Клеточный продукт для лечения и коррекции печеночной недостаточности

Клеточный продукт для лечения и коррекции печеночной недостаточности

Реферат

Изобретение относится к области регенеративной медицины и клеточных технологий, в частности, к получению клеточных продуктов, компенсирующих функциональную недостаточность печени, и может быть использовано в экстракорпоральных системах детоксикации (биоискусственная печень), а также при непосредственной трансплантации пациентам в заместительной клеточной терапии широкого спектра острых и хронических патологий печени, в том числе для лечения циррозов, острой и хронической печеночной недостаточности, возникающей вследствие вирусных, химических, медикаментозных и иных повреждений печени, а также для восстановления генетических дефектов тканей и органов энтодермального происхождения.

Сложность терапии патологий печени и недостаток донорских органов обуславливают поиск новых альтернативных способов лечения. По данным статистики в Российской Федерации количество пациентов с различными хроническими и острыми заболеваниями печени превосходит 200000 человек в год. Несмотря на достижения современной медицины, лечение хронических и острых патологий печени с использованием стандартных терапевтических приемов оказывается недостаточным, смертность сохраняется на уровне 80-90%. В то же время методики экстракорпоральной детоксикации несовершенны, а системы для восполнения синтетической функции печени практически не разработаны.

В связи с дефицитом донорских органов, необходимых для трансплантации печени, а также недостаточной эффективностью и ограниченными возможностями традиционных методов экстракорпоральной детоксикации наибольший интерес в настоящее время представляют клеточные технологии, позволяющие возместить дисфункцию печени посредством инъекции пациенту и/или перфузии регенеративных клеток ex vivo.

Большое количество накопленных за последние годы данных свидетельствует, что эффективность замещения дефектов тканей и восполнения детоксикационных и синтетических функций поврежденной печени главным образом зависят от используемого в клеточных продуктах типа клеток. Получение в достаточном количестве терминально дифференцированных и функционально активных клеток представляет собой ключевую и первостепенную задачу современной клеточной биологии.

Известен биотрансплантат для лечения хронических диффузных заболеваний печени, цирроза печени и портальной гипертензии, содержащий в физиологическом растворе суспензию смешанной популяции клеток, выделенной из фетальных тканей человека, в которой 40% составляют стволовые клетки, включая стромальные мезенхимные и печеночные бипотентные стволовые клетки, а остальные 60% -прогениторные клетки в различной стадии дифференциации, включая молодые незрелые гепатобласты и клетки-предшественники эритроидного ряда, гемопоэтические клетки, при этом смешанная популяция клеток биотрансплантата характеризуется экспрессией следующих поверхностных маркеров: CD13, CD29, CD44, CD90, CD117 (c-Kit) и отсутствием экспрессии CD34 (RU №2368384, A61K 35/407, опубл. 27.09.2009).

Недостаток известного биотрансплантата заключается в том, что источником клеток являются фетальные ткани человека, получение которых сопряжено с разрушением эмбрионов. Этические проблемы и мораторий на использование человеческих эмбрионов в качестве донорского материала исключает возможность широкого использования указанного биотрансплантата в клинической практике. Кроме того, известный биотрансплантат не обеспечивает эффективную нормализацию показателей функции печени при острой печеночной недостаточности, т.к. не предназначен для использования в аппаратах «искусственная печень».

Из патента RU 2272638 известен биотрансплантат для лечения хронического гепатита и цирроза печени, который, по одному из вариантов, характеризуется тем, что содержит культуру фетальных гепатоцитов человека из печени эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности, селективно размноженных в условиях культивирования, и представляет собой суспензию клеточной культуры в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн клеток на 1 кг веса пациента. Биотрансплантат по второму варианту исполнения характеризуется тем, что он содержит мезенхимные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала путем дезагрегации ткани с последующим культивированием на ростовой среде, содержащей трансферрин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления гомогенной клеточной культуры с содержанием агрекан- и коллаген II экспрессирующих клеток не менее 80%, и представляет собой суспензию указанных клеток в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн клеток на 1 кг веса пациента (RU №2272638, A61K 35/407, опубл. 27.03.2006).

Однако известный биотрансплантат не обладает достаточной терапевтической эффективностью, поскольку входящие в него клеточные компоненты неспособны дифференцироваться при трансплантации в гепатоцитоподобные клетки. В случае использования клеток фетальной ткани существуют морально-этические ограничения и высокий риск злокачественной трансформации эмбриональных клеток. Кроме того, известный биотрансплантат не обеспечивает эффективную нормализацию показателей функции печени при острой печеночной недостаточности, т.к. не предназначен для использования в аппаратах «искусственная печень».

Известен биологический материал В.Е.Рябинина для искусственной печени, который содержит лиофилизированный цитозоль с микросомальной и митохондриальной фракциями печени, суспендированный в дистиллированной воде. Материал используется в качестве экстракорпоральной "искусственной печени", которая временно и частично обеспечивает обменные процессы между материалом для искусственной печени и кровью пациента с острой печеночной недостаточностью (RU №2135194, A61K 35/407, опубл. 27.08.1999).

Недостатком аналога является то, что лиофилизированный цитозоль с микросомальной и митохондриальной фракциями печени позволяет лишь временно восполнить детоксикационную функцию печени, но неспособен к восполнению синтетических функций печени, в связи с чем известный аналог не обладает достаточной терапевтической эффективностью и непригоден для лечения и коррекции хронической печеночной недостаточности.

Также известна биоискусственная печень для экстракорпоральной системы очистки, характеризующаяся тем, что содержит живые гепатоциты свиньи или человека на коллагеновом микроносителе (US6858146, A61F 2/02, опубл. 22.02.2005).

Однако известная биоискусственная печень может вызвать серьезную реакцию иммунной системы пациента (от аллергии до анафилактического шока), поскольку содержит гепатоциты свиньи, синтезирующие ксеногенные белки. Помимо этого использование тканей животных может нести риск заражения ксеногенными инфекционными заболеваниями. В случае использования гепатоцитов человека возникает проблема недостатка донорской печени, а также невозможность использования гепатоцитов в аутологичном варианте, так как пациент с печеночной недостаточностью не может быть донором. Кроме того, известная биоискусственная печень не предназначена для лечения и коррекции хронической печеночной недостаточности.

Наиболее близким аналогом является трансплантат для лечения печеночной недостаточности, включающий гетерогенный биосовместимый биодеградируемый гель на основе коллагена, имеющий общий объем не менее 0,1 мл и наименьший линейный размер не менее 0,2 мм, размеры пор 30-500 мкм, суммарную пористость 50-98%, посаженные на него аутологичные прогениторные клетки костного мозга после их культивирования in vitro и культивированные аутологичные клетки печени, причем концентрация клеток печени и костного мозга 2×10⁶-15×10⁶ клеток на 1 см³ гетерогенного геля и соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4 (RU №2425645, А61В 17/00, опубл. 10.08.2011).

Однако ближайший аналог не обладает достаточной терапевтической эффективностью, поскольку введение гепатоцитов позволяет только временно улучшить функцию печени, не влияя существенным образом на процессы репарации поврежденной печеночной паренхимы. Помимо этого взятие биоптатов костного мозга и печени - травматичная и болезненная процедура, которую не всегда можно провести пациенту с печеночной недостаточностью. Кроме того, известный клеточный продукт не обеспечивает эффективную нормализацию показателей функции печени при острой печеночной недостаточности, т.к. не предназначен для использования в аппаратах «искусственная печень».

Задачей изобретения является разработка клеточного продукта на основе стволовых клеток взрослого человека, который позволит обеспечить эффективное восполнение недостатка синтетической и детоксикационной функций печени при острой и хронической печеночной недостаточности при его использовании как в аппаратах типа «искусственная печень», так и при непосредственной трансплантации в поврежденную печень.

Еще одной задачей является получение стволовых клеток человека из легкодоступного источника, способных к терминальным стадиям гепатоцитарной дифференцировки и поддержанию дифференцированного состояния в течение длительного периода времени при использовании клеточного продукта in vivo (при введении в организм) или ex vivo (в экстракорпоральной печени).

Технический результат изобретения заключается в расширении спектра действия и повышении функциональной и репаративной активности клеточного продукта для лечения и коррекции печеночной недостаточности.

Технический результат достигается за счет используемой популяции протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, способной дифференцироваться в составе клеточного продукта в функционально активные гепатоцитоподобные клетки, что позволяет нормализовать функции печени при острой или хронической печеночной недостаточности и в свою очередь повышает эффективность использования заявленного клеточного продукта для регенерации и детоксикации пораженной печени как in vivo (при трансплантации в организм), так и ех vivo (в экстракорпоральной печени).

Все указанное позволит повысить качество лечения дефектов печени различной этиологии, сократить сроки лечения и риски возникновения осложнений за счет длительного и адекватного улучшения функциональной и репаративной активности клеток.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Клеточный продукт для лечения и коррекции печеночной недостаточности содержит стволовые клетки взрослого человека в коллагеновом геле и отличается тем, что из стволовых клеток он содержит популяцию протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, обработанных вальпроевой кислотой в концентрации 0,1-40 мМ и культивированных в коллагеновом геле, при этом стволовые клетки характеризуются фенотипом CD49f+/EpCAM+ и в процессе обработки вальпроевой кислотой и культивирования в коллагеновом геле изменяют профиль экспрессии на 1AAT+/PEPCK+/G6P+/TDO+/CYP Р4503А13+, а также приобретают способность синтезировать мочевину и альбумин.

Источником исходных стволовых клеток служит подчелюстная слюнная железа взрослого донора, в том числе для аутологичной или аллогенной трансплантации. Взятие клеточного материала может быть проведено легко, без последствий для донора и не связано с этическими проблемами, которые возникают при использовании эмбриональных клеток и различных фетальных тканей.

Из уровня техники известно, что энтодермальные протоковые стволовые клетки подчелюстной слюнной железы человека и функционально активные клетки печени принадлежат к одному и тому же зародышевому листку и поэтому могут служить источником стволовых клеток для лечения паренхимных органов. Так, известен способ получения протоковых стволовых клеток из подчелюстной слюнной железы для лечения дисфункций печени (US №7659121, C12N 5/00, опубл. 09.02.2010).

Согласно данному методу из слюнной подчелюстной железы человека выделяют стволовые клетки, позитивные по CD49f, которые в процессе дифференциации в гепатоцитарном направлении экспрессируют маркеры HNF-3α, альфа-фетопротеин и альбумин. Предполагается, что полученная популяция клеток способна восстанавливать дефекты тканей печени при трансплантации пациенту.

Однако получить полноценно функционально активные гепатоцитоподобные клетки из этой популяции так и не удалось из-за неустойчивой индукции дифференцировки исходной популяции стволовых клеток в гепатоцитарном направлении.

Изобретательский уровень настоящего изобретения обеспечивается тем, что из протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы была выделена уникальная популяция стволовых клеток, экспрессирующая маркеры CD49f (маркер протоковых клеток) и EpCAM (маркер адгезии эпителиальных клеток), которая достоверно способна к дифференцировке в гепатоцитоподобные клетки с высокой биологической активностью. Обработка вальпроевой кислотой приводит к трансформации клеток в менее дифференцированное состояние и позволяет приблизить их к общему с гепатоцитами клеточному предшественнику. При этом, как было впервые установлено заявителем на моделях in vitro, повышается уровень экспрессии гена Tbx3, необходимого для гепатоцитарной дифференцировки, что обеспечивает упрощение и ускорение процессов последующей трансдифференцировки в гепатоцитарном направлении. Входящий в состав клеточного продукта коллагеновый гель обеспечивает пространственную 3-D ориентацию и приближает клетки к состоянию in vivo, при которых указанная популяция клеток за короткий срок наиболее эффективно дифференцируются до функционально активных гепатоцитоподобных клеток. Кроме того, в заявленном клеточном продукте культивированные в коллагеновом геле клетки способны сохранять дифференцированное состояние и высокую синтетическую и детоксикационную активность в течение длительного периода времени, что обеспечивает эффективность использования клеточного продукта in vivo (при введении в организм) или ex vivo (в экстракорпоральной печени).

Для изготовления клеточного продукта по изобретению предпочтительно используют коллаген I типа, который является основным компонентом межклеточного матрикса печени. При этом предпочтительная концентрация коллагена в геле составляет 3-6%, а исходная концентрация стволовых клеток предпочтительно равна 10⁶-10⁷ клеток на 1 см³ геля.

Клеточный продукт по изобретению имеет несколько различных вариантов возможного использования. Так, заявленный клеточный продукт может найти применение при прямой трансплантации в организм пациента в качестве средства заместительной клеточной терапии для восстановления дефектов тканей печени, стимуляции регенерации, восполнения недостаточности функций гепатоцитов и устранения фиброзных осложнений.

Благодаря своей структуре и консистенции клеточный продукт по изобретению не отторгается организмом при трансплантации и не подвергается инкапсуляции в фиброзную капсулу. Выделяемые клетками факторы роста способствуют прорастанию кровеносных сосудов внутрь трансплантата, а структура продукта не препятствует этому процессу. Благодаря этому клетки в составе трансплантата сохраняют жизнеспособность и свои функции. Вследствие того, что клетки в составе трансплантата находятся в 3D условиях, им не нужно время для адаптации к условиям организма и они могут выполнять синтетические и детоксикационные функции сразу после трансплантации. Клеточный продукт помимо этого также активно синтезирует широкий спектр биологически активных веществ, в том числе фактор роста нервов, эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия и др., что может оказывать стимулирующее действие на собственные клетки реципиента.

Другим возможным вариантом использования клеточного продукта для коррекции и лечения печеночной недостаточности является его применение в экстракорпоральной системе «биоискусственная печень», через которую перфузируется кровь реципиента с пораженной печенью. При быстро развивающейся недостаточности печени заявленный клеточный продукт способен обеспечить стабильность состояния пациента и стимулировать эндогенную регенерацию печени, тем самым позволяя избежать трансплантации донорской печени.

Клеточный продукт по изобретению может быть использован для лечения хронических и острых гепатитов и циррозов печени, развившихся вследствие гепатотропных вирусов (вирусы гепатита B, C, D, G, F, TTV, CMV, EBV), токсического фактора (алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.), метаболических нарушений (гемохроматоз, болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность α1-антитрипсина, гликогеноз IV типа, галактоземия, наследственный тирозиноз, наследственные гипербилирубинемии), аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит) и многих других факторов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение клеточного продукта для лечения и коррекции печеночной недостаточности.

Технология получения клеточного продукта по изобретению предполагает реализацию нескольких этапов, а именно этапа получения популяции энтодермальных стволовых клеток, этапа обработки клеток вальпроевой кислотой и этапа культивирования клеток в коллагеновом геле.

Этап 1. Получение популяции энтодермальных стволовых клеток из подчелюстной слюнной железы.

Донорскую ткань (часть подчелюстной слюнной железы размером 0,5-2 см³) переносят в стерильную пробирку со средой DMEM/F12 и гентамицином (40 мкг/мл). Начиная с этого момента работают в стерильных условиях, отвечающих требованиям GMP (Good Manufacturing Practice). После удаления фиброзной капсулы и кровеносных сосудов ткань измельчают, дважды промывают фосфатно-солевым буфером (DPBS), осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 0,8 тыс. об/мин, инкубируют ткань с 4 мг/мл коллагеназы IV типа (всего - 1 мл на 0,5 см³ ткани) в среде DMEM/F12 60 минут при 37°С.

Затем к клеткам добавляют 10 мл полной ростовой среды, содержащей DMEM/F12 1:1, эмбриональную телячью сыворотку (7-20%, оптимально 10%); + глутамин (2 мМ); + 1х инсулин-трансферрин-селенит (ITS) и эпидермальный фактор роста (EGF) (5-80 нг/мл, оптимально 10-20 нг/мл). Взвесь клеток активно пипетируют в течение 5 минут, затем пропускают через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40-100 мкм и осаждают клетки центрифугированием в течение 2 мин при 0,8 тыс. об/мин.

