Способы трансформации дрожжей

Способы трансформации дрожжей

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Родственная заявка

По настоящей заявке испрашивается приоритет и преимущества предварительной заявки США номер 61/067910, поданной 3 марта 2008 г.

Область изобретения

Изобретение относится к области трансформации дрожжей, к клеткам дрожжей, библиотекам клеток дрожжей, трансформированных таким образом, и к продукции в них рекомбинантных продуктов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к трансформации дрожжей электропорацией.

Предпосылки изобретения

Терапевтические антитела, полученные с использованием иммунизаций животных in vivo или посредством способа дисплея рекомбинантных антител in vitro, являлись успешными в клинической практике, и в таком качестве подтвердили, что эти способы являются эффективными способами поиска новых лекарственных средств. В то время как, как правило, ожидают, что моноклональные антитела, полученные при иммунизациях животных, обладают достаточно высокой аффинностью для достижения терапевтической эффективности, то для разработки терапевтических антител при иммунизациях животных необходима либо гуманизация не относящихся к человеку антител, либо доступ к трансгенным животным, экспрессирующим человеческие антитела. Непосредственный отбор полностью человеческих антител из предварительно полученных библиотек антител посредством способов дисплея in vitro (фагового, бактериального, дрожжевого дисплеев, дисплея клеток млекопитающих и рибосомного дисплея) (Chao, G. et al. (2006) Nat. Protoc. 1:755-68; Gai, S. A. and Wittrup, K. D. (2007) Curr. Opin. Struct. Biol. 17:467-73; Griffiths, A. D. et al. (1994) EMBO J. 13:3245-60; He, M. and Khan, F. (2005) Expert Rev. Proteomics 2:421-30; Hoogenboom, H. R. (2002) Methods Mol. Biol. 178:1-37; Hoogenboom, H. R. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1105-16) предлагает ценный параллельный способ и может представлять наилучшую альтернативу в случаях, когда антиген-мишень не может вызывать продуктивный иммунный ответ in vivo.

Сконструированы библиотеки человеческих антител для экспонирования полноразмерного антитела или различных фрагментов антитела, таких как Fab, scFv и dAb. Библиотеки, как правило, конструируют либо отражением и переносом разнообразия антител из репертуара B-клеток в библиотеку с дополнительным введением синтетического разнообразия или без него (Hoet, R. M. et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:344-8), либо посредством синтетического случайного распределения остатков CDR в ограниченных каркасных областях человеческих антител (Rothe, C. et al. (2008) J. Mol. Biol. 376:1182-200). Поскольку тяжелые и легкие цепи антитела амплифицируют по отдельности и переформатируют в формат библиотеки дисплея, новые объединения между VH и VL формируются в ходе этого процесса. В то время как эта перетасовка VH-VL позволяет создать новые антигенсвязывающие участки, она также очень значительно увеличивает теоретическое разнообразие библиотеки. Разработано несколько стратегий для конструирования лучших и более продуктивных библиотек антител посредством уменьшения теоретического разнообразия библиотеки и действительного размера библиотеки, необходимого для эффективного отбора образцов из библиотеки. Эти способы включают в себя интеллектуальное конструирование синтетических или полусинтетических библиотек (Rothe, C. et al. (2008) J Mol Biol. 376:1182-200) и иммунных (Hoet, R. M. et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:344-8) или псевдоиммунных (Lee, H. W. et al. (2006) Biochem. Biophys. Res. Commun. 346:896-903) библиотек, полученных из менее разнообразных, но потенциально более реакционно-способных репертуаров B-клеток. Хотя эти способы могут являться эффективными для значительного уменьшения теоретического разнообразия библиотеки на несколько или даже много порядков, необходимость в больших размерах библиотек и способах их получения всегда будет дополнять конструирование библиотек для увеличения шансов идентификации найденных антител независимо от их редкости.

Доступность средств для получения библиотек нуклеиновых кислот и продуцируемых в них рекомбинантных продуктов, таких как фармацевтические белки, в эукариотических системах, таких как дрожжи, обеспечивает значительные преимущества по отношению к применению прокариотических систем, таких как E. coli. Дрожжи, как правило, можно выращивать до более высокой плотности клеток, чем бактерии, и их можно легко адаптировать для переработки с непрерывной ферментацией. Однако развитие видов дрожжей в качестве систем хозяин/вектор для получения рекомбинантных продуктов и библиотек серьезно затруднено отсутствием знаний об условиях трансформации и подходящих средствах для стабильного введения чужеродных нуклеиновых кислот в дрожжевые клетки-хозяева.

Среди различных электрических и биологических параметров, облегчающих электротрансформацию клеток, присутствует адсорбция ДНК на поверхности клеток. Переменные электрические поля низкой интенсивности также стимулируют перенос ДНК в бактерии E. coli, предположительно, посредством электрической стимуляции пермеаз ДНК. Накоплены свидетельства преобладающего электродиффузионного или электрофоретического эффекта на перенос генов посредством электропорации для полиэлектролитной ДНК. Опубликованы также облегчение электроосмотических эффектов и выпячивания мембраны посредством электропорации.

Приложение электрического поля через мембрану дрожжевой клетки приводит к образованию временных пор, являющемуся критическим для процесса электропорации. Генератор сигнала для электропорации обеспечивает напряжение (в кВ), проходящее через промежуток (в см) между электродами. Эта разность потенциалов определяет то, что называют силой электрического поля, где E эквивалентно кВ/см. Каждая клетка обладает собственной критической силой поля для оптимальной электропорации. Это обусловлено размером клетки, строением мембраны и индивидуальными характеристиками самой клеточной стенки. Например, для клеток млекопитающих, как правило, необходимо между 0,5 и 5,0 кВ/см до смерти клетки и/или прохождения электропорации. Как правило, необходимая сила поля меняется в обратной зависимости от размера клетки.

Способы трансформации

1. Трансформация посредством электропорации

Becker et al. (Methods in Enzymology 194: 182-187 (1991)) описывают способы трансформации дрожжей Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Becker описывает также трансформацию сферопластов.

Faber et al. (Curr. Genet. 25: 305-310 (1994)) описывают способы трансформации метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha. Faber также применял способ к Pichia methanolica.

Helmuth et al. (Analytical Biochem. 293:149-152 (2001)) описывают увеличение эффективности трансформации дрожжей комбинацией предварительных обработок как LiAc, так и DTT.

Kasutske et al. (Yeast 8: 691-697 (1992)) описывают электроимпульсную трансформацию интактных клеток Candida maltosa различными гомологичными векторными плазмидами.

Meilhoc et al. (Bio/Technology 8: 223-227 (1990)) описывают систему трансформации с использованием интактных клеток дрожжей S. cerevisiae и импульсов электрического поля.

Neumann et al. (1996) Biophys. J. (1996) 71:868-877 описывают кинетику трансформации клеток дрожжей посредством электропорации и опосредованной кальцием адсорбции ДНК.

Piredda et al. (Yeast 10: 1601-1612 (1994)) описывает систему трансформации для дрожжей Yamadazyma (Pichia) ohmeri.

Scorer et al. (Bio/Technology 12: 181-184 (1994)) описывают векторы P. pastoris, позволяющие быструю селекцию с G418 редких трансформантов с большим числом копий для экспрессии в Pichia pastoris с использованием систем как электропорации, так и трансформации сферопластов.

Sherman et al. (Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, pages 91 102, Cold Spring Harbor Laboratory (1986)) описывают трансформацию мутантов дрожжей LEU2 и HIS3.

Suga и Hatakeyama (Curr. Genet. 43:206-211 (2003)) описывают способ замораживания для получения компетентных клеток до электропорации с помощью добавления кальция.

Thompson et al. (Yeast 14:565-571 (1998)) описывают подготовку клеток дрожжей, таких как S. cerevisiae и Candida albicans, для трансформации посредством электропорации.

Yang et al. (Applied and Environmental Microbiology 60(12): 4245-4254 (1994)) описывают электропорацию Pichia stipitis, основанную на их гене URA3 и гомологичной автономно реплицирующейся последовательности ARS2.

В патенте США No. 5716808 от Raymond описаны способы получения клеток Pichia methanolica, содержащих чужеродные конструкции ДНК, с использованием электропорации и способы продукции чужеродных пептидов в клетках Pichia methanolica.

В патенте США No. 7009045 от Abbas описана трансформация флавиногенных дрожжей, Pichia guilliermondii и Candida famata, посредством электропорации и посредством трансформации сферопластов.

2. Трансформация посредством образования сферопластов

Becker et al. (Methods in Enzymology 194: 182-187 (1991)) описывают способы трансформации дрожжей S. cerevisiae, так же как трансформации сферопластов.

Scorer et al. (Bio/Technology 12: 181-184 (1994)) описывают векторы P. pastoris, позволяющие быструю селекцию с G418 редких трансформантов с большим числом копий для экспрессии в Pichia pastoris с использованием систем как электропорации, так и трансформации сферопластов.

В патенте США No. 4808537 от Stroman et al. описан способ выделения и клонирования индуцируемого метанолом гена из Pichia pastoris и регуляторные области, применимые для регуляции посредством метанола экспрессии гетерологичных генов с использованием трансформации сферопластов.

