Микрофлюидная система для проведения иммуноанализа

Микрофлюидная система для проведения иммуноанализа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к устройствам для проведения иммуноанализов и может использоваться для лабораторной диагностики вирусных инфекций.

Для лабораторной диагностики вирусных инфекций чаще всего используют методы иммуноферментного, или иммунофлуоресцентного анализа.

Метод иммуноферментного анализа предназначен для выявления антител и основан на использовании специфических вирусных белков - антигенов, выделенных из зараженных клеток, или полученных методами генной инженерии. Вирусные антигены сорбируют на стенках пластиковой ячейки и инкубируют с исследуемой сывороткой крови, содержащей определяемые антитела. После отмывания неспецифично связанных вязавшихся антител в ячейки добавляют вторые по отношению к определяемым антитела, ковалентно связанные с ферментом, обычно пероксидазой или щелочной фосфатазой. Избыток вторых антител отмывают, а количество связавшихся, зависящее от количества противовирусных антител в сыворотке, оценивают по интенсивности ферментативной реакции.

Метод иммунофлуоресцентного анализа применяют для выявления, как антигенов, так и антител. Этот метод основан на использовании реагентов, меченных флюоресцентным красителем. Антитела чаще всего метят флюоресцеин изотиоцианатом. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии. Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа:

- Метод прямой иммунофлюоресценции применяют для выявления антигенов. Он основан на непосредственном определении антигена, связанного с твердой подложкой, при помощи флюоресцентно меченых антител. Реакцию оценивают с помощью флюоресцентного микроскопа.

- Метод непрямой иммунофлюоресценции позволяет выявить антитела к известному антигену. Антиген, сорбированный на твердой подложке, связывается с определяемыми антителами. Комплексы антиген-антитело выявляются с помощью меченых антител к иммуноглобулинам.

- Метод конкурентной иммунофлюоресценции основан на добавлении к исследуемой пробе известной концентрации меченого антигена и проведении реакции с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе.

Микрофлюидные технологии - одна из новых, быстро развивающихся областей конвергенции наук и технологий, основанная на интеграции высокотехнологичных и наукоемких методов микросистемотехники, электроники, физики, химии, оптики и гидравлики, молекулярной и клеточной биологии, информатики и других наук.

Основное достоинство микрофлюидных технологий состоит в том, что они позволяют работать с предельно малыми объемами реагентов - 10^-9-10^-15 литров и пикограммами веществ. Рассматриваемые рабочие среды могут представлять собой жидкости различной природы, содержащие нерастворимые микро- и наночастицы, полимерные молекулы, клеточные суспензии, эмульсии, состоящие из мицелл, капель неперемешивающихся жидкостей или воздушных пузырьков и др.

Для микрофлюидных систем характерны экстремально большие соотношения «поверхность/объем» и высокие скорости массо- и теплопереноса, что делает их исключительно эффективными для интенсификации протекания целевых процессов.

Ряд базовых характеристик микрофлюидных технологий делают их исключительно ценными и перспективными для решения широкого круга фундаментальных и прикладных задач:

- микрофлюидные технологии оперируют микро/фемто объемами анализируемых жидкостей;

- течение жидкости в микрофлюидных каналах является ламинарным, в силу этого возможен точный расчет транспортируемых масс веществ к различным точкам микрофлюидной системы в зависимости от геометрии каналов, распределения давления, свойств жидкости;

- в силу ламинарности смешивание потоков жидкостей осуществляется в результате диффузии;

- ламинарность потоков и диффузия в комбинации могут обеспечивать создание градиентов веществ в микрофлюидных системах;

- в микрофлюидной системе увеличивается отношение поверхности к объему, что создает оптимальные условия для диффузии и теплового обмена;

- капиллярные системы позволяют реализовать на микроуровне важнейшие транспортные методы современной аналитической химии: проточно-инжекционный анализ, основанный на разнице в давлениях, и высокоэффективный капиллярный электрофорез;

- уникальные возможности создания микроканалов сложной конфигурации, встраивания различных типов микрореакторов, управления микропотоками позволяют реализовать сложные многостадийные аналитические реакции;

- высокочувствительные системы детектирования результатов анализа например, флуоресцентные микроскопия и спектроскопия дают возможность обнаружения искомых компонентов на уровне следовых количеств (вплоть до единичных молекул);

- объемы жидкостей, которыми способны оперировать микрофлюидные устройства, сопоставимы с размерами клеток или на порядки меньше их.

Микрофлюидные системы представляют собой интегрированные устройства - лаборатории на чипах, образованные системой каналов с ламинарным течением жидкостей, что создает оптимальные и легко контролируемые условия для протекания транспортных и диффузионных процессов; функционирования бактериальных и эукариотических клеток; протекания молекулярно-биологических, молекулярно-генетических, биохимических, химических реакций.

Реакция свободной иммунодиффузии в микрофлюидных системах предназначена для выявления в исследуемых жидкостях антител или антигенов и основана на том, что в процессе взаимодействия антигена с антителом происходит образование комплекса антиген-антитело, в результате чего происходит существенное изменение размеров анализируемых частиц. Размеры конъюгатов антигена и флуоресцентного красителя значительно меньше размеров образующегося комплекса антиген - антитело. Увеличение размеров частицы приводит к изменению скорости диффузии. Изменение скорости диффузии меченых частиц в каналах микрофлюидной системы можно оценить по расстоянию, пройденному красителем в канале. Современные методы детекции позволяют определять характеристики процесса диффузии флуоресцентно-меченых частиц. Метод ограничен по способности определять антигены в силу сравнимости размеров образуемых комплексов и антител.

Известна микрофлюидная система в форме микрофлюидного чипа для быстрого множественного иммуноферментного твердофазного анализа, который представляет собой иммобилизованные антигены в одном или множестве каналов [Заявка США №20090123336, МПК: B01J 19/00, B01J 019/00; G01N 33/00]. Каждый канал включает секцию извилистого пути или множество секций извилистого пути. Рецептор для детектирования анализируемого вещества может быть закреплен в различных секциях извилистого пути, например с помощью адсорбции. Различные рецепторы могут быть иммобилизованы в различных секциях извилистого пути каждого канала или в различных каналах для одновременного детектирования множества анализируемых веществ. Этот чип является особенно полезным для проведения иммуноферментного твердофазного анализа.

Известна также микрофлюидная система в форме микрофлюидного чипа для детектирования присутствия анализируемого вещества в пробе жидкости, представляющий собой монолит и канал в этом монолите. Проток в канале имеет направление между входом и выходом и включает по крайней мере одну секцию извилистого пути [Патент США №8075854 МПК G01N 30/00]. У этого чипа секция извилистого пути включает рецептор, который комплементарен веществу, наличие которого будет тестироваться.

Эта микрофлюидная система принята за прототип изобретения.

Ее недостатком является необходимость проводить отмывку - удалять из канала несвязавшееся с рецептором анализируемое вещество.

Изобретение решает задачу создания системы для определения субстрата, способной осуществлять и тестировать реакцию между субстратом и рецептором, без иммобилизации рецептора и последующей отмывки.

Поставленная задача решается тем, что предлагается микрофлюидная система, включающая канал для анализируемой жидкости, отличающаяся тем, что она также содержит четыре канала, расположенных перпендикулярно к каналу для анализируемой жидкости, и одним концом соединяющихся с ним, при этом один из этих каналов является измерительным и в него помещены рецепторы в жидкой среде, другой канал является опорным и содержит жидкую среду, а в два других канала помещены флуоресцентные метки с иммобилизованным на них субстратом в жидкой среде.

Каналы системы выполнены в монолите.

Каналы закрыты со второго конца, который не соединяется с каналом для анализируемой жидкости.

Каналы, перпендикулярные каналу с анализируемой жидкостью, имеют одинаковые размеры.

Измерительный и опорный каналы содержат одинаковую жидкую среду.

Жидкой средой, как правило, является буферный раствор.

Флуоресцентные метки могут иметь форму квантовых точек.

На рис.1 приведена схема предлагаемой микрофлюидной системы в исходном положении до начала анализа, где: 1 - измерительный канал, 2 - опорный канал, 3 - канал с флуоресцентными метками, 4 канал с канал с флуоресцентными метками, 5 - канал с анализируемой жидкостью, 6 - рецепторы, 7 - флуоресцентная метка, 8 - субстрат.

На рис.2 приведена схема предлагаемой микрофлюидной системы в конечном положении после проведения анализа, где: 9 - комплексы субстрата с рецепторами, L - расстояние от канала 5, где измеряется интенствность флуоресценции.

На рис.3 приведены кривые роста интенсивности флуоресценции в системе при проведении анализа, описанного в примере.

Как показано на рис.1 и 2, предлагаемая система имеет 5 каналов. Канал 1 является измерительным и в исходном состоянии, в него помещены рецепторы 6 в жидкой среде. Соседний с ним канал 2 является опорным и он заполнен такой же жидкой средой, как канал 1, но в исходном состоянии он не содержит никаких частиц, в том числе, рецепторов. Два других канала 3 и 4 расположены напротив измерительного и опорного каналов. Эти каналы в исходном состоянии содержат флуоресцентные метки 7 с иммобилизованным на них субстратом 8. Их размер больше, чем размер субстрата и размера рецептора. Центральный канал 5 расположен перпендикулярно каналам 1, 2, 3, и 4 и сообщается с каждым из них. Канал 5 предназначен для анализируемой жидкости.

Анализ осуществляют в следующем порядке.

Каналы 1, 2, 3, 4 заполняют жидкостью, например буферным раствором, при этом в канал 1 помещают рецепторы 6, а в каналы 3 и 4 помещают флуоресцентные метки 7 с иммобилизованным на них субстратом. Флуоресцентные метки представляют собой, например, квантовые точки с иммобилизованными на их поверхности антигенами. Размеры антигенов существенно меньше размеров специфических к ним антител и размеров флуоресцентных меток. В канал 5 подают анализируемую жидкость, которая содержит субстрат 8. Ширина и глубина каналов может варьировать от 10 мкм до 1 мм, наиболее предпочтительные размеры - менее 500 мкм по ширине. Подача реагентов осуществляется стандартными шприцами или другим способом, для продвижения жидкости может быть использован любой способ: давление, гравитация, капиллярные силы или другие.

После того, как канал 5 заполнен анализируемой жидкостью, ее подачу прекращают. В стационарных условиях начинается процесс диффузии из канала 5 субстрата 8 в каналы 1, 2, 3 и 4 и процесс диффузии меток 7 из каналов 3 и 4 через канал 5 в каналы 1 и 2 соответственно. При этом коэффициент диффузии субстрата в каналах существенно больше коэффициента диффузии меток. В канале 1 образуются комплексы субстрата 8 и рецепторов 6, в результате чего количество свободных рецепторов в канале 1 уменьшается.

Флуоресцентные метки 7 в процессе диффузии попадают в канал 5, а затем в канал 1 и 2 и часть из них образуют комплексы с оставшимися свободными рецепторами 6, т.к. метки представляют собой комплекс флуоресцентной частицы с иммобилизованным на поверхности субстратом. При этом коэффициент диффузии образующихся комплексов существенно меньше коэффициента диффузии меток. Наличие в канале 5 субстрата определяется по разности интенсивности флюоресценции на расстоянии L в каналах 1 и 2. Скорость нарастания интенсивности зависит от соотношения количества флуоресцентных меток и образовавшихся комплексов меток с рецепторами. Нарастание интенсивности в канале 2 на расстоянии L дает нормировочный коэффициент для определения наличия антигенов при условии одинаковой концентрации меток в каналах 3 и 4.

В основе работы этой системы лежит изменение скорости диффузии флуоресцентных нанокомплексов по сравнению со скоростью диффузии флуоресцентных меток в каналах микрофлюидной системы. Как известно из источников информации, реакция свободной иммунодиффузии предназначена для определения наличия в анализируемой жидкости только частиц, размеры которых существенно больше используемых флуоресцентных меток. Изменение скорости диффузии основано на увеличении стоксова радиуса при образовании флуоресцентных нанокомплексов при взаимодействии больших анализируемых частиц с маленькими метками. Это ограничивает возможность определения наличия в анализируемой жидкости частиц маленького размера из-за практически неизменного стоксового радиуса при взаимодействии больших меток с маленькими анализируемыми частицами.

