Способы лечения и диагностики рака

Способы лечения и диагностики рака

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к лечению рака и, в частности, лечению рака, основанного на введении активности холинкиназы-бета (здесь далее ChoKβ), а также способам разработки персонализированных методов лечения и определения реакции на агент, способный индуцировать холинкиназу-бета (здесь далее ChoKβ), с целью лечения рака, а также способам определения прогноза для пациента на основании определения уровней экспрессии ChoKβ, а также на основании определения соотношения уровней экспрессии ChoKβ и ChoKα. Наконец, изобретение относится к способам определения реакции пациента, который страдает раком, на ингибирующие ChoKα агенты на основании определения уровней экспрессии PEMT и/или ChoKβ.

Предпосылки создания изобретения

Холинкиназа (ChoK) является первым ферментом на так называемом пути Кеннеди биосинтеза фосфатидилхолина (PC), который представляет собой главный липид мембран эукариотических клеток. В частности, ChoK катализирует реакцию трансформации холина (Cho) в фосфохолин (PCho) с использованием молекулы АТФ и Mg²⁺ в качестве кофактора. Путь Кеннеди продолжается при действии фермента на PCho CDP-фосфохолинцитидилтрансферазы (CT), давая CDP-холин, и затем DAG-холинфосфотрансферазы (CPT), давая в результате PC (фиг.3). Хотя активность ChoK формирует первую стадию в синтезе PC, считается, что лимитирующей или регулирующей стадией биосинтеза PC является стадия, катализируемая посредством CT.

Аминокислотная последовательность, образующая домены холинкиназы, хорошо сохраняется во всех эукариотических организмах, например гомология между мышиными и человеческими генами составляет 85-88%. У млекопитающих семейство холинкиназы кодировано в двух разных генах: CHKA и CHKB, расположенных у людей в хромосомах 11q13.2 и 23q13.33 соответственно (Ensembl Genome Browser v48, gene view: http://www.ensembl.org/). Вследствие их высокой гомологии предполагают их появление в результате процесса дупликации генов и последующей дивергенции от общего прототипа. Экспрессия этих генов дает трансляцию трех белков доменом холин/этаноламинкиназа: ChoKα1, ChoKα2 и ChoKβ1 (обозначенных как ChoK-подобные). Альфа-изоформа имеет два варианта, генерируемые посредством альтернативного сплайсинга первичной мРНК: ChoKα1 из 457 аминокислот (ак) и ChoKα2 (439 ак), от которой она отличается только 18 ак в N-концевой области. Бета-изоформа также имеет два различных варианта с альтернативным сплайсингом, только один из которых, ChoKβ1, обладает киназной активностью. ChoKβ1 имеет 395 ак и отличается от альфа-изоформы примерно 40% своей последовательности (Aoyama at al., 2004) (фиг.4). Наконец, сдвиг рамки считывания в транскрипте ChoKβ дает появление ChoKβ2, более короткого белка (127 ак), у которого отсутствует домен холин/этаноламинкиназа и который отличается от варианта 1 по его C-концу. Неизвестно, какую роль может играть этот вариант, однако идентифицирован мышиный вариант из 164 ак с аналогичными характеристиками, обозначенный как ChoKα3.

Кроме своей роли в липидном метаболизме, имеется важный признак, который указывает, что ChoK вовлечена в канцерогенез. Первый признак того, что ChoK может играть важную роль в канцерогенезе, возникает из наблюдения, что во время трансформации клеток, опосредованной онкогеном RAS, происходит повышение PCho. Позже было продемонстрировано, что причиной повышения PCho является повышение активности ChoK (Ramirez de Molina at al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun. 285: 873-879), опосредованной двумя из наиболее известных эффекторов онкогена RAS, PI3K и Ral-GDS (Ramirez de Molina at al., 2002, Oncogene 21: 937-946). Описано также продуцирование PCho как существенный процесс при росте клеток, индуцированный ростом факторов в мышиных фибробластах и в различных системах человеческих клеток, в которых в результате обработки ChoK-специфическими лекарственными средствами происходит блокирование синтеза ДНК, индуцированного различными факторами, такими как EGF, PDGF или HRG.