В патенте США No. 4837148 от Cregg et al. описаны последовательности для автономной репликации, способные поддерживать плазмиды в форме внехромосомных элементов в штаммах-хозяевах Pichia. Кроме того, в патенте описаны конструкции, включая последовательности ДНК, так же как трансформированные организмы, полученные посредством образования сферопластов, и предоставлены способы получения последовательностей ДНК и конструкций по изобретению, так же как способы выделения последовательностей из любого источника.

В патенте США No. 4855231 от Stroman et al. описаны последовательности ДНК, ответственные за присутствие метанола, не репрессируемые катаболитами источники углерода и голодание по источникам углерода. В патенте '231 показана трансформация сферопластов Pichia pastoris.

В патенте США No. 4879231 от Stroman et al. описан способ трансформации сферопластов дрожжей, таких как Pichia pastoris.

В патенте США No. 4882279 от Cregg et al. описан способ трансформации сферопластов для дрожжей рода Pichia, например, Pichia pastoris.

Патент США No. 5135868 от Cregg относится к способу сайтспецифической геномной модификации дрожжей рода Pichia. В патенте '868 используют способ трансформации сферопластов.

Патент США No. 5268273 от Buckholz относится к способу трансформации сферопластов Pichia pastoris.

Патент США No. 5736383 от Raymond относится к способу трансформации штаммов дрожжей рода Pichia, в частности, Pichia methanolica. Кроме того, патент '383 относится к способу трансформации сферопластов дрожжей рода Pichia, так же как к способу трансформации посредством электропорации.

3. Другие системы трансформации

Kunze et al. (Current Genetics 9(3): 205-209 (1985)) описывают способ трансформации S. cerevisiae, Candida maltosa и Pichia guilliermondii G266 плазмидой pYe(ARG4)411, содержащей ген ARG4 S. cerevisiae, вставленный в pBR322. Kunze использовал CaCl₂ в способе трансформации.

Kunze et al. (J. Basic Microbiol. 25(2): 141-144 (1985)) описывают способ трансформации промышленно важных дрожжей Candida maltosa и Pichia guilliermondii G266 с использованием CaCl₂.

Kunze et al. (Acta Biotechnol. 6(1): 28 (1986)) описывают трансформацию промышленно важных дрожжей Candida maltosa и Pichia guilliermondii.

Neistat et al. (Mol. Ge. Mikrobiol. Virusol. 12: 19-23 (1986))(Только аннотация) описывают трансформацию дрожжей Hansenula polymorpha, Pichia guilliermondii, Williopsis saturnus плазмидой, несущей ген ADE2 S. cerevisiae. Способ трансформации не описан.

В патенте США No. 4929555 от Cregg et al. описан способ получения цельных клеток метилотрофных видов рода Pichia, компетентных по трансформации посредством ДНК и способ трансформации с помощью ДНК цельных клеток таких видов, в частности, Pichia pastoris.

В патенте США No. 5231007 от Heefner et al. описан способ получения и выделения высоко флавиногенных штаммов Candida famata, продуцирующих выходы рибофлавина приблизительно 7,0-7,5 грамм на литр за 6 суток. Способ включает в себя сочетание повторяющихся стадий мутагенеза и слияния протопластов, проводимых для исходного штамма и происходящих из него штаммов, которые отбирают после каждой стадии согласно протоколу скрининга.

4. Векторы, элементы ARS и библиотеки генов

Clyne, R. K. et al. (EMBO J. 14(24): 6348-6357 (1995)) относится к тонкому структурному анализу ARS1, элемента ARS делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe. Характеризация серий мутаций с гнездовыми делециями показала, что минимальный фрагмент ДНК, содержащий ARS1, является большим, поскольку ни один фрагмент ниже 650 п.о. не сохранял значительную активность ARS.

Liauta-Teglivets, O. et al. (Yeast 11(10): 945-952 (1995)) описывают клонирование структурного гена GTP-циклогидролазы, вовлеченного в биосинтез рибофлавина, из геномной библиотеки Pichia guilliermondii.

Cannon, R. D. et al. (Mol. Gen. Genet. 221(2): 210-218 (1990)) описывают выделение и нуклеотидную последовательность элемента автономно реплицирующейся последовательности (ARS), функционального в Candida albicans и S. cerevisiae.

Takagi, M. et al. (J. Bacteriol. 167(2): 551-555 (1986)) описывают конструирование системы вектор-хозяин в Candida maltosa с использованием участка ARS, выделенного из их генома.

Pla, J. et al. (Gene 165(1): 115-120(1995)) относится к фрагментам ДНК ARS2 и ARS3 Candida albicans с активностью автономной репликации, способствующие, как показано, неинтегративной генетической трансформации как Candida albicans, так и S. cerevisiae.

В патенте США No. 5212087 от Fournier et al. описаны последовательности ARS, являющиеся эффективными в Yarrowia lipolytica, так же как плазмиды, несущие эти последовательности.

В патенте США No. 5665600 от Hagenson et al. описаны линейные плазмиды Pichia pastoris и их ДНК фрагменты, содержащие последовательности ARS. В патенте '600 использовали систему трансформации сферопластов, как описано у Cregg et al в патенте США No. 4929555.

В патенте США No. 4837148 от Cregg et al. описаны автономно реплицирующиеся последовательности, способные поддерживать плазмиды в форме внехромосомных элементов в штаммах-хозяевах Pichia. Кроме того, патент '148 относится к конструкциям, содержащим последовательности ДНК, так же как к трансформированными ими организмами. Кроме того, патент относится к способам получения последовательностей ДНК и конструкций по изобретению, так же, как к способам выделения последовательностей из любого источника.

Chao et al. (Nature Protocols, 1(2):755-768 (2006)) описывает способ трансформации клеток дрожжей посредством электропорации и достижение максимального размера библиотеки 5 × 10⁷ с помощью 5 мкг ДНК вставки и 1 мкг ДНК вектора.

Вышеуказанные способы и описания, в то время как позволяют достигать все более высокой эффективности трансформации, все еще являются трудоемкими и занимают значительное время и повторяющиеся усилия для накопления множества малых библиотек в диапазоне размеров 10⁶-10⁷ до более крупной и комбинированной библиотеки размером в диапазоне размеров 10⁸-10⁹.

Для дрожжевых библиотек не достигают размера или эффективности, достигнутых для фаговых библиотек. По обзору Hoogenboom в 2005 (Nature Biotech., 23(9):1105-1116), типичный максимальный размер фаговой библиотеки составляет 10¹⁰-10¹¹, в то время как размер типичной дрожжевой библиотеки составляет 10⁷ (значительно менее, чем размер, достигаемый с технологиями другого дисплея (Hoogenboom, H. R. (2002) Methods Mol. Biol. 178:1-37; Hoogenboom, H. R. (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1105-16), хотя ранее опубликованные размеры библиотек в области 10⁹ (Hoet, R. M. et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:344-8; Lipovsek, D. et al. (2007) J. Mol. Biol. 368:1024-41; Segal, L. et al. (2007) Bioinformatics 23:i440-9. Feldhaus et al. (Nature Biotech., 21: 163-170 (2003)) показали, что библиотеку 1,5 × 10⁹ можно сконструировать посредством тщательного повторения трансформации и объединения затем трансформированных библиотек. Хотя недавний прогресс в способах электропорации (смотри Chao, Nature Protocols 1(2):755-768 (2006)) сделал возможным достигать максимального размера дрожжевой библиотеки 5 × 10⁷ при однократной трансформации, авторы настоящего изобретения обнаружили, что по способу Chao дрожжи, как правило, трансформируют со значительно более низкой эффективностью трансформации. До сих пор является корректным утверждение, что эти размеры дрожжевых библиотек, достигаемые к настоящему времени, все еще значительно ниже тех, которые можно достичь общепринятым образом посредством библиотек фагового дисплея размером 10¹⁰-10¹¹.

Отбор библиотеки дрожжевого дисплея, с использованием как магнитных бусин, так и активированной флуоресценцией сортировки клеток, предоставляет эффективный и чувствительный способ обогащения членами, специфически связывающими антигены-мишени, в частности, благодаря их совместимости с активированной флуоресценцией сортировкой клеток (FACS). Преимуществу этой мощности отбора, однако, препятствует ограниченный размер типичных библиотек дрожжевого дисплея из-за низкой эффективности трансформации клеток дрожжей. Если бы способ отбора дрожжевого дисплея можно было бы объединить с более крупными библиотеками антител, сходных с библиотеками, полученными для фагового дисплея (размером приблизительно 10¹⁰), способ дрожжевого дисплея предоставлял бы чрезвычайно эффективный инструмент для обнаружения антител.

Таким образом, существует необходимость в эффективных способах получения библиотек белков, например, библиотек антител, с использованием дрожжей.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к высокоэффективным и быстрым способам трансформации клеток дрожжей, например, для получения библиотек клеток дрожжей размером вплоть до 2 × 10¹⁰. Способы по изобретению делают возможными достигать выходов в масштабе фаговых библиотек. Способы по изобретению удаляют значительное узкое место при применении способа дрожжевого дисплея в качестве практического инструмента для достижения намного большего объема разнообразия, ранее неисследованного, и размер библиотеки в настоящее время ограничен только размером культуры дрожжей, которую можно выращивать в лабораториях.

Множество компонентов и условий, включая использование CaCl₂, MgCl₂, сахарозы, сорбита, ацетата лития, дитиотреитола, напряжение электропорации, нагрузку ДНК и объем клеток, тестировали или титровали для идентификации наилучшей комбинации. Посредством применения этого недавно разработанного способа библиотеку антител 2×10¹⁰ сконструировали из РНК селезенки человека по существу за одни сутки с типичной эффективностью трансформации 1-1,5×10⁸ трансформантов на микрограмм ДНК вектора. Анализ последовательности подтвердил разнообразное представление зародышевых последовательностей антител в этой библиотеке антител неимунной селезенки человека. Посредством проведения пилотных отборов из библиотеки авторы настоящего изобретения идентифицировали антитела человека против TNF-α и IL-18 с низкими наномолярными аффинностями, показав продуктивность этой библиотеки.

В одном аспекте изобретение относится к способам получения дрожжевой библиотеки посредством электропорации клеток дрожжей, где способ включает в себя стадии (a) получения суспензии, содержащей векторы из нуклеиновой кислоты, клетки дрожжей, сорбит и CaCl₂; и (b) электропорации суспензии при от 0,5 кВ/см до более 12,5 кВ/см с емкостью от приблизительно 10 до приблизительно 50 мкФ. В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способам трансформации дрожжей с помощью ДНК для получения библиотеки, где способ включает в себя стадии (a) культивирования клеток дрожжей до OD₆₀₀ от приблизительно 1,0 до приблизительно 2; (b) промывки клеток дрожжей в одном объеме холодной воды; (c) промывки клеток дрожжей в одном объеме холодного 1 M сорбита/1 мМ CaCl₂; (d) инкубации клеток дрожжей в одном объеме 30°C 0,1 M LiAc/10мМ DTT; (e) промывки клеток дрожжей во втором объеме холодного 1 M сорбита /1 мМ CaCl₂; (f) ресуспендирования клеток дрожжей в третьем объеме холодного 1M сорбита/1 мМ CaCl₂ для формирования суспензии клеток дрожжей для электропорации; (g) добавления одного объема суспензии клеток для электропорации к ДНК вектора и ДНК вставки для формирования суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации; и (h) электропорации суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации при напряжении между приблизительно 2,5 кВ/см и приблизительно 12,5 кВ/см в кювете с просветом 0,2 см.

Соотношение ДНК вектора к ДНК вставки лежит в диапазоне от приблизительно 1:0,5 до приблизительно 1:10, например, 1:0,5, 1:1; 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, или 1:10. В одном из вариантов осуществления, приблизительно 1 мкг ДНК вектора и приблизительно 1 мкг ДНК вставки используют для реакции. В другом варианте осуществления приблизительно 1 мкг ДНК вектора и приблизительно 2 мкг ДНК вставки преципитируют. В другом варианте осуществления приблизительно 1 мкг ДНК вектора и приблизительно 3 мкг ДНК вставки преципитируют. В другом варианте осуществления приблизительно 1 мкг ДНК вектора и приблизительно 4 мкг ДНК вставки преципитируют. В другом варианте осуществления, приблизительно 1 мкг ДНК вектора и приблизительно 5 мкг ДНК вставки преципитируют.

В одном из вариантов осуществления суспензия клеток содержит от приблизительно 50 до приблизительно 400 мкл клеток дрожжей, например, приблизительно 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 мкл клеток дрожжей.

В одном из вариантов осуществления суспензия клеток дрожжей содержит от приблизительно 1 до приблизительно 10 × 10⁹ клеток дрожжей/мл, например, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9 или приблизительно 10×10⁹ клеток дрожжей/мл.

В одном из вариантов осуществления сила поля, используемая для электропорации клеток дрожжей, составляла от приблизительно 0,5 кВ/см до приблизительно 12,5 кВ/см, например, приблизительно 0,5, приблизительно 1,0, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5, приблизительно 10,0, приблизительно 10,5, приблизительно 11,0, приблизительно 11,5, приблизительно 12,0, приблизительно 12,5, приблизительно 13,0, приблизительно 13,5, приблизительно 14,0, приблизительно 14,5, или приблизительно 15,0 кВ/см.

В одном из вариантов осуществления проводят электропорацию клеток дрожжей при емкости от приблизительно 10 до приблизительно 50 мкФ, например, приблизительно 10, приблизительно 15, приблизительно 20, приблизительно 25, приблизительно 30, приблизительно 35, приблизительно 40, приблизительно 45 или приблизительно 50.

В одном из вариантов осуществления клетки дрожжей суспендируют в от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 М сорбите и в от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мМ CaCl₂ или MgCl_2, например, приблизительно 0,1, приблизительно 0,25, приблизительно 0,5, приблизительно 0,75, приблизительно 1,0, приблизительно 2,0, приблизительно 3,0, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0, приблизительно 6,0, приблизительно 7,0, приблизительно 8,0, приблизительно 9,0, или приблизительно 10,0 M сорбит, или, например, приблизительно 0,1, приблизительно 0,25, приблизительно 0,5, приблизительно 0,75, приблизительно 1,0, приблизительно 2,0, приблизительно 3,0, приблизительно 4,0, приблизительно 5,0, приблизительно 6,0, приблизительно 7,0, приблизительно 8,0, приблизительно 9,0 или приблизительно 10,0 мМ CaCl₂ или MgCl₂.

В одном из вариантов осуществления клетки дрожжей инкубируют в от приблизительно 0,01 до приблизительно 1,0 M LiAc, например, приблизительно 0,01, приблизительно 0,02, приблизительно 0,03, приблизительно 0,04, приблизительно 0,05, приблизительно 0,06, приблизительно 0,07, приблизительно 0,08, приблизительно 0,09, приблизительно 0,1, приблизительно 0,2, приблизительно 0,3, приблизительно 0,4, приблизительно 0,5, приблизительно 0,6, приблизительно 0,7, приблизительно 0,8, приблизительно 0,9 или приблизительно 1,0 M LiAc, и/или в от приблизительно 1 до приблизительно 100 мМ DTT, например, приблизительно 1, приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90 или приблизительно 100 мМ DTT.

В конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам трансформации дрожжей с помощью ДНК для получения библиотеки, где способ включает в себя одну или несколько из стадий (a) культивирования клеток дрожжей в течение ночи до OD₆₀₀ от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0; (b) промывки клеток дрожжей в воде; (c) промывки клеток дрожжей в растворе, содержащем сорбит и CaCl₂; (d) инкубации клеток дрожжей в растворе, содержащем LiAc и DTT; (e) промывки клеток дрожжей в растворе, содержащем сорбит и CaCl₂; (f) ресуспендирования клеток дрожжей в одном объеме раствора, содержащего сорбит и CaCl₂, для формирования суспензии клеток дрожжей для электропорации; (g) добавления одного объема суспензии клеток для электропорации к ДНК вектора и ДНК вставки для формирования суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации; и (h) электропорации суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации при напряжении между приблизительно 2,5 кВ/см и приблизительно 12,5 кВ/см в кювете с просветом 0,2 см.

В другом конкретном варианте осуществления изобретение относится к способам трансформации дрожжей с помощью ДНК, где способ включает в себя две или более стадии из: (a) минимизации объема ДНК вектора и вставки в соотношении приблизительно 1:0,5 до приблизительно 1:10 посредством преципитации ДНК в осадок с последующим ресуспендированием в минимальном объеме; (b) культивирования клеток дрожжей от колонии до соответствующего состояния роста посредством (i) инокуляции первого объема среды колонией дрожжей из чашки для выращивания или частью растущей культуры дрожжей; (ii) выращивания клеток дрожжей в течение ночи при 30°C; (iii) инокуляции второго объема среды клетками со стадии (ii) и выращивания клеток при 30°C, пока они не достигнут OD₆₀₀ от приблизительно 1,3 до приблизительно 1,6; (c) осаждения клеток дрожжей центрифугированием; (d) промывки клеток дрожжей холодной водой; (e) промывки клеток дрожжей холодным 1М сорбитом/1 мМ CaCl₂; (f) ресуспендирования клеток дрожжей в 0,1 М LiAc/10 мМ DTT; (g) инкубации клеток дрожжей при 30°C при 250 об/мин в течение 30 минут; (h) промывки клеток дрожжей с помощью 1 М сорбита/1 мМ CaCl₂; (i) ресуспендирования клеток дрожжей в 1 М сорбите/1 мМ CaCl₂ для формирования суспензии клеток дрожжей для электропорации; (j) добавления части суспензии клеток дрожжей для электропорации к осадку ДНК для формирования суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации; (k) электропорации суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации в диапазоне от приблизительно 0,5 кВ до приблизительно 2,5кВ и при емкости 25 мкФ; (1) добавления смеси 1:1 1 М сорбита/YPD (конечная концентрация: 0,5 М сорбит, 0,5 × YPD) к подвергнутой электропорации суспензии клеток дрожжей - ДНК для электропорации и инкубации при 30°C в течение 1 часа; и (m) осаждения клеток дрожжей и ресуспендирования в 10 мл 1 М сорбита.

Краткое описание фигур

Вышеупомянутые и другие цели, признаки и преимущества настоящего изобретения, так же как собственно изобретение, можно более полно понять из следующего ниже описания предпочтительных вариантов осуществления при чтении вместе с сопровождающими фигурами:

На фигуре 1 показано графическое представление данных в таблице 1, которая представляет счет колоний как функцию от вектора: вставки и напряжения от 2,5кВ/см до 12,5кВ/см.