Далее проводят магнитную сепарацию по маркерам CD49f и EpCAM, для чего полученную суспензию клеток ресуспендируют в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера, инкубируют с первыми антителами (anti-human CD49f и anti-human EpCAM) в течение 30 минут при 4°С, концентрация антител - 1 мкг/10⁶ клеток. Промывают 5 мл фосфатно-солевого буфера и инкубируют с вторыми антителами (коньюгированными с магнитными частицами) в течение 20 минут, далее проводят магнитную сепарацию на колонках по инструкциям производителя. Отсортированные клетки осаждают центрифугированием (5 минут при 300 g), ресуспендируют в полной ростовой среде, подсчитывают. Рассаживают на покрытые коллагеном I типа культуральные чашки из расчета 5×10³ клеток на см². Клетки культивируют при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂.

Этап 2. Обработка клеток вальпроевой кислотой.

При достижении нужного количества клеток (5×10⁷-10⁸) их подвергают воздействию 0,1-40 мМ (оптимально 1 мМ) вальпроевой кислоты в течение 4-6 дней (оптимально 5 дней).

Этап 3. Культивирование клеток в коллагеновом геле.

Коллаген типа I (Sigma) растворяют в стерильной 0.1% уксусной кислоте в концентрации 5 мг/мл.

Клетки после обработки вальпроевой кислотой снимают трипсином и разводят в фосфатно-солевом буфере. В отдельную пробирку добавляют стерильные компоненты в следующей очередности: 0.34 М NaOH (Sigma) до конечной концентрации 0.023 мМ, 7.5% Na₂CO₃ (ПанЭко) до конечной концентрации 0.26%, 10× DMEM (Sigma) до конечной концентрации 1%, глутамин (Gibco) до конечной концентрации 2 мМ, 100× HEPES (Gibco) до конечной концентрации 1%, эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота (HyClone) до конечной концентрации 10%. Затем добавляют раствор коллагена в уксусной кислоте до конечной концентрации коллагена 4%. После этого 2-3 раза перемешивают и добавляют клетки в фосфатно-солевом буфере исходя из расчета, что конечная концентрация клеток 10⁶-10⁷ клеток на 1 см³ геля.

Помещают гель с клетками в чашки Петри и инкубируют в CO₂-инкубаторе при 37°C в течение 30 минут до полного застывания. После полимеризации геля в чашки добавляют эквивалентный объем полной ростовой среды, клетки в геле культивируют в течение 10 суток в CO₂-инкубаторе в стандартных условиях, среду меняют каждые 2 дня. После 10 дней инкубации клеток в геле клеточный продукт готов к использованию.

Исследование профиля экспрессии и уровня синтеза белков в полученном клеточном продукте в сравнении с гепатоцитами показывает, что исходная популяция клеток в составе клеточного продукта изменяет профиль экспрессии: в них возрастает экспрессия 1AAT, PEPCK, G6P, TDO, CYP P4503A13, что характерно для гепатоцитов. Уровень синтеза мочевины и альбумина клетками слюнной железы в геле достигает уровня синтеза этих веществ гепатоцитами в аналогичных условиях.

Пример 2. Оценка эффективности клеточного продукта для восполнения синтетической функции печени при трансплантации.

Полученный по примеру 1 клеточный продукт трансплантируют самцам мышей C57Black, имеющим хроническую патологию печени, вызванную воздействием четыреххлористого углерода.

Клеточный продукт с размером 0,3 мм³ трансплантируют животным опытной группы в паренхиму печени (по 2 трансплантации на одно животное). В качестве контроля используют гель без клеток аналогичного размера, который трансплантируют животным контрольной группы.

В течение последующих 4 недель измеряют биохимические показатели крови опытной и контрольной групп животных. Результаты исследования представлены в табл.1.

Табл.1
Биохимический анализ крови мышей при трансплантации клеточного продукта
Дни после транспланта-ции	Биохимический маркер	Интактные мыши без патологии печени (контроль)	Мыши с патологией печени после трансплантации геля без клеток (контроль)	Мыши с патологией печени после трансплантации клеточного продукта
0	Билирубин, мкМ	21	204	210
Альбумин, г/л	52	23	24
Мочевина, мМ	8,0	3,0	3,2
5	Билирубин, мкМ	20,5	200	115
Альбумин, г/л	51	25	31
Мочевина, мМ	7,4	3,1	4,5
10	Билирубин, мкМ	22	186	98
Альбумин, г/л	51	31	45
Мочевина, мМ	7,8	3,3	6,0
15	Билирубин, мкМ	21,5	177	64
Альбумин, г/л	53	35	48
Мочевина, мМ	8,0	3,7	6,8
20	Билирубин, мкМ	23	154	58
Альбумин, г/л	52	35	50
Мочевина, мМ	7,9	3,6	7,0
25	Билирубин, мкМ	21	135	53
Альбумин, г/л	52	36	52
Мочевина, мМ	8,0	3,8	7,0
30	Билирубин, мкМ	22	110	54
Альбумин, г/л	53	36	51
Мочевина, мМ	8,1	4,0	7,0

В результате исследования установлено, что в контрольной группе животных наблюдалось значительное увеличение количества билирубина в крови, содержание мочевины и альбумина было пониженным по сравнению с нормальным значением. В течение 4 недель наблюдения биохимические показатели крови животных контрольной группы стабильно улучшались: содержание билирубина снижалось с 204 мкМ и составило в итоге 110 мкМ. В опытной группе снижение концентрации билирубина в крови было более выраженным, концентрация билирубина составила около 54 мкМ к концу наблюдения, что говорит об активной детоксикационной функции введенного препарата. Концентрация мочевины составила около 4 мМ для контрольной группы животных к концу наблюдения и 7 мМ для опытной группы, в то время как у мышей с неповрежденной печенью концентрация мочевины составляет 8 мМ.

Таким образом, клеточный продукт по изобретению способен восполнять недостаточность синтетической функции на уровне гепатоцитов.

Пример 3. Оценка эффективности клеточного продукта для экстракорпоральной детоксикации.

Для оценки эффективности полученного по примеру 1 клеточного продукта для экстракорпоральной детоксикации берут сыворотку крови от самцов крыс с патологией печени и пропускают ее через колонку с клеточным продуктом со скоростью 2 мл/мин в CO₂ инкубаторе при 37°C и 5% CO₂.

В качестве контроля 1 используют сыворотку крови до пропускания через клеточный продукт. В качестве контроля 2 используют гель без клеток.

Результаты эксперимента по детоксикации представлены в табл.2.

Табл.2
Биохимический анализ сыворотки крови крыс после пропускания через клеточный продукт in vitro
Биохимический маркер	Сыворотка крови крыс с патологией печени до пропускания (контроль 1)	Сыворотка крови крыс с патологией печени после пропускания через гель без клеток (контроль 2)	Сыворотка крови крыс с патологией печени после пропускания через клеточный продукт (опытная группа)
Билирубин, мкМ	175	175	95
Альбумин, г/л	24	25	54
Мочевина, мМ	3,1	3,0	6,0

Как видно из табл.2, после пропускания сыворотки крови через гель без клеток значительного изменения биохимических показателей тестируемых образцов (в сравнении с контролем 1) замечено не было. Показатели альбумина билирубина и мочевины колебались вокруг изначального значения (около 25 г/л, 175 мкМ и 3 мМ соответственно). В то время как в опытной группе наблюдались изменения биохимических показателей крови: 54 г/л альбумина, 95 мкМ билирубина и 6 мМ мочевины, что свидетельствует об эффективности клеточного продукта для использования в аппаратах экстракорпоральной печени.

Клеточный продукт для лечения и коррекции печеночной недостаточности, содержащий стволовые клетки взрослого человека в коллагеновом геле, отличающийся тем, что из стволовых клеток он содержит популяцию протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, обработанных вальпроевой кислотой в концентрации 0,1-40 мМ и культивированных в коллагеновом геле, при этом стволовые клетки характеризуются фенотипом CD49f+/EpCAM+ и в процессе обработки вальпроевой кислотой и культивирования в коллагеновом геле изменяют профиль экспрессии на 1AAT+/PEPCK+/G6P+/TDO+/CYP Р4503А13+, а также приобретают способность синтезировать мочевину и альбумин.