Способ выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих znf281

Способ выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных стволовых клеток, экспрессирующих znf281

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к способу выделения плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, происходящих из пуповинной крови, где способ характеризуется культивированием моноцитов, выделенных из пуповинной крови, в сосуде для культивирования, содержащем фибронектин, и последующим сбором стволовых клеток из культуры, с выделением, таким образом, происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток; и к клеточному терапевтическому средству, содержащему происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки или дифференцированные из них клетки. Данное изобретение также относится к новой среде для культивирования стволовых клеток, способу культивирования стволовых клеток, где способ характеризуется культивированием и пролиферацией стволовых клеток в среде для культивирования, и способу увеличения «стволовости» стволовых клеток, которая характеризуется сферичной или трехмерной культурой стволовых клеток.

Предшествующий уровень техники

Стволовые клетки, характеризующиеся тем, что являются самообновляющимися, подвергаются дифференцировке и являются иммортализованными, были предложены для решения проблем регенеративной медицины и тканевой реплантации, таким образом, их можно использовать для лечения различных дегенеративных заболеваний, так же как для предоставления возможности глубокого понимания клеточной биологии. Стволовые клетки взрослых, получаемые из различных тканей, являются более предпочтительными, чем эмбриональные стволовые клетки, вследствие того, что стволовые клетки взрослых можно получать из неограниченного числа источников, и этические соображения для использования человеческих эмбрионов в качестве источника клеток утрачивают свое значение. Кроме того, стволовые клетки, выделенные из пуповинной крови, обладают преимуществами по сравнению с другими стволовыми клетками взрослых в том отношении, что доноры пуповинной крови не подвергаются травмированию, в отличие от доноров костного мозга или жировой ткани.

Происходящие из пуповинной крови мезенхимальные стволовые клетки успешно вводили in vitro в различные виды клеток, включающие нервные клетки, гепатоциты, остеоциты и т.д. (Sun, W. et al., Stem cells, 23:931, 2005; Hong SH. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 30:1153, 2005; Hutson EL. et al., Tissue Engineering, 11:1407, 2005). Также сообщали об успешности in vivo трансплантации происходящих из пуповинной крови мезенхимальных стволовых клеток при травмах, сахарном диабете и инфаркте миокарда (Nonome, K. et al., Am, J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 289:1091, 2005; Yoshida, S. et al., Stem cells, 23:1409, 2005; Kim Bo. et al., 25 Circulation, 112:96, 2005). Вследствие низкой вероятности заражения инфекционными заболеваниями и низкой вероятности возникновения реакции «трансплантат против хозяина», трансплантацию происходящих из пуповинной крови мезенхимальных стволовых клеток все чаще применяют в отношении как пациентов детского возраста, так и взрослых пациентов (Claudio G. B. et al., Annual Review of Medicine, 57:403, 2006). Несмотря на то что трансплантацию пуповинной крови применяли в качестве терапии некоторых заболеваний, а конкретно - заболеваний, связанных с дефектом в системе кроветворения (Grewal, SS. et al., Blood, 103:1147, 2004; Knutsen, AP. et al., Journal pediatrics, 142:519, 2003; Ooi, J. et al., Blood, 103:489, 2004; Sanz GF. et al., Blood, 103:489, 2004), количество исследований клинического применения происходящих из пуповинной крови мезенхимальных стволовых клеток все еще ограничено. Например, существуют сообщения, что стволовые клетки используют для не полностью, но частично успешного лечения женщин с поражениями спинного мозга и пациентов с болезнью Бюргера (Kim, SW. et al., Stem cells, 2006; Kang, KS. et al., Cytotherapy, 7:368, 2005). Однако механизм развития или роста и пролиферации клеток все еще не известен.

Выделить мезенхимальные стволовые клетки из пуповинной крови трудно. Например, если способ, используемый для выделения происходящих из костного мозга мезенхимальных стволовых клеток, применяют для пуповинной крови, степень выделения остается на уровне приблизительно 20%. До 50% мезенхимальных стволовых клеток можно выделить из свежей крови, которую отобрали за 5 часов до выделения. Однако степень выделения снижается до 20% или менее, если кровь отобрали более чем за 5 часов до выполнения выделения, и клетки, хотя и выделены, но плохо пролиферируют.

Описание

Техническая проблема

В результате предпринятого авторами изобретения интенсивного и всестороннего исследования в области выделения и массовой пролиферации стволовых клеток из пуповинной крови, приведшего к настоящему изобретению, получили данные о том, что при культивировании в присутствии фибронектина, моноциты, выделенные из пуповинной крови человека, активно пролиферируют и образуют колонии, демонстрирующие веретенообразную морфологию, и даже после многочисленных пассажей сохраняют свойства, присущие стволовым клеткам. Таким образом, на основе полученных данных разработан эффективный способ выделения происходящих из пуповинной крови негематопоэтических плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток и мезенхимальных стволовых клеток и способ их массовой пролиферации.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка способа выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, содержащих культивируемые в присутствии фибронектина моноциты, выделенные из пуповинной крови и выделение стволовых клеток из культуры.

Другой задачей настоящего изобретения является предоставление происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, выделенных посредством способа выделения.

Дополнительной задачей настоящего изобретения является предоставление клеточного терапевтического средства, содержащего происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки или дифференцированные из них клетки.

Еще одной дополнительной задачей настоящего изобретения является разработка новой среды для культивирования стволовых клеток.

Другой задачей настоящего изобретения является разработка способа культивирования стволовых клеток с использованием среды для культивирования.

Это способ увеличения «стволовости» стволовых клеток с использованием сферичной или трехмерной культуры стволовых клеток.

Техническое решение

В соответствии с аспектом изобретения, изобретение относится к способу выделения происходящих из пуповинной крови стволовых клеток, где способ характеризуется культивированием выделенных из пуповинной крови моноцитов в сосуде для культивирования, содержащем фибронектин, и получение клеток из культуры.

В одном из вариантов осуществления стадия получения стволовых клеток из культуры включает использование иммунологического свойства стволовых клеток для отделения стволовых клеток.

Выделение моноцитов из пуповинной крови можно осуществлять с использованием общепринятого способа. После смешивания пуповинной крови с Hetasep для удаления эритроцитов, выделяют моноциты, используя Фиколл-пак. В настоящем документе, Hetasep предпочтительно используют в количестве 0,5~2 мл на 5 мл Hetasep.

Для увеличения выхода, при выделