Новый эпитоп bnp (1-32) и антитела, направленные против указанного эпитопа

Новый эпитоп bnp (1-32) и антитела, направленные против указанного эпитопа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к натрийуретическим пептидам головного мозга человека (BNP) и диагностике in vitro застойной сердечной недостаточности у людей. Более конкретно, данное изобретение относится к новому эпитопу, присутствующему в молекуле BNP(1-32), антителам, направленным против указанного эпитопа, в частности моноклональному антителу 20G7, способу для иммунологического анализа BNP(1-32) и proBNP(1-108) и их соответствующих фрагментов с использованием такого антитела и наборам для тестирования для проведения указанных анализов.

Уровень техники

Застойная сердечная недостаточность является обычным клиническим синдромом, в частности, среди пожилых людей. Она обычно проявляется в форме протекающего бессимптомно запускания неспецифических симптомов, таких как кашель после физического напряжения, усталость и появление периферического отека. Диагностика и оценивание тяжести поражения (разделяемые на стадии I-IV NHYA в соответствии с New York Heart Association) основываются на объединенной интерпретации клинических признаков и результатов специфических тестов и испытаний (эхокардиографии, сцинтиграфии, теста на переносимость физической нагрузки и т.д.).

Вследствие тяжести застойной сердечной недостаточности, а также высокой стоимости ухода за пациентом, ранняя диагностика этого синдрома является явно высокожелательной, так как она способствовала бы выполнению лечений, подходящих для избежания или задержки быстрого прогрессирования этого синдрома в тяжелую застойную сердечную недостаточность. Таким образом необходимо идентифицировать людей, находящихся при риске застойной сердечной недостаточности и/или имеющих неблагоприятный прогноз или последующие осложнения. Это позволило бы также предложить одни и те же инструменты для (быстрого, простого и экономичного) терапевтического мониторинга пациентов, подлежащих лечению. В настоящее время такие способы диагностики, прогноза и мониторинга застойной сердечной недостаточности имеются и описаны ниже, но оказалось, что они являются несколько неудовлетворительными и не дающими полной информации.

Острые коронарные синдромы (ACS) являются также основной проблемой здоровья в настоящее время. Они включают в себя следующие сердечные заболевания: Q-инфаркт миокарда, инфаркт миокарда с повышением ST-сегмента или без повышения ST-сегмента, угрозу инфаркта миокарда или нестабильную стенокардию.

Диагностика, прогноз и мониторинг ACS являются также крайне важными в медицинском сообществе. Большой интерес в этих приложениях имеет анализ натрийуретических пептидов (BNP(1-32), NT-proBNP(1-76) и proBNP(1-108)).

То же самое относится к случаям одышки (диспноэ) (болезни, характеризующейся затруднениями дыхания), нарушениям мозгового кровообращения (также известным как "инсульт" или "апоплексия") и ассоциированным патологиям, таким как почечная недостаточность и диабет, ассоциированным с такими патологиями.

В течение длительного времени проводились поиски пресимптоматических маркеров, которые могут предсказывать застойную сердечную недостаточность. В этом отношении было показано, что кардиомиоциты продуцируют и секретируют пептиды с натрийуретической активностью: пептид, происходящий из ушка предсердия, ANP (предсердный натрийуретический пептид), обнаруженный в крысах de Bold et al., Life Scieyces 1981, vol. 28(1): 89-94, и натрийуретический пептид аурикуловентрикулярного происхождения, известный как BNP (натрийуретический пептид головного мозга), обнаруженный авторами патента ЕР 418308 и Sudoh et al. (1988) Nature 332:78-81 в свиньях и в людях.

Предшественник BNP, preproBNP(1-134), является формой запасания этой молекулы внутри кардиомиоцитов. Указанный предшественник расщепляется во время и/или после его секреции с целью высвобождения сигнального пептида и proBNP(1-108). ProBNP(1-108) состоит из полипептида из 108 аминокислот последовательности: H₁PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATE GIRGHRKMVLYTLRAPR₇₆S₇₇PKMVGSGCFGRXMDRISSSSGLGCKVLRRH₁₀₈ (SEQ ID NO: 1).

Он расщепляется до и/или после секреции между аминокислотами Arg₇₆ и Ser₇₇ на BNP, с одной стороны, известный также как BNP(77-108) или BNP-32 или даже BNP(1-32) (термин, который будет использоваться здесь далее), и N-концевую часть этого прогормона, BNP(1-76), также известную как N-концевой фрагмент proBNP или NT-proBNP(1-76) (термин, который будет использоваться здесь далее).

BNP(1-32), вазоактивная форма этой молекулы, состоит из пептида из 32 аминокислот последовательности: S₁PKMVGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRJH₃₂ (SEQ ID NO:2).