На фигуре 2 показано графическое представление данных в таблице 3, которая представляет счет колоний как функцию от вектора: вставки и напряжения от 2,5 кВ/см до 12,5кВ/см.

Фигура 3 показывает, что эффективность электропорации значительно улучшается посредством увеличения объема на кювету.

Фигура 4 показывает, что увеличенная нагрузка ДНК и высокое напряжение, но не соотношение вектора и вставки, являются критическими для максимальной эффективности трансформации.

Подробное описание изобретения

Способ высокоэффективной электропорации для Saccharomyces cerevisiae разработан посредством тестирования и комбинации нескольких ранее идентифицированных условий (Chao, G. et al. (2006) Nat. Protoc. 1:755-68; Becker, D. M. and Guarente, L. (1991) Methods Enzymol. 194:182-7; Helmuth, M. et al. (2001) Anal. Biochem. 293:149-52; Neumann, E. et al. (1996) Biophys. J. 71:868-77; Simon, J. R. (1993) Methods Enzymol. 217:478-83; Suga, M. and Hatakeyama, T. (2003) Curr. Genet. 43:206-11; Thompson, J. R. et al. (1998) Yeast 14:565-71. Они включают в себя комбинацию ацетата лития (LiAc) и дитиотреитола (DTT) в качестве модифицирующих клетки средств, оба из которых использовали для увеличения частоты трансформации дрожжей (Helmuth, M. et al. (2001) Anal. Biochem. 293: 149-52; Thompson, J. R. et al. (1998) Yeast 14:565-71; Gietz, R. D. et al. (1995) Yeast 11:355-60), и включения сорбита и хлорида кальция (Becker, D. M. and Guarente, L. (1991) Methods Enzymol. 194:182-7; Helmuth, M. et al. (2001) Anal. Biochem. 293:149-52; Neumann, E. et al. (1996) Biophys. J. 71:868-77) в буфер для электропорации.

Определения:

Термин «экспрессирующий вектор» обозначает конструкцию ДНК, которая содержит участок автономной репликации (ARS), участок инициации транскрипции и по меньшей мере один структурный ген, кодирующий белок, подлежащий экспрессии в организме-хозяине. Участок репликации, или ориджин репликации, представляет собой любую последовательность ДНК, контролирующую репликацию клонирующих и экспрессирующих векторов. Экспрессирующий вектор обычно содержит также подходящие контрольные области, такие как один или несколько энхансеров и/или промоторов, супрессоров и/или сайленсеров и терминаторов, контролирующих экспрессию белка в дрожжах-хозяевах. Экспрессирующие векторы по настоящему изобретению могут содержать также селективный маркер, содержащий жизненно необходимый ген, как описано в настоящем документе. Экспрессирующий вектор также, необязательно, содержит другие селективные маркеры, широкодоступные и хорошо известные специалистам в данной области. Экспрессирующие векторы представляют собой один тип вектора. Векторы могут, необязательно, содержать одну или несколько последовательностей (элементов) ARS из одного или нескольких штаммов дрожжей.

Термин «функционально связанный» означает, что фрагменты ДНК расположены так, что они функционируют во взаимодействии для их намеченных предназначений, например, транскрипция инициируется на промоторе и продолжается через кодирующий отрезок до терминатора.

Термин «трансформация» означает введение ДНК или других нуклеиновых кислот в клетку-хозяина дрожжей-реципиента, что изменяет генотип.

Термин «трансформант», или «трансформированная клетка» означает клетку-хозяина дрожжей-реципиента, который подвергли трансформации, и его потомство.

Векторы, применимые в способах электропорации по изобретению, включают в себя вектор pYD, любые другие векторы и их производные конструкции, которые можно размножать в клетках дрожжей, или нуклеиновые кислоты в общем. Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может быть основан на любом типе вектора, пока вектор может трансформировать, трансфицировать или трансдуцировать дрожжевую клетку-хозяина. В предпочтительном варианте осуществления экспрессирующий вектор основан на дрожжевой плазмиде, особенно плазмиде из S. cerevisiae. После трансформации клеток дрожжей экзогенная ДНК, кодирующая последовательности библиотеки, поглощается клетками и затем экспрессируется в трансформированных клетках.

Более предпочтительно, экспрессирующий вектор может представлять собой челночный вектор для дрожжей-бактерий, который можно размножать либо в E. coli, либо в дрожжах (Struhl, et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. 76:1035-1039). Включение последовательностей ДНК плазмиды E. coli, такой как pBR322, облегчает количественное получение ДНК вектора в Ε. coli, и таким образом, эффективную трансформацию дрожжей.

