, с последующим ее включением в экспрессионный вектор, который вводят в клетки-хозяева для продуцирования (см. European Patent Application Publication No. ЕР 125023, International Patent Application Publication No. WO 92/19759). С помощью этих известных методов можно получить химерное антитело, полезное в настоящем изобретении.

Например, плазмиды, которые содержат ДНК, кодирующую V-области L- и Н-цепи химерного антитела РМ-1, были названы рРМ-k3 и рРМ-h1, соответственно, и штаммы Е. coli, обладающие этими плазмидами, были депонированы для международного признания 12 февраля 19991 года по условиям Будапештского договора как NCIMB 40366 и NCIMB 40362, соответственно, Компанией Национальной коллекции промышленных, пищевых и морских бактерий (23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, United Kingdom).

Гуманизированные антитела, которые относятся к человеческим антителам с измененной формой, представляют собой антитела, в которых гипервариабельный участок (CDR, complementarity determining region) млекопитающего, но не человека, например, мышиного антитела, трансплантируют в CDR участок антитела человека с помощью известеного, общепринятого метода рекомбинантных ДНК (см. European Patent Application Publication No. ЕР 125023, International Patent Application Publication No. WO 92/19759).

В частности, последовательность ДНК, которая была сконструирована для лигирования CDR мышиного антитела в каракасный участок (FR, framework region) антитела человека, синтезируется с помощью метода ПЦР с использованием олигонуклеотидов, имеющих на концах перекрывающиеся области. Полученную ДНК лигируют в ДНК, кодирующую С-область человеческого антитела, и затем включают в экспрессионный вектор, который вводят в клетки-хозяева для продукции гуманизированного антитела (см. European Patent Application Publication No. ЕР 239400, International Patent Application Publication No. WO 92/19759).

В качестве FR антитела человека, лигированного через CDR, выбирают те, в которых гипервариабельный участок образует хорошую область связывания антигена. При желании можно заменить аминокислоты в каркасном участке вариабельного участка антитела, так чтобы гипервариабельный участок человеческого антитела с измененной формой мог образовывать соответствующую область связывания антигена (Sato K. et al., Cancer Res., 53:851-856, 1993).

Для химерного антитела и гуманизированного антитела используют С-область человеческого антитела. С-область человеческого антитела включает Сγ, и, например, можно использовать Cγ1, Сγ2, Сγ3 и Сγ4. С-область человеческого антитела можно модифицировать для улучшения стабильности антитела или его продукции.

Химерное антитело включает вариабельную область антитела, происходящего из млекопитающего, отличного от человека, и С-область, происходящую из человеческого антитела. Гуманизированное антитело включает CDR участок антитела, происходящий из млекопитающего, отличного от человека, а также каркасный участок и С-область, происходящие из человеческого антитела. В соответствии с этим, они обладают низкой антигенностью в организме человека и, таким образом, полезны в качестве антител, применяемых в настоящем изобретении.

Предпочтительные характерные примеры гуманизированного антитела, применяемого в настоящем изобретении, включают гуманизированное антитело РМ-1 (см. International Patent Application Publication No. WO 92/19759).

Также, в дополнении к способам, описанным выше, для получения человеческого антитела известна технология получения человеческого антитела путем пэннинга с использованием библиотеки человеческих антител. Например, вариабельную область человеческого антитела можно экспрессировать на поверхности фага в виде одноцепочечного антитела (scFv) с помощью метода фагового дисплея (phage display), и из библиотеки можно отобрать