17 аминокислот образуют петлю, замкнутую дисульфидной связью между двумя окисленными остатками цистеина (С₁₀ и С₂₆), причем указанная петля окружена слева 9 аминокислотами (которые составляют N-концевую часть) и справа 6 аминокислотами (которые составляют C-концевую часть).

Целостность петли является важной для получения хорошей биологической активности. Из этих 17 остатков, образующих петлю, 11 остатков являются также консервативными в 2 других натрийуретических пептидах, которые являются ANP (натрийуретическим пептидом А-типа) и CNP (натрийуретическим пептидом С-типа).

NT-proBNP(1-76) образован 76 N-концевыми аминокислотами proBNP(1-108) и имеет следующую последовательность:

H₁PLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMVLYTLRAPR₇₆ (SEQ ID NO: 3).

Интересно, что эти 3 полипептида, proBNP(1-108), NT-proBNP(1-76) и BNP (1-32), оказались хорошими маркерами застойной сердечной недостаточности, так что были разработаны различные анализы со специфическими комбинациями антител.

Действительно, когда было показано, что proBNP(1-108) циркулирует в крови, с первоначальных исследований Tateyama et al. (1992) Biochemical and Biophysical Research Communications 185: 760-767, были предложены различные иммунологические анализы для детектирования proBNP(1-108). Так, Заявка на патент WO 99/13331 описывает сэндвич-анализ proBNP(1-108) с использованием антитела, которое узнает 1-76-часть proBNP(1-108), и анти-BNP(1-32)-антитела. Этот тип анализа теряет чувствительность вследствие связывания на твердой фазе (т.е. с иммобилизованными антителами) побочными продуктами расщепленного proBNP(1-108), имеющими эпитоп, узнаваемый иммобилизованным антителом, то есть NT-proBNP(1-76) и продуктами, образующимися из его прогрессирующего расщепления.

Заявка WO 2004/14952 описывает детектирование proBNP(1-108) с использованием, с одной стороны, антитела, которое узнает эпитоп с последовательностью RAPRSP, расположенный в шарнирной области NT-proBNP(1-76) и BNP(1-32) (также называемого антителом hinge 76), и, с другой стороны, анти-BNP(1-32)-антитела, так что в этом типе анализа этот анализ является специфическим только в отношении прогормона, т.е. отсутствует перекрестная реактивность с этими двумя формами NT-proBNP(1-76) и BNP (1-32).

Что касается анализа NT-proBNP(1-76), Заявка WO 93/24531 описывает способ диагностики in vitro застойной сердечной недостаточности на основе детектирования NT-proBNP(1-76). Однако способ, описанный в заявке WO 93/24531, по-видимому, нелегко проводить HaNT-proBNP(1-76) в пробах крови. Действительно, единственные показанные примеры проводили не на сыворотках человека, а на диапазонах стандартов, полученных с использованием синтетического пептида, пептида NT-proBNP(47-64). Оказалось, что для преодоления этого недостатка необходима высокоусложненная автоматизированная система.

Наконец, множество анализов BNP(1-32) были разработаны с использованием различных антител. Например, патент Японии JP 2676114 В2 описывает 2 моноклональных антитела (KY-hBNPI и KY-hBNPII), которые узнают циклическую структуру BNP(1-32), без других подробностей.

Кроме того, заявка на патент ЕР 542255 описывает моноклональное антитело, которое узнает гистидин H₃₂, последнюю аминокислоту C-концевого эпитопа K₂₇VLRRH₃₂ BNP(1-32). Известны другие эпитопы, присутствующие на BNP(1-32): описаны также 3 эпитопа последовательности ₁SPKMVQGSGC₁₀ (SEQ ID NO: 22), 5VQGSGCFGR₁₃ (SEQ ID NO: 21) и ₁₅MDRISSSSGLG₂₅ (SEQ ID NO: 23) как являющиеся высокоиммуногенными в заявке WO 97/32900 и патенте US 6,162,902. Указанные документы описывают также моноспецифические антитела, направленные против этих эпитопов.

В 2005 году компания HyTest (Turku, Finland) предоставила различные антитела, специфические в отношении BNP(1-32), на рынок. Как описано в статье Sefehan et al. (2007) Clinical Chemistry 53:5, 866-873, некоторые из анти-BNP(1-32)-антител нацелены на район 1-10, 11-22, 17-23 или 26-32 BNP(1-32). Среди 17 антител, полученных иммунизацией мышей Balb/c с использованием пептида ₁₁FGRKIVIDRISSSS₂₂ (SEQ ID NO: 61) BNP (1-32), описаны только моноклональные антитела 24С5 и 26Е2. Однако их эпитопы не охарактеризованы точно: указывается только, что они направлены против вышеупомянутой последовательности аминокислот 11-22 BNP(1-32).

Заявка на патент WO 2006/88700 описывает другой эпитоп, присутствующий на BNP(1-32). Он имеет последовательность аминокислот R₁₃(K₁₄)(M₁₅)D₁₆R₁₇I₁₈ (SEQ ID NO: 24), включенную в аминокислоты 13-20, которые образуют часть циклической структуры BNP(1-32) человека. Эта заявка описывает также моноклональное антитело, названное 3-631-436, которое узнает специфически этот эпитоп. 4 аминокислоты R₁₃, D₁₆, R₁₇ и I₁₈ описаны как являющиеся значимо функциональными в отношении связывания антитела 3-631-436 с этим эпитопом. Аминокислоты, расположенные справа от этого эпитопа (такие, как фенилаланин F₁₁ и глицин G₁₂), не упоминаются. Одним из недостатков гормона BNP(1-32) является то, что он является нестабильным в плазме и в сыворотке. Действительно, ферменты типа протеазы, по-видимому, расщепляют BNP(1-32). Например, Shimizu et al. (2002) Clinica Chimica Acta 316: 129-135 сообщают, что N-концевая часть BNP(1-32), более конкретно связь Pro₂-Lys₃, могла расщепляться протеазами, так же как и связь Arg₃₀-Arg₃₁ в С-концевом положении. Boerrigter et al. (2007) Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292: R897-90 и Hawkridge et al (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102: 17442-7 описали, в частности, деградацию BNP(1-32) в N-концевом положении.

Подобным образом сообщались некоторые расщепления связей, вызываемые эндопептидазами (Davidson & Struthers (1994) J. Hypertension 13: 329-336). Таким образом, анализ BNP(1-32) требует особых предосторожностей (Davidson et al. (1995) Circulation 91: 1276-7; Gobinet-Georges et al. (2000) Clin. Chem. Lab. Med. 38: 519-23) и предполагает подходящий выбор антител.

Недавно несколько групп исследователей показали, что натроийуретические пептиды могли бы циркулировать в гликозилированной и/или укороченной форме (Schellenberger (2006) Arch. Biochem. Biophys. 451: 160-6; Liang et al. (2007) Journal of the American College of Cardiology 49: 1071-8; Lam et al. (2007) Journal of the American College of Cardiology 49: 1193-292).

Что касается ранней диагностики застойной сердечной недостаточности, ACS, одышки (диспноэ) и других сердечно-сосудистых заболеваний, а также CVA и ассоциированных патологий, таких как диабет и почечная недостаточность, всегда существует потребность в улучшении реагентов и способов для детектирования BNP(1-32) и proBNP(1-108), в частности, с учетом проблемы нестабильности BNP(1-32).

Раскрытие изобретения

Данное изобретение логически вытекает из совершенно неожиданного обнаружения авторами этого изобретения неизвестного и непредполагаемого эпитопа, который существует в молекуле BNP(1-32) человека, и специфического моноклонального антитела, которое узнает указанный эпитоп. Вопреки всем ожиданиям авторы этого изобретения обнаружили, что последовательность F₁₁GRKMDR₁₇ (SEQ ID NO: 51) BNP(1-32) составляет предпочтительный эпитоп для генерирования антител, которые узнают эту циклическую структуру (аминокислоты 10-26) BNP(1-32), и они получили моноклональное антитело, названное 20G7, которое специфически узнает указанный эпитоп F₁₁G₁₂RK₁₄MDR₁₇ (SEQ ID NO: 51). Другими словами, антитело 20G7 является моноклональным антителом, специфическим в отношении эпитопа F₁₁GRKMDR₁₇ (SEQ IDNO: 51) BNP(1-32).

Данное изобретение обеспечивает также способ иммуноанализа для детектирования BNP(1-32) и proBNP(1-108), а также их циркулирующих фрагментов с использованием моноклонального антитела 20G7 и реагентов, содержащих указанное антитело.

Действительно, авторы изобретения заметили, что при синтезе пептидов, локализованных в циклическом районе (аминокислоты 10-26) BNP(1-32) человека, и иммунизации мышей указанными пептидами некоторые полученные антитела реагировали с пептидами этого типа только в том случае, если указанные пептиды содержали остатки фенилаланина F₁₁, лизина K₁₄ и аргинина R₁₇, и что изолейцин I₁₈, который был особенно значимым в эпитопе, описанном в международной заявке WO 2006/88700, не принадлежал к эпитопу в соответствии с данным изобретением.

Например, авторы этого изобретения иммунизировали некоторых мышей пептидом TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVL (SEQ ID NO: 4), а других пептидом (SEQ ID NO: 5). Они наблюдали, что иммунная реакция с BNP(1-32) была гораздо большей в мышах, иммунизированных пептидом TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVL (SEQ ID NO: 4), чем в мышах, иммунизированных пептидом SGCYGRKMDRISTSTAIGCKVL (SEQ ID NO: 5). Следует отметить, что в обоих случаях цистеины присутствовали в окисленной форме через внутриклеточную дисульфидную связь.

Таким образом, после лимфоцитарного слияния клеток селезенки иммунизированных мышей авторы изобретения были способны получать разные гибридные клоны. В частности, они получали моноклональное антитело, названное 20G7-15/03/2007 (далее здесь называемое "20G7" для удобства), которое узнает только пептиды BNP(1-32) и proBNP(1-108), которые содержат остатки фенилаланина F₁₁, лизина K₁₄ и аргинина R₁₇. Действительно, было доказано, что эти аминокислоты F₁₁, K₁₄ и R₁₇ являются важными для оптимального связывания моноклонального антитела 20G7 с BNP(1-32) и с proBNP(1-108), а также их соответствующими фрагментами.

Гибридому, которая секретирует моноклональное антитело 20G7-15/03/2007 (20G7), депонировали 13 апреля 2007 года Bio-Rad в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France) под регистрационным номером CNCM I-3746.

Удивительным и неожиданным образом авторы этого изобретения наблюдали с антителом 20G7, что как только остатки F₁₁, K₁₄ и R₁₇ заменяли аланином, отдельно или вместе, наблюдалось существенное действие на антигенную реактивность этого пептида в сравнении с природным пептидом SGCFGRKMDRISSSSGLGCKVL (SEQ ID NO: 6), тогда как замена других аминокислот в этом эпитопе почти не влияла на антигенную реактивность этого пептида. Кроме того, тщательное исследование, проведенное на антителе 20G7, показало, что оно узнает эпитоп F₁₁GRKMDR₁₇ (SEQ ID NO: 51), но не узнает ни последовательность A₁₁GRKMDR₁₇ (SEQ ID NO: 62), ни последовательность GRKMDR₁₇I₁₈(SEQ ID NO: 52), ни последовательность C₁₀F₁₁GRKMD (SEQ ID NO: 50).

Таким образом, моноклональное антитело 20G7 узнает эпитопную последовательность F₁₁GRKMDR₁₇ (SEQ ID NO: 51) BNP(1-32), но по существу не узнает ни один из вышеупомянутых эпитопов VQGSGCFGR (SEQ ID NO: 21), SPKMVQGSGC (SEQ ID NO: 22) и MDRISSSSGLG (SEQ ID NO: 23)) заявки WO 97/32900 и эпитоп R(K)(M)DRI (SEQ ID NO: 24) заявки WO 2006/88700.

Таким образом, данное изобретение относится к полипептиду, несущему эпитоп BNP(1-32) человека, имеющему формулу (I):

a 1 − R 1 − X 1 − F G R K M D R − X 2 − R 2 − a 2   ( I ) ,

где:

- a₁ может быть Н или обозначает функциональную группу или химическую группу, выбранную из функциональной тиоловой, спиртовой, аминоксигруппы, группы первичного амина или вторичного амина, аминокарбоксильной группы, биотинильной группы и ацетильной группы;

- а₂ может обозначать функциональную группу ОН, NH₂ или алкоксильную группу (как будет понятно лицу с квалификацией в данной области, a₂, присоединенный к карбонильной (-СО-)-части кислотной функциональной группы последней аминокислоты этого полипептида);

- X₁ отсутствует или присутствует и, когда присутствует, выбран из С и GC;

- Х₂ отсутствует или присутствует и, когда присутствует, выбран из I и IS;

- R₁ и R₂, которые могут быть одинаковыми или различными, отсутствующими или присутствующими, обозначают любую аминокислоту или пептидную цепь из 2-15 аминокислот при условии, что указанный полипептид формулы (I) не включает в себя никакую часть BNP (1-32) человека, большую чем 11 аминокислот, включающих в себя последовательность GCFGRKMDRIS (SEQ ID NO: 63).

В качестве эквивалентной альтернативы формула (I) может быть определена следующим образом:

a₁-(R₁)-(G)-(C)-FGRKMDR-(I)-(S)-(R₂)-a₂,

где a₁, а₂, R₁ и R₂ имеют определенные выше значения.

"Эпитоп" или "эпитопный сайт" обозначает аминокислотную последовательность, которая узнается, по меньшей мере, одним антителом и позволяет этому антителу связываться специфически с указанной аминокислотной последовательностью.

В предпочтительном варианте осуществления R₁ и R₂ могут быть связаны с молекулами-носителями, реагентами или маркерными молекулами.

В другом предпочтительном варианте осуществления указанный полипептид выбран из группы, состоящей из a₁SGCFGRKMDR-a₂ (SEQ ID NO: 33), a₁-GCFGRKMDRI-a₂ (SEQ ID NO: 34), a₁CFGRKMDRIS-a₂ (SEQ ID NO: 35) и a₁FGRKMDRISS-a₂ (SEQ ID NO: 36), где a₁ и a₂ имеют определенные выше значения.

В другом предпочтительном варианте осуществления определенный выше полипептид соответствует формуле (II):

a 1 − F G R K M D R − a 2   ( I I ) ,

где a₁ и а₂ имеют определенные выше значения.

Данное изобретение относится также к применению полипептида, определенного здесь выше, для получения лигандов, направленных против BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, а также их соответствующих фрагментов, содержащих последовательность FGRKMDR (SEQ ID NO: 51).

"Фрагмент proBNP(1-108)" в соответствии с этим изобретением обозначает любой фрагмент, который меньше, чем proBNP(1-108), в том числе, в частности, BNP(1-32), например фрагмент proBNP(3-108), описанный в Lam et al. (2007) J. Am. Coll. Cardiol. 49:1193-1202 и полученный расщеплением дипептидазой. Термин "фрагмент proBNP(1-108)" в соответствии с этим изобретением включает в себя также любой полипептид, который был подвергнут, по меньшей мере, одной посттрансляционной модификации proBNP(1-108), такой как фосфорилирование, гликозилирование или т.п. Например, Schellenberger et al. (2006) Arch. Biochem. Biophys. 51: 160-6 показали, что proBNP(1-108) является гликопротеином, который O-гликозилирован полностью или частично.

"Фрагмент BNP(1-32)" в соответствии с этим изобретением обозначает любой фрагмент, меньший, чем BNP(1-32). В этом случае также деградация BNP(1-32) уже сообщалась в литературе: например, фрагмент BNP(3-32) был описан Lam et al. (supra) и Hawkridge et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 17442-7.

Термины "proBNP(1-108)" и "BNP(1-32)", а также "фрагмент proBNP(1-108)" и "фрагмент BNP(1-32)" включают в себя также любой полипептид, который был подвергнут, по меньшей мере, одной посттрансляционной модификации proBNP(1-108), такой как фосфорилирование, гликозилирование или т.п. Например, Schellenberger et al. (2006) Arch. Biochem. Biophys. 51: 160-6 показали, что proBNP(1-108) является гликопротеином, который O-гликозилирован полностью или частично.

"Лиганды, направленные против BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, а также их соответствующих фрагментов, содержащих последовательность FGRKMDR", обозначают любую молекулу, способную связываться специфически с BNP(1-32) человека, с proBNP(1-108) человека или с их фрагментами.

Термин "специфический", когда он относится к узнаванию лиганда или связыванию лиганда с мишенью, означает, что этот лиганд взаимодействует с мишенью без взаимодействия по существу с другой мишенью, которая структурно не похожа на эту мишень. "Специфическое" узнавание эпитопа FGRKMDR означает, что взаимодействие этого лиганда с мишенью, содержащей этот эпитоп, по существу не включает в себя антигенных детерминант, в частности аминокислот, других, чем аминокислоты этого эпитопа. В частности, это означает, что этот лиганд способен связывать последовательность аминокислот последовательности BNP(1-32) и/или proBNP(1-108), a также их соответствующих фрагментов, содержащих аминокислоты, содержащие эпитоп FGRKMDR, но неспособны связывать последовательность аминокислот последовательности BNP(1-32) и/или proBNP(1-108), которая не содержит эпитоп FGRKMDR в его полном виде.

Кроме того, аминокислоту, присутствующую в эпитопе, называют "критической", когда ее замена аланином приводит к уменьшению, по меньшей мере, 50% антигенности указанного эпитопа, согласно Laune et al. (2002) Journal of Immunological Methods 267: 53-70.

Кроме того, аминокислоту, присутствующую в эпитопе, называют "незаменимой", когда ее замена аланином приводит к уменьшению, по меньшей мере, 80% антигенности указанного эпитопа.

Предпочтительно, лиганд, который узнает эпитоп FGRKMDR в соответствии с данным изобретением по существу не взаимодействует с пептидами, имеющими последовательность VQGSGCFGR (SEQ ID NO: 21), SPKMVQGSGC (SEQ ID NO: 22), MDRISSSSGLG (SEQ ID NO: 23), RKMDRI (SEQ ID NO: 24) и RKMDRISS (SEQ ID NO: 25).

Выражение "по существу не взаимодействует с пептидами, имеющими последовательность VQGSGCFGR, SPKMVQGSGC, MDRISSSSGLG, RKMDRI и RKMDRISS", означает, что этот лиганд имеет перекрестную реакцию с одной или другой из этих последовательностей, меньшую чем приблизительно 20%, более предпочтительно меньшую, чем 10%, особенно предпочтительно меньшую, чем 2%.

В объеме специфического узнавания мишени предпочтительными являются константы связывания, большие чем 10⁶ М^-1, более предпочтительно константы связывания, большие чем 10⁸ М^-1, и особенно предпочтительно константы связывания, большие чем 10¹⁰ М^-1.

Предпочтительно, остатки F₁₁, K₁₄ и R₁₇ являются также незаменимыми для связывания лиганда в соответствии с данным изобретением с эпитопом, так как их замена аланином характеризуется потерей 82, 95 и 85% соответственно связывания моноклонального антитела, продуцируемого гибридомой, депонированной 13 апреля 2007 года в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France) под регистрационным номером CNCM I-3746, с эпитопным пептидом.

Предпочтительно, этот лиганд выбран из группы, состоящей из антитела или фрагмента указанного антитела, который узнает этот эпитоп, аптамера и полипептида, который специфически узнает эпитоп, получаемый при помощи фагового дисплея.

В этом контексте термин "антитело" относится к любому поликлональному или моноклональному антителу.

Фрагменты scFv, Fab, Fab', F(ab')₂, а также одноцепочечные антитела животных семейства верблюдовых являются примерами фрагментов антител, которые узнают этот эпитоп.

"Аптамеры" хорошо известны квалифицированному в данной области специалисту. Аптамеры являются соединениями нуклеотидного, в частности рибонуклеотидного или дезоксирибонуклеотидного, или пептидного, характера, способными специфически связываться с мишенью, в частности мишенью-белком. Аптамеры нуклеотидного характера описаны, в частности, Ellington et al. (1990) Nature 346: 818-22 and Bock et al. (1992) Nature 355: 564-6. Аптамеры пептидного характера описаны, в частности, Норре-Seyler et al. (2000) J. Mol Med. 78: 426-30.

"Фаговым дисплеем" называют способ отбора полипептидных лигандов, экспрессируемых на капсиде бактериофага и кодируемых последовательностью нуклеиновой кислоты, встроенной в кодирующий капсид ген. Этот способ хорошо известен квалифицированному в данной области специалисту и описан, в частности, Scott & Smith (1990) Science 249: 386-390 и Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597. Предпочтительно, полипептид, получаемый при помощи фагового дисплея, является полипептидом scFv-типа (одноцепочечным вариабельным фрагментом). Этот способ описан, в частности, Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455.

Эти лиганды могут быть также получены химическим синтезом или генетической инженерией.

Предпочтительно, определенные выше полипептиды используют для получения антител, в частности моноклональных антител.

В этом контексте это изобретение относится также к применению полипептида, определенного выше, для получения гибридомы, которая секретирует моноклональное антитело, направленное против BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, а также их соответствующих фрагментов, содержащих последовательность FGRKMDR.

Таким образом, это изобретение относится к способу получения гибридомы, которая секретирует моноклональное антитело, направленное против BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, а также их соответствующих фрагментов, содержащих последовательность FGRKMDR, где:

- образцы лимфоцитов, секретирующих иммуноглобулины, берут из животного, такого как мышь, кролик или крыса, иммунизированного определенным выше полипептидом,

- затем эти лимфоциты сливают с миеломными клетками, такими как клетки миеломы Sp2 (ATCC CRL-1581), для получения гибридомы.

Данное изобретение относится также к гибридоме, получаемой по способу получения гибридомы, определенной выше.

Более конкретно, данное изобретение относится к гибридоме, депонированной 13 апреля 2007 года в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France) под регистрационным номером CNCM I-3746.

Обычно методология, используемая для получения гибридом и моноклональных антител, может использовать общепринятый способ слияния лимфоцитов и культивирования гибридом, описанный Kohler & Milstein (1975) Nature 256: 495-497. Другие способы получения моноклональных антител также известны (например, Harlow et al., ed. 1988 "Antibodies: a laboratory manual").

Имеются также способы, альтернативные этому общепринятому способу. Моноклональные антитела могут быть получены, например, экспрессией нуклеиновой кислоты, клонированной из гибридомы.

Данное изобретение относится также к лиганду, специфическому в отношении эпитопа с последовательностью FGRKMDR.

Предпочтительно, этот лиганд выбран из группы, состоящей из антитела или фрагмента указанного антитела, который узнает эпитоп, аптамера и полипептида, который специфически узнает эпитоп, полученный при помощи фагового дисплея.

Более предпочтительно, этот лиганд является антителом, которое специфически узнает эпитоп с последовательностью FGRKMDR, или фрагментом указанного антитела, который специфически узнает этот эпитоп. Даже более предпочтительно, этот лиганд является моноклинальным антителом, в частности моноклональным антителом, продуцируемым определенной выше гибридомой.

Таким образом, это изобретение относится, в частности, к лиганду, определенному выше, состоящему из моноклонального антитела, продуцируемого гибридомой, депонированной 13 апреля 2007 года в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France) под регистрационным номером 1-3746.

Далее, это изобретение, более конкретно, относится к лиганду, определенному выше, несущему, по меньшей мере, один определяющий комплементарность район (CDR), в частности все эти CDR, определенного выше лиганда, состоящего из моноклонального антитела, продуцируемого гибридомой, депонированной 13 апреля 2007 года в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75 724 Paris Cedex 15, France) под регистрационным номером CNCM I-3746. CDR и способы переноса CDR из одного антитела в лиганд, предпочтительно другое антитело, хорошо известны в данной области и описаны, например, в Nicaise et al. (2004) Protein Science 13: 1882-1891 или Kettleborough et al. (1991) Protein Engineering 4: 773-783.

Кроме того, определенные выше лиганды могут быть связаны с молекулами-носителями, реагентами или мечеными молекулами.

Данное изобретение относится также к лиганду, определенному выше, для детектирования в биологической пробе BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, а также их соответствующих фрагментов, содержащих последовательность FGRKMDR.

Действительно, данное изобретение относится также к способу детектирования в биологической пробе BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, а также их соответствующих фрагментов, содержащих последовательность FGRKMDR, предусматривающему:

1) контактирование этой биологической пробы, по меньшей мере, с одним лигандом, определенным выше, предпочтительно при условиях, позволяющих образование комплексов антиген-лиганд;

2) детектирование любых комплексов, которые могли быть образованы.

В контексте этого изобретения "биологическая проба" или даже "проба биологической жидкости" состоит предпочтительно из биологической жидкости, такой как кровь, плазма, сыворотка, цереброспинальная жидкость, слюна, моча и слезы, и т.д. (см., например, Michielsen et al. (2008) Ann Clin Biochem 45: 389-94; Cortes et al., (2006) Eur J Heart Fail 8: 621-7; Kirchhoff et al., (2006) J Neurotrauma 23: 943-9; Kaneko et al., (1993) Brain Res 612: 104-9). Как имеется в виду в этом случае, термин "биологическая проба" включает в себя как пробу в таком виде, в каком она взята, так и пробу, которую подвергали различным обработкам, в частности, для придания ей свойств, подходящих для применения в процессах и способах в соответствии с данным изобретением.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанный способ детектирования включает в себя, по меньшей мере, одну дополнительную стадию контактирования биологической пробы, по меньшей мере, с одним дополнительным лигандом, специфическим в отношении BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека и их соответствующих фрагментов, который имеет другую специфичность, отличающуюся от специфичности лиганда по этому изобретению.

Предпочтительно, этот дополнительный лиганд является антителом. Данное изобретение относится также к способу диагностики, прогноза, стратификации риска (распределения факторов риска по степени вероятности) или последующего наблюдения отдаленных результатов, по меньшей мере, одной сердечной и/или сосудистой патологии в индивидууме, предусматривающему стадии:

1) контактирования биологической пробы из индивидуума, по меньшей мере, с одним лигандом, определенным выше, предпочтительно при условиях, позволяющих образование комплексов антиген-лиганд,

2) детектирования любого комплекса, который мог быть образован;

3) на основе результата детектирования в стадии 2, определения диагноза, прогноза, риска развития или терапевтического наблюдения отдаленных результатов этой патологии в этом индивидууме.

В конкретном варианте осуществления способ, определенный выше, включает в себя, по меньшей мере, одну дополнительную стадию контактирования биологической пробы из индивидуума, по меньшей мере, с одним дополнительным лигандом, специфическим в отношении производного BNP(1-32) человека или proBNP(1-108) человека, который имеет другую специфичность, отличающуюся от специфичности лиганда по этому изобретению.

Предпочтительно, этот дополнительный лиганд является антителом.

Предпочтительно, эта патология выбрана из группы, состоящей из:

- застойной сердечной недостаточности,

- острого коронарного синдрома,

- нарушения мозгового кровообращения (инсульта),

- почечной недостаточности,

- одышки (диспноэ),

- высокого кровяного давления,

- разрыва атероматозной бляшки,

- открытого артериального (Боталлова) протока у недоношенных новорожденных и/или

- диабета.

"Застойная сердечная недостаточность" обозначает патологическое состояние, в котором аномалия сердечной функции ответственна за то, что сердце неспособно достаточно накачивать кровь для удовлетворения метаболических потребностей организма, и/или в котором сердце удовлетворяет эти потребности, но при ненормально высоких давлениях наполнения. В частности, этот термин может относиться к декомпенсации левого и/или правого желудочка.

"Острые коронарные синдромы" обозначают, в частности, две категории:

- острую коронарную недостаточность, сопровождаемую стойкой анакротой [т.е. повышением] ST-сегмента, выявляющую образование трансмурального Q-инфаркта миокарда, соответствующую обычно острой общей коронарной окклюзии, и

- острую коронарную недостаточность без анакроты [т.е. без повышения] ST-сегмента, т.е. соответствующую не-Q-инфаркту миокарда, также известную как нестабильные стенокардии, которые соответствуют разрывам бляшек и неполным тромбозам и требуют другого лечения.

"Одышка (диспноэ)" обозначает патологическое состояние, характеризуемое затруднениями дыхания, сопровождаемыми ощущениями обструкции или спазма. Она является чрезвычайно частым симптомом, который может быть обусловлен несколькими причинами. Только методический подход делает возможным подходящее лечение.

Согласно определению Всемирной организации здравоохранения "цереброваскулярный приступ (нарушение мозгового кровообращения)", или "CVA", или "инсульт", или "апоплексия" означает патологическое состояние, характеризуемое быстрым развитием локализованных или глобальных признаков церебральной дисфункции, сопровождаемых симптомами, длящимися более 24 часов, которые могут приводить к смерти без видимой причины, иной, чем причина васкулярного происхождения.

Описанные выше процесс и способ могут проводиться в соответствии с различными форматами, хорошо известными квалифицированному в данной области специалисту, например в твердой или гомогенной фазе, в виде одной или двух стадий, при помощи сэндвич-способа или при помощи конкурентного способа.

Предпочтительно, используют сэндвич-способ в твердой фазе между 2 лигандами (предпочтительно антителами), причем один является иммобилизованным лигандом, а другой является детектирующим лигандом. Этот тип иммуноанализа особенно хорошо известен квалифицированному в данной области специалисту. Например, статья Sefehan et at. (2007) Clin. Chem. 53: 866-873 дает пример сэндвич-иммуноанализа (или иммунометрического анализа в 2 сайтах) для анализа BNP(1-32) и proBNP(1-108), в каждом случае с использованием пары антител (антитела, иммобилизованного в твердой фазе и меченого антитела в детектировании).

"Иммобилизованный лиганд" означает лиганд, способный связывать антиген BNP(1-32) и/или антиген proBNP(1-108), а также их соответствующие фрагменты, присутствующие в биологической пробе.

Присутствие этого антигена в биологической пробе выявляют с использованием средства детектирования, в частности "детектирующего лиганда". Детектирующий лиганд, который является меченым, способен связываться с иммобилизованным антигеном посредством узнавания эпитопного сайта, который является другим, чем эпитопный сайт, узнаваемый иммобилизованным лигандом.

Термин "меченый" относится как к прямому мечению, так и к непрямому мечению (например, посредством других лигандов, которые сами являются мечеными, или с использованием реагентов меченых "аффинных пар", таких как, но не только, парамеченый авидин-биотин, и т.д.).

В случае сэндвич-способа иммобилизованный лиганд предпочтительно выбран таким образом, что он специфически узнает эпитоп на природном антигене пациента, тогда как детектирующий лиганд выбран предпочтительно таким образом, что он специфически узнает другой эпитоп на этом природном антигене пациента.

Предпочтительно, иммобилизованный лиганд иммобилизуют на твердой фазе. В качестве неограничивающих примеров твердой фазы могли бы использоваться микропланшеты, в частности полистироловые микропланшеты, такие как микропланшеты, продаваемые Nunc, Denmark. Могут быть также использованы твердые частицы или гранулы, парамагнитные гранулы, такие как гранулы, производимые Dynal, Merck-Eurolab (France) (под товарным знаком Estapor TM) и Polymer Laboratories, или даже тест-пробирки из полистирола или полипропилена, стеклянные, пластиковые или силиконовые чипы и т.д.

Анализы ELISA, радиоиммуноанализы или любой другой способ детектирования могут быть использованы для выявления присутствия образованных комплексов антиген-антитело. Таким образом возможны различные типы мечения лигандов, в частности антител (радиоактивные, ферментативные, флуоресцентные и т.д.).

Детектирование может также проводиться новыми способами на основе накопления массы, такими как поверхностный плазменный резонанс (SPR), пьезоэлектрическое детектирование, но также детектирование при помощи масс-спектрометрии или любых других способов, определенных как способы, позволяющие исследовать взаимодействие типа лиганд-антиген в отсутствие второго меченого лиганда.

Одно предпочтительное осуществление вышеописанного процесса или способа состоит в использовании лиганда, определенного выше, иммобилизованного на твердой фазе, в комбинации, по меньшей мере, с одним моноклональным или поликлональным антителом, направленным против N-концевой части BNP(1-32), присутствующим в меченой форме.

Другое предпочтительное осуществление вышеописанного процесса или способа состоит в использовании лиганда, определенного выше, иммобилизованного на твердой фазе, в комбинац