Типы дрожжевых плазмидных векторов, которые могут служить челночными, могут представлять собой реплицирующийся вектор или интегрирующий вектор. Реплицирующийся вектор представляет собой дрожжевой вектор, способный опосредовать свое собственное поддержание, независимо от хромосомной ДНК дрожжей, благодаря присутствию функционального ориджина репликации ДНК. Интегрирующий вектор зависит при рекомбинации от хромосомной ДНК для облегчения репликации и таким образом продолжительного поддержания рекомбинантной ДНК в клетке-хозяине. Реплицирующий вектор может представлять собой основанный на плазмиде 2 микронный вектор, в котором ориджин репликации ДНК происходит из эндогенной 2-микронной плазмиды дрожжей. Альтернативно, реплицирующийся вектор может представлять собой автономно реплицирующийся (ARS) вектор, в котором «кажущийся» ориджин репликации происходит из хромосомной ДНК дрожжей. Необязательно, реплицирующийся вектор может представлять собой центромерную (CΕN) плазмиду, несущую, в дополнение к одному из вышеуказанных ориджинов репликации ДНК, последовательность хромосомной ДНК дрожжей, несущую, как известно, центромеру.

Клетки дрожжей можно трансформировать векторами в замкнутой кольцевой форме или в линейной форме. Трансформация дрожжей интегрирующими векторами, хотя и с наследственной стабильностью, может не быть эффективной, когда вектор присутствует в замкнутой кольцевой форме (например, с выходом только приблизительно 1-10 трансформантов на мкг ДНК). Линеаризованные векторы, со свободными концами, локализованными в последовательностях ДНК, гомологичных хромосомной ДНК дрожжей, трансформируют дрожжи с более высокой эффективностью (в 100-1000 раз), и обнаружено, что трансформирующая ДНК, как правило, интегрирует в последовательности, гомологичные участку расщепления. Таким образом, посредством расщепления ДНК вектора подходящей рестрикционной эндонуклеазой, можно увеличить эффективность трансформации и нацелиться на участок интеграции в хромосому. Интегративная трансформация может являться применимой для генетической модификации пивных дрожжей, при условии, что эффективность трансформации является достаточно высокой и последовательность ДНК - мишень для интеграции - лежит внутри области, которая не нарушает генов, необходимых для метаболизма клетки-хозяина.

Плазмиды с ARS, обладающие высоким числом копий (приблизительно 20-50 копий на клетку), обладают тенденцией являться наиболее нестабильными, и теряются с частотой более 10% на поколение. Однако стабильность плазмиды с ARS можно увеличить присоединением центромеры; центромерные плазмиды присутствуют в 1 или 2 копиях на клетку и теряются только приблизительно в 1% на поколение. Неограничивающие примеры белков для экспрессии в дрожжевых клетках-хозяевах с использованием способов электропорации по изобретению включают в себя любые интересующие гены, включая антитела и фрагменты антител, гормоны, цитокины и лимфокины, рецепторы, молекулы адгезии и ферменты.

Штаммы дрожжей, которые можно трансформировать способом электропорации по изобретению, включают в себя виды дрожжей рода Saccharomyces, такие как Saccharomyces cerevisiae и рода Schizosaccharomyces, такие как Schizosaccharomyces Pombe. В одном варианте осуществления клетки дрожжей представляют собой диплоидные клетки дрожжей. Альтернативно, клетки дрожжей представляют собой гаплоидные клетки, такие как «a» и «α» штамм гаплоидных клеток дрожжей.

Изобретение относится к способам трансформации клеток дрожжей, включающим в себя электропорацию суспензии клеток, содержащей дрожжи вместе с одной или несколькими конструкциями нуклеиновой кислоты. Трансформация клеток дрожжей может в результате приводить к чему угодно от отдельного клона до популяции клеток дрожжей (т.е. дрожжевой библиотеки или библиотек), которые можно использовать для скрининга (a) пептида(пептидов) или белка(белков), экспонированных на поверхности клеток дрожжей, посредством прикрепления к белку на поверхности дрожжей или связывания посредством специфической ковалентной связи или нековалентного взаимодействия с белками или другими компонентами на поверхности клеток дрожжей; (b) пептида(пептидов) или белка(белков), экспрессируемых внутри клеток; или (c) пептида(пептидов) или белка(белков), секретируемых во внеклеточное пространство, такое как культуральная среда, или накапливаемых на твердых поверхностях. Такие дрожжевые библиотеки могут поддаваться удобному использованию для множества применений, для скрининга или характеризации взаимодействий пептида(пептидов) или белка(белков) с другим белком, пептидом, ДНК, РНК или другими химическими веществами, которые можно вводить в клетки дрожжей или добавлять экзогенно.