Работа предлагаемой системы основана на связывании стандартного меченого (иммобилизованного на поверхности флуоресцентной метки) и присутствующего в исследуемой пробе жидкости немеченого субстрата с рецептором в канале 1. Поскольку меченый и немеченый субстрат конкурируют за связывание с рецептором, по скорости диффузии флуоресцентного комплекса в канале 1 можно определить наличие в канале 5 конкурирующего субстрата. В случае отсутствия в канале 5 конкурирующего субстрата интенсивность флуоресценции, формирующаяся в каналах 1 и 2 на расстоянии L от пересечения с каналом 5 за счет диффузии флуоресцентных комплексов, будет различаться через время t. Это различие обусловлено увеличением стоксова радиуса флуоресцентного комплекса за счет связывания с рецептором, находящимся в канале 1. В случае, когда в канале 5 присутствует субстрат (немеченые частицы маленького размера) весь (или частично) рецептор из канала 1 связывается с ним до того как в канал 1 диффундируют флуоресцентные комплексы из канала 3. Таким образом, для связывания с флуоресцентным комплексом свободных рецепторов не остается, а скорость диффузии флуоресцентных комплексов в каналах 1 и 2 становится одинаковой. В результате интенсивность флуоресценции, формирующаяся в каналах 1 и 2 на расстоянии L от пересечения с каналом 5 за счет диффузии флуоресцентных комплексов, будет одинакова через время t.

Измеряя интенсивность флуоресценции в каналах 1 и 2 на расстоянии L за время t и нормируя интенсивность флюоресценции в канале 1 на интенсивность флюоресценции в канале 2 можно определить наличие субстрата в исследуемой жидкости.

Измерение интенсивности флюоресценции осуществляют в отсутствие движения жидкости в системе.

Возможна нормировка системы для количественного определения субстрата в анализируемой жидкости, однако, на практике достаточно провести качественный анализ, чтобы определить наличие или отсутствие заболевания.

Таким образом, предлагаемая микрофлюидная система для определения субстрата, способна осуществлять и тестировать реакцию между субстратом и рецептором без иммобилизации рецептора и последующей отмывки, что существенно облегчает проведение анализов.

Кроме прочего, система позволяет проводить анализы, когда размеры антигенов существенно меньше размеров специфических к ним антител и размеров флуоресцентных меток.

Пример

Флуоресцентные метки представляют собой квантовые точки Qdots 625 с иммобилизованным на их поверхности белком p24 HIV - антигена вируса иммунодифицита человека. В каналы 3 и 4 микрофлюидной системы помещают флуоресцентные метки.

В канал 1 помещают антитела к белку р24 HIV, канал 2 оставляют заполненным буферным раствором TBS (50 мМ ТРИС, 0,9% NaCl, pН 7.2). В канал 5 подают анализируемую жидкость - белок р24 HIV в концентрации 0,08 мг/мл в буферном растворе.

Для регистрации сигнала систему позиционируют на предметном столике инвертированного флуоресцентного микроскопа и осуществляют покадровую съемку процесса диффузии в каналах 1 и 2 на расстоянии 3 мм от пересечения каналов 1 и 2 с каналом 5.

На рис.3 показан график интенсивности флуоресцентного сигнала по результатам покадровой съемки в зависимости от времени после подачи в систему анализируемой жидкости. Кривая 1 показывает рост интенсивности сигнала в опорном канале 2, а кривая 2 показывает рост интенсивности сигнала в измерительном канале 1. Рост интенсивности флуоресценции свидетельствует о наличи в тестируемом образце жидкости белка р24 HIV.

1. Микрофлюидная система, включающая канал для анализируемой жидкости, отличающаяся тем, что она также содержит четыре канала, расположенных перпендикулярно каналу для анализируемой жидкости и одним концом сообщающихся с ним, при этом один из этих каналов является измерительным и в него помещены рецепторы в жидкой среде, другой канал является опорным и содержит только жидкую среду, а в два других канала помещены флуоресцентные метки с иммобилизованным на них субстратом в жидкой среде.

2. Микрофлюидная система по п.1, отличающаяся тем, что каналы выполнены в монолите.

3. Микрофлюидная система по п.1, отличающаяся тем, что каналы закрыты со второго конца.

4. Микрофлюидная система по п.1, отличающаяся тем, что каналы, перпендикулярные каналу с анализируемой жидкостью, имеют одинаковые размеры.

5. Микрофлюидная система по п.1, отличающаяся тем, что измерительный и опорный каналы содержат одинаковую жидкую среду.

6. Микрофлюидная система по п.1, отличающаяся тем, что жидкой средой является буферный раствор.

7. Микрофлюидная система по п.1, отличающаяся тем, что флуоресцентные метки имеют форму квантовых точек.