ChoK чрезмерно экспрессируется в большом количестве клеточных линий, выделяемых из опухолей человека, а также в различных тканях опухолей молочной железы, легкого, толстой кишки, мочевого пузыря и предстательной железы человека (Nakagami at al., 1999, Jpn. J. Cancer Res 90: 419-424; Ramirez de Molina at al., 2002, Oncogene 21: 4317-4322; Ramirez de Molina at al., 2002, Biochem Biophys. Res. Commun. 296: 580-583). Такие типы опухолей представляют более 70% от общего числа случаев рака в развитых странах. Биохимические данные показывают активацию фермента в большом количестве случаев с ускорением повышения уровня ChoK при опухолевых состояниях на транскрипционном и посттрансляционном уровнях (Ramirez de Molina at al., 2002). Степень чрезмерной экспрессии или чрезмерной активности ChoK в опухолях таких типов обычно очень высока, составляя от 40 до 60% (Ramirez de Molina at al., 2004, Cancer Res 64: 6732-6739; Ramirez de Molina at al., 2002, Biochem Biophys Res Commun 296: 580-583). В случаях, которые анализировались, выделяется связь между активацией ChoKα и степенью злокачественности (Ramirez de Molina at al., 2002, Онкоген 21: 4317-4322). В заключение, недавно было проведено исследование на 167 образцах от пациентов с немелкоклеточным раком легкого (NSCLC), которое показало, что пациенты, опухоли которых демонстрируют высокую экспрессию ChoKα, имеют значительно худший прогноз развития заболевания, что может иметь важные клинические последствия (Ramirez de Molina at al., 2007, Lancet Oncol 8: 889-897). Все эти исследования были проведены для α-изоформы.

Существенный признак демонстрирует изменение ChoK в канцерогенном процессе, указывая этот фермент в качестве мишени для разработки противоопухолевой стратегии, основанной на специфическом ингибировании его активности. Прежде всего, различные in vitro исследования в клетках, трансформированных онкогенами, демонстрируют существование высокой корреляции между ингибированием фермента и ингибированием клеточной пролиферации, при этом без летальности, связанной с приемом хемихолиния-3 (Campos at al., 2000, Bioorg Med Chem Lett 10: 767-770; Cuadrado at al., 1993, Oncogene 8: 2959-2968; HeRNAndez-Alcoceba at al., 1997, Cancer Res 59: 3112-3118; Jimenez at al., 1995, J Cell Biochem 57: 141-149). Также успешно проведены in vivo исследования ингибирования клеточного роста в ксенотрансплантатах опухолевых клеток эпидермоидной карциномы, аденокарциномы толстой кишки и аденокарциномы молочной железы человека, генерированных у безтимусных мышей (HeRNAndez-Alcoceba at al., 1999, Cancer Res 59: 3112-3118; Lacal, 2001, IDrugs 4: 419-426; Ramirez de Molina at al., 2004, Cancer Res 64: 6732-6739). В заключение, продемонстрирована in vivo специфичность MN58b относительно ChoK-мишени в ксенотрансплантатах раковых клеток молочной железы и толстой кишки посредством ЯМР, причем определено, что после противоопухолевой обработки посредством MN58b затрагиваются только уровни PCho, но не других фосфомоноэфиров (Al-Saffar at al., 2006, Cancer Res 66: 427-434).

Тем не менее, несмотря на глубокие знания механизмов действия ингибиторов ChoKα все еще неизвестно, можно ли применять ChoKβ в качестве мишени для разработки противоопухолевых лекарственных средств или можно ли применять указанный фермент в качестве биомаркера для реакции на противоопухолевые лекарственных средства или для прогнозирования в случае пациентов, страдающих раком.

Краткое описание изобретения

В первом аспекте изобретение относится к способу определения прогноза для пациента, страдающего раком, включающего определение уровней экспрессии ChoKβ в образце от указанного пациента, в котором пониженные уровни ChoKβ относительно уровней в эталонном образце указывают, что пациент демонстрирует плохой прогноз.

Во втором аспекте изобретение относится к способу определения прогноза для пациента, страдающего раком, включающего определение уровней экспрессии ChoKα и ChoKβ в образце от указанного пациента, в котором пониженные уровни ChoKα и высокие уровни ChoKβ относительно уровней экспрессии указанных белков в эталонном образце свидетельствуют, что пациент демонстрирует хороший прогноз.

В третьем аспекте изобретение относится к способу определения реакции пациента с раковым заболеванием на лечение ингибитором ChoKα, включающего определение в образце от указанного пациента уровней экспрессии белка, выбранного из группы: PEMT и ChoKβ, в котором повышение уровней экспрессии PEMT или повышение уровней экспрессии ChoKβ относительно уровней в эталонном образце указывают на хорошую реакцию на ингибитор ChoKα.

В конечном аспекте изобретение относится к агенту, индуцирующему активность ChoKβ, с целью его применения при лечении рака.

Описание фигур

Фиг.1. мРНК-уровни ChoKα повышены в опухолевых линиях, тогда как для ChoKβ они неизменны или понижены. Результаты количественной PCR для ChoKα (серый) и ChoKβ (белый) в опухолевых линиях человека: A) легкого, B) мочевого пузыря и C) молочной железы. мРНК-уровни опухолевых линий сравнивают с нормальной эпителиальной линией того же происхождения способом 2^-ΔCt. Используемый для нормировки эндогенный ген представляет собой 18S.

Фиг.2. Пример экспрессии генов изоформ ChoKα и ChoKβ в образцах от пациентов с диагнозом немелкоклеточный рак легкого. Уровни экспрессии мРНК для ChoKα (A) или ChoKβ (B) в образцах опухоли легкого по сравнению с коммерческой нормальной тканью легкого, полученные с применением способа 2^-ΔCt. Результаты соответствуют Log10RQ (относительное количество) α или β изоформ относительно экспрессии эндогенного гена (18S). В каждом случае в первой колонке показана экспрессия для нормальной ткани.

Фиг.3. Индуцирование апоптоза в ответ на MN58b. Клетки Hek293T, Jurkat, SW70 и H1299 обрабатывают 20 мкМ MN58b в течение 0 час, 24 час и 48 час и для контроля такие же клетки оставляют необработанными в течение таких же периодов времени. Клеточные экстракты этих линий разделяют посредством PAGE-SDS и переносят на нитроцеллюлозную мембрану для их иммунодетектирования антителами. Показаны примеры фотографий как результат иммунодетектирования на различных клеточных линиях: A) PARP и B) Caspase 3, деградация которых является показателем апоптоза. GAPDH используют в качестве контроля нагрузки.

Фиг.4. Повышение транскрипции ChoKβ в ответ на MN58b. Клетки Hek293T, Jurkat, SW70 и H1299 обрабатывают 20 мкМ MN58b в течение 24 час и 48 час и для контроля такие же клетки оставляют необработанными в течение таких же периодов времени. Затем экстрагируют всю РНК из указанных клеток и проводят количественную PCR. В ответ на лекарственное средство получают повышение уровней мРНК ChoKβ во всех рассматриваемых случаях. Представлен Log10RQ, полученный методом 2^-ΔΔCt, интервал RQ_max-RQ_min соответствует ошибке.

Фиг.5. Совместная экспрессия Chokα и ChoKβ оказывает противоположные эффекты на уровни внутриклеточного этаноламина и холина. Клетки Hek293T трансфицируют векторами экспрессии ChoKα, ChoKβ, ChoKα/ChoKβ одновременно или пустым вектором pCDNA3b. Клетки метят в равновесном состоянии ¹⁴C-холином или ¹⁴C-этаноламином в течение 24 час. Экстрагируют липиды. Изображено количество внутриклеточных PEtn или PCho относительно общих липидов. Общая чрезмерная экспрессия ChoKα и ChoKβ снижает уровни PCho, достигаемые при чрезмерной экспрессии ChoKα отдельно, притом что происходит повышение внутриклеточных уровней PEtn. Результаты, которые показаны, соответствуют среднему значению±среднеквадратичное отклонение из 3 независимых экспериментов, проводимых в трех повторах. * Статистически существенные колебания (p<0,05).

Фиг.6. ChoKβ ингибирует онкогенную способность ChoKα. Клетки Hek293T трансфицируют векторами экспрессии ChoKα, ChoKβ, вместе (ChoKα/ChoKβ) или пустым вектором pCDNA3b в качестве отрицательного контроля. После трансфекции инокулируют 106 клеток подкожно в спину безтимусных мышей (nu-/nu-). Обнаружено, что образование опухолей в случае ChoKα является статистически значимым (p≤0,001). Стимулирование опухолей, вызванное ChoKα, полностью аннулируется, если одновременно чрезмерно экспрессируется ChoKβ.

Фиг.7. ChoKβ ингибирует онкогенную способность ChoKα (II). Клетки ADJ из опухолей, генерированных посредством чрезмерной экспрессии ChoKα, трансфицируют векторами экспрессии ChoKβ или пустым вектором pCDNA3b в качестве отрицательного контроля. После трансфекции инокулируют 106 клеток подкожно в спину безтимусных мышей (nu-/nu-). A) Сравнение роста опухолей, генерированных посредством ADJ/ChoKβ и ADJ/pCDNA3b, B) фотографии ксенотрансплантатов в случае безтимусных мышей, которым сделана инъекция клеток ADJ/ChoKβ (верхнее фото) и ADJ/pCDNA3b (нижнее фото) (4,5 недели).

Фиг.8. Чрезмерная экспрессия ChoKβ в клетках ADJ, производных от Hek293T, задерживает пролиферацию клеток. Клетки ADJ, стабильные в отношении экспрессии ChoKα, трансфицируют посредством векторов экспрессии ChoKβ или пустого вектора pCDNA3b в качестве отрицательного контроля. Клетки высевают на 24-луночные планшеты с плотностью 104 клеток на лунку и инкубируют в течение 16, 48 и 96 час в оптимальных условиях роста, определяют оптическую плотность после окрашивания кристаллическим фиолетовым. Рост клеток, трансфицированных посредством ChoKβ, существенен через 96 час. Статистически значимым считают результат при p<0,05, отмечен звездочкой.

Фиг.9. Количественное определение экспрессии ChoKβ в образцах опухолей у пациентов с NSCLC и по сравнению с экспрессией в коммерческой нормальной ткани, используемой в качестве эталонного образца.

Фиг.10. Диаграммы Каплана-Мейера для экспрессии ChoKβ и выживания, общего и без рецидивов, для пациентов с NSCLC.

Фиг.11. Диаграммы Каплана-Мейера для экспрессии ChoKβ и выживания для пациентов, которые имеют стадию I NSCLC.

Фиг.12. Диаграммы Каплана-Мейера для экспрессии ChoKβ и выживания для пациентов с плоскоклеточной карциномой.

Фиг.13. Диаграммы Каплана-Мейера для комбинированного эффекта экспрессии ChoKα и ChoKβ на выживание пациентов с NSCLC.

Фиг.14. Усиление транскрипции PEMT в ответ на MN58b. Клетки Hek293T, Jurkat, SW780 и H1299 обрабатывают 20 мкМ MN58b в течение 24 час и 48 час и такие же клетки оставляют необработанными в течение таких же периодов времени в качестве контроля. Затем экстрагируют всю РНК указанных клеток и проводят количественную PCR. Изображен Log10RQ, полученный методом 2^-ΔΔCt, интервал RQ_max-RQ_min представляет ошибку. Стрелка в случае клеточных линий Hek293T и SW780 как графическое изображение величины ошибки указывает на то, что в контроле отсутствует экспрессия PEMT и что экспрессия начинается в обработанных клетках, следовательно, сравнение экстраполируют до максимального числа циклов PCR.

Фиг.15. Усиление транскрипции PEMT в ответ на чрезмерную экспрессию ChoKβ. Клетки Hek293T трансфицируют вектором экспрессии ChoKβ или пустым вектором pCDNA3b в качестве контроля. Экспрессию PEMT, фермента, который не экспрессируется в этой системе в нормальных условиях, как наблюдают в случае контроля, индуцируют в качестве транскрипционного ответа на чрезмерную экспрессию ChoKβ. На фигуре показано относительное количество мРНК из PEMT в Log10RQ, полученное методом 2^-ΔΔCt. Стрелка указывает на то, что хотя экспрессионный контроль указанного гена не показан, сравнение экстраполируют до максимального числа циклов PCR.

Подробное описание изобретения

Способ определения прогноза для пациента, страдающего раком, основанный на использовании уровней экспрессии ChoKβ или на соотношении уровней экспрессии ChoKα и ChoKβ

Авторы настоящего изобретения установили, что уровни экспрессии ChoKβ коррелируют с выживанием пациентов, имеющих раковое заболевание. В частности, пониженные уровни ChoKβ, определяемые в образце опухоли пациента, свидетельствуют о том, что пациент демонстрирует плохой прогноз. Таким образом, возможно применение ChoKβ в качестве биомаркера с целью предсказания прогноза для субъекта, который страдает раком.

Следовательно, в одном аспекте изобретение относится к способу определения прогноза для пациента, страдающего раком (здесь далее, первый способ прогнозирования по изобретению), включающему определение уровней экспрессии ChoKβ в образце от указанного пациента, в котором уровни ChoKβ, пониженные относительно уровней в эталонном образце, свидетельствуют о том, что пациент демонстрирует плохой прогноз.

Кроме того, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что комбинированное определение уровней экспрессии двух изоформ ChoK (ChoKα и ChoKβ) составляет прогностический фактор с большей прогностической вероятностью, чем определение каждого из них отдельно. В частности, авторы настоящего изобретения наблюдали, что пациенты, которые одновременно имеют высокие уровни ChoKα и пониженные уровни ChoKβ, демонстрируют худший прогноз, характеризуемый выживанием или частотой рецидивов.

Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу определения прогноза для пациента, страдающего раком (здесь далее, второй способ прогнозирования по изобретению), включающему определение уровней экспрессии ChoKα и ChoKβ в образце от указанного пациента, в котором пониженные уровни ChoKα и высокие уровни ChoKβ относительно уровней экспрессии указанных белков в эталонном образце свидетельствуют о том, что пациент демонстрирует хороший прогноз.

В настоящем изобретении выражение "прогноз" понимают как ожидаемое прогрессирование заболевания, и оно касается оценки вероятности, согласно которой субъект страдает заболеванием, а также оценки его начала, состояния развития, прогрессирования или регрессии и/или прогнозирования течения заболевания в будущем. Как будет понятно специалистам в данной области, такая оценка обычно не может быть корректной для 100% субъектов, подвергаемых диагностированию, хотя преимущественно является корректной. Однако термин требует, чтобы статистически значимую часть субъектов можно было идентифицировать как страдающих заболеванием или имеющих предрасположенность к нему. Если часть является статистически значимой, специалист в данной области может легко ее определить, применяя некоторые хорошо известные способы статистической оценки, например определение доверительных интервалов, определение значений p, t-тест Стьюдента, тест Манна-Уитни и др. Подробности приведены у Dowdy и Wearden, в Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983. Предпочтительные доверительные интервалы составляют, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%. Значения p предпочтительно составляют 0,2, 0,1, 0,05.

Предсказание клинического итога можно выполнить, используя любой оценочный критерий, применяемый в онкологии и известный специалисту в данной области. Оценочные параметры, пригодные для описания прогрессирования заболевания, включают:

прогрессирование без заболевания, которое, как используется в настоящем изобретении, описывает долю субъектов в состоянии полного рецидива, которые не имели рецидивов заболевания в течение периода исследования;

объективная реакция, которая, как используется в настоящем изобретении, описывает долю проходящих лечение людей, у которых наблюдается полная или частичная реакция;

контроль опухоли, который, как используется в настоящем изобретении, касается доли проходящих лечение людей, у которых наблюдается полная реакция, частичная реакция, незначительная реакция или стабильное заболевание ≥6 месяцев;

выживание без прогрессирования, которое, как используется в настоящем изобретении, определяют как время от начала лечения до первого определения роста раковой опухоли;

выживание без прогрессирования в течение шести месяцев или степень "PFS6", которая, как используется в настоящем изобретении, касается процента людей, у которых отсутствует прогрессирование в течение первых шести месяцев после начала терапии;

среднее выживание, которое, как используется в настоящем изобретении, относится ко времени, за которое половина пациентов, вовлеченных в исследование, еще живы, и

время прогрессирования, как используется в настоящем изобретении, относится ко времени, после которого диагностируют заболевание (или лечат) до ухудшения заболевания.

В особом варианте осуществления изобретения определяют клинический итог как выживание субъекта или выживание без рецидивов.

Используемый в данном описании термин "субъект" относится ко всем животным, классифицируемым как млекопитающие, и включает, но не ограничивается ими, домашних и сельскохозяйственных животных, приматов и людей, например людей, приматов, отличных от людей, коров, лошадей, свиней, овец, коз, собак, кошек или грызунов. Предпочтительным субъектом является мужчина или женщина любого возраста или расы.

Для осуществления способов прогнозирования по изобретению получают образец от субъекта, подвергаемого исследованию. Используемый в данном описании термин "образец" относится к любому образцу, который можно получить от пациента. Представленный способ можно применять к любому типу биологических образцов от пациента, такому как биопсия, ткань, клеточный образец или образец жидкости (сыворотка, слюна, сперма, мокрота, цереброспинальная жидкость (CSF), слезы, слизь, пот, молоко, экстракты головного мозга и подобное). В особом варианте осуществления указанный образец представляет собой образец ткани или часть такой ткани, предпочтительно образец опухолевой ткани или часть такой опухолевой ткани. Указанный образец можно получить обычными способами, например биопсией, применяя методы, хорошо известные специалистам в областях, относящихся к медицинским технологиям. Способы получения образца биопсии включают деление опухоли на большие куски, или микрохирургию, или другие способы отделения клеток, известные в данной области. Кроме того, опухолевые клетки можно получить посредством аспирационной цитологии с использованием тонкой иглы. Для облегчения хранения и обработки образцов их можно фиксировать в формалине и заливать парафином или сначала замораживать и затем заливать криоотверждаемой средой, например OCT соединением, посредством погружения в высококриогенную среду, которая допускает быстрое замораживание.

Как понятно специалисту в данной области, уровни экспрессии ChoKβ и/или ChoKα можно определить, измеряя уровни мРНК, кодируемой указанными генами, или измеряя уровни белков, кодируемых указанными генами, т.е. ChoKβ или ChoKα белка.

Таким образом, в особом варианте осуществления изобретения определяют уровни экспрессии ChoKβ и/или ChoKα, измеряя уровни экспрессии мРНК, кодируемой геном ChoKβ и/или ChoKα. Для этой цели биологический образец можно обработать до физического или механического разрушения структуры ткани или клетки с высвобождением внутриклеточных компонентов в водный или органический раствор, получая нуклеиновые кислоты для дополнительных анализов. Нуклеиновые кислоты экстрагируют из образца способами, известными специалистам в данной области и доступными коммерчески. Затем экстрагируют РНК из замороженных или свежих образцов любым из типичных для данной области знаний способов, например способом, описанным Sambrook, J. at al., 2001 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3. В течение процесса экстракции предпочтительно проявляют осторожность для предупреждения деградации РНК.

В особом варианте осуществления уровень экспрессии можно определить, используя мРНК, полученную из образца ткани, фиксированного в формалине, залитого парафином. мРНК можно выделить из типового патологического образца или образца биопсии, который сначала депарафинируют. Обычный способ депарафинирования включает промывание образца в парафине органическим растворителем, таким как ксилол. Депарафинированные образцы можно регидратировать водным раствором низшего спирта. Подходящие низшие спирты включают, например, метанол, этанол, пропанолы и бутанолы. Депарафинированные образцы можно регидратировать, например, путем последовательных промываний растворами низших спиртов с понижением концентраций. Альтернативно, образец депарафинируют и регидратируют одновременно. Затем образец лизируют и экстрагируют из образца РНК.

Хотя все методики определения профиля экспрессии генов (RT-PCR, SAGE или TaqMan) пригодны для применения, если выполняются предыдущие аспекты изобретения, уровни экспрессии мРНК часто определяют посредством обратной транскрипционной-полимеразной цепной реакции (RT-PCR). В особом варианте осуществления уровни экспрессии мРНК ChoKβ и/или ChoKα определяют посредством количественной PCR, предпочтительно PCR в реальном масштабе времени. Определение можно проводить в индивидуальных образцах или в микросериях ткани.

Можно проводить сравнение представляющих интерес уровней экспрессии мРНК в образцах, подлежащих исследованию, с экспрессией контрольной РНК с целью нормировки значения экспрессии мРНК для различных образцов. Используемое в данном описании выражение "контрольная РНК" относится к РНК, уровни экспрессии которой не меняются или меняются только в ограниченной степени в опухолевых клетках относительно неканцерогенных клеток. Контрольная РНК предпочтительно представляет собой мРНК, производную генов «домашнего хозяйства», и кодирует белки, которые экспрессируются конститутивно и выполняют существенные клеточные функции. Примеры генов «домашнего хозяйства» для применения в настоящем изобретении включают β-2-микроглобулин, убиквитин, 18-S рибосомный белок, циклофилин, GAPDH и актин. В предпочтительном варианте осуществления контрольная РНК представляет собой мРНК β-актина. В одном варианте осуществления количественное определение относительной экспрессии генов рассчитывают согласно сравнительному Ct-способу, используя β-актин в качестве эндогенного контроля и коммерческие РНК-контроли в качестве калибраторов. Конечные результаты определяют по формуле 2-(ΔCt образца-ΔCt калибратора), где значения ΔCt для калибратора и образца определяют вычитанием значения CT для гена-мишени из значения для гена β-актина.

Определение уровней экспрессии ChoKβ и/или ChoKα должно коррелировать с эталонными значениями, которые соответствуют среднему значению уровней экспрессии ChoKβ и/или ChoKα, определяемых на коллекции опухолевых тканей в образцах биопсии от субъектов с раковыми заболеваниями. Когда среднее значение установлено, уровень маркера, экспрессируемого в опухолевых тканях пациентов, можно сравнивать со средним значением и, таким образом, определить как "низкий", "нормальный" или "высокий" уровень экспрессии. Коллекцию образцов, из которых определяют эталонный уровень, предпочтительно получают от субъектов, страдающих раком одного типа.

Когда среднее значение установлено, уровень маркера, экспрессируемого в опухолевых тканях пациентов, можно сравнить со средним значением и, таким образом, определить как "повышенный" или "пониженный" уровень экспрессии. Из-за вариабельности среди субъектов (например, аспектов, относящихся к возрасту, расе и др.) очень трудно (если не невозможно практически) установить абсолютные эталонные значения экспрессии ChoKβ и/или ChoKα. Таким образом, в особом варианте осуществления эталонные значения для "повышенной" или "пониженной" экспрессии ChoKβ и/или ChoKα определяют, производя расчет процентилей обычными способами, которые включают оценку групп образцов, выделенных из нормальных субъектов (т.е. людей, не имеющих раковых диагнозов), по уровням экспрессии ChoKβ и/или ChoKα. Тогда "пониженные" уровни ChoKβ можно предпочтительно установить для образцов, в которых уровни экспрессии ChoKβ равны или меньше 50-го процентиля в нормальной популяции, включая, например, уровни экспрессии, равные или меньшие 60-го процентиля в нормальной популяции, равные или меньшие 70-го процентиля в нормальной популяции, равные или меньшие 80-го процентиля в нормальной популяции, равные или меньшие 90-го процентиля в нормальной популяции и равные или меньшие 95-го процентиля в нормальной популяции. Тогда "повышенные" уровни ChoKα можно предпочтительно установить для образцов, в которых уровни экспрессии ChoKα равны или больше 50-го процентиля в нормальной популяции, включая, например, уровни экспрессии, равные или больше 60-го процентиля в нормальной популяции, равные или больше 70-го процентиля в нормальной популяции, равные или больше 80-го процентиля в нормальной популяции, равные или больше 90-го процентиля в нормальной популяции и равные или больше 95-го процентиля в нормальной популяции.

Альтернативно, еще в одном конкретном варианте осуществления уровни экспрессии ChoKβ и/или ChoKα можно определить, измеряя уровни белков, кодируемых указанными генами, т.е. белка ChoKβ и/или ChoKα, и уровни их разновидностей.

Определение уровней экспрессии белков можно выполнить по иммунологическим методикам, таким как, например, ELISA, иммуноблот-анализ или иммунофлуоресценция. Иммуноблот-анализ основан на детектировании белков, предварительно разделенных посредством гель-электрофореза в условиях денатурации и иммобилизованных в мембране, обычно нитроцеллюлозной, посредством инкубации со специфическим антителом и проявляющей системой (например, хемолюминесцентной). Анализ посредством иммунофлуоресценции требует использования антитела, специфического относительно белка-мишени, для анализа экспрессии. ELISA основан на использовании антигенов или антител меченных ферментами, таким образом, что конъюгаты, образованные целевым антигеном и меченым антителом, дают в результате образование ферментативно-активных комплексов. Дано, что один из компонентов (антиген или меченое антитело) иммобилизован на подложке, комплексы антиген-антитело иммобилизованы на подложке и, таким образом, могут быть детектированы при добавлении субстрата, который преобразуется ферментом в продукт, который детектируется, например, посредством спектрофотометрии или флуориметрии.

Если применяют иммунологический способ, то для детектирования количества белков-мишеней можно использовать любое антитело или реагент, для которого известно, что он связывается с белками-мишенями с высокой аффинностью. Однако предпочтительно использование антитела, например поликлональных сывороток, супернатантов гибридом или моноклональных антител, фрагментов антител, Fv, Fab, Fab' и F(ab')₂, scFv, диател, триател, тетрател и гуманизированных антител.

Кроме того, определение уровней экспрессии белка можно проводить, составляя микронабор тканей (TMA), содержащий комбинированные образцы от субъектов, и определяя уровни экспрессии белков посредством иммуногистохимических методик, хорошо известных при современном состоянии науки.

Хотя способы прогнозирования по изобретению можно обычно применять для опухоли любого типа, в предпочтительном варианте осуществления для опухолей, характеризуемых высокими уровнями экспрессии ChoKα, применяют оба способа прогнозирования по изобретению, первый и второй.

Определение высоких уровней ChoKα, путь определения уровней и эталонный образец, подходящий для определения указанных уровней, подробно объяснены в контексте терапевтического способа по изобретению.

В особом варианте осуществления способы прогнозирования по изобретению применяют к раку легкого, молочной железы, мочевого пузыря или колоректальному раку.

Способ определения реакции пациента с раковым заболеванием на лечение ингибитором ChoKα, основанный на использовании уровней PEMT и/или ChoKβ

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что существует корреляция между уровнями экспрессии PEMT и/или ChoKβ и реакцией пациента с раковым заболеванием на лечение ингибиторами ChoKα. В частности, результаты, представленные в примере 3 настоящего изобретения, показывают, что высокие уровни ChoKβ и/или PEMT коррелируют с позитивной реакцией на ингибиторы ChoKα. Эти результаты позволяют использовать ChoKβ и/или PEMT в качестве биомаркеров реакции на ингибиторы ChoKα. Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к способу определения реакции пациента с раковым заболеванием на лечение ингибитором ChoKα (здесь далее, способ персонализированной терапии по изобретению), включающему определение в образце от указанного пациента уровней экспрессии белка, выбранного из группы: PEMT и ChoKβ, при котором повышение уровней экспрессии PEMT или повышение уровней экспрессии ChoKβ относительно уровней в эталонном образце свидетельствуют о хорошей реакции на ингибитор ChoKα.

Выражение "определение реакции пациента" относится к оценке результатов лечения пациента, который страдает раком, в ответ на терапию, основанную на использовании ингибиторов ChoKα. Применять биомаркеры по изобретению с целью контроля эффективности лечения можно также для способов выбора и скрининга лекарственных средств с потенциальной противоопухолевой активностью. Этот способ включает a) введение субъекту (предпочтительно животному) лекарственного средства, подлежащего исследованию; b) отбор биологических образцов у животных в различных точках исследования (до, во время и/или после введения) и определение уровней маркера согласно настоящему изобретению и c) сравнение определений, проведенных на образцах, полученных на различных фазах обработки, и сравнение их с контрольными животными, например необработанными животными.

В контексте настоящего изобретения под PEMT подразумевают белок фосфатидилэтаноламинметилтрансферазу, способный катализировать превращение фосфатидилэтаноламина в фосфатидилхолин посредством двойного метилирования.

Как описано в отношении способов прогнозирования по изобретению, определение уровней PEMT и ChoKβ можно проводить путем определения соответствующих уровней полипептидов, для чего применяют стандартную методику, например, Вестерн-блоттинг или иммуноблотинг, ELISA (адсорбционный иммуноферментный анализ), RIA (радиоиммуноанализ), конкурентный EIA (конкурентный иммуноферментный анализ), DAS-ELISA (сандвичевый метод двойных антител ELISA), иммуноцитохимические и иммуногистохимические методики, методики, основанные на применении микронаборов белков или биочипов, включающих специфические антитела, или исследования, основанные на осаждении коллоидов, например, в формате индикаторных полосок.

Альтернативно, определение уровней PEMT и ChoKβ можно проводить путем определения соответствующих уровней мРНК, для чего можно применять стандартную методику, такую как PCR в реальном масштабе времени, SAGE, TaqMan, RT-PCR и подобные.

В случае PEMT также возможно определить уровни экспрессии путем определения активности фермента соответствующего белка, для чего применяют обычные способы, такие как способы на основе детектирования включения метильных групп, меченных фосфатидилдиметилэтаноламином, используя для этой цели [метил-3H]AdoMet в качестве донора метильных групп, как изначально описано Ridgway и Vance (Methods Enzymol. 1992, 209, 366-374), Zhu at al. (Biochem. J., 2003, 370, 987-993) и Song at al. (FASEB J., 2005, 19: 1266-1271).

В контексте настоящего изобретения выражение "ингибитор ChoKα" понимают как любое соединение, способное давать снижение активности ChoK, включая соединения, которые предотвращают экспрессию гена ChoKα, давая в результате пониженные уровни мРНК или белка ChoK, а также соединения, которые ингибируют ChoK, вызывая снижение активности фермента.

Соединения, способные предотвращать экспрессию гена ChoKα, можно идентифицировать, применяя стандартные исследования для определения уровней экспрессии мРНК, такие как RT-PCR, анализ с помощью защиты РНК, нозерн-методику, гибридизацию in situ, методику с микронаборами и подобные.

Соединения, которые дают пониженные уровни белка ChoK, можно идентифицировать, применяя стандартные исследования для определения уровней экспрессии белка, такие как иммуноблоттинг или вестерн-блоттинг, ELISA (адсорбционный иммуноферментный анализ), RIA (радиоиммуноанализ), конкурентный EIA (конкурентный иммуноферментный анализ), DAS-ELISA (сандвичевый метод двойных антител ELISA), иммуноцитохимические и иммуногистохимические методики, методики, основанные на применении микронаборов белков или биочипов, которые включают специфические антитела, или исследования, основанные на осаждении коллоидов в форматах индикаторных полосок.

Определение ингибирующей способности по биологической активности холинкиназы проводят, применяя стандартные исследования по измерению активности холинкиназы, например, способы, основанные на детектировании фосфорилирования холина, меченного [¹⁴C]-АТФ в присутствии очищенной рекомбинантной холинкиназы или обогащенной холинкиназой фракции с последующим детектированием фосфорилированного холина, применяя стандартные аналитические методики (например, ТСХ), как описано в EP1710236.

Конкретные ингибиторы холинкиназы I-XVIII, которые можно использовать в первой композиции по настоящему изобретению, описаны в таблице 1.

Таблица 1 Ингибиторы ChoKα
I	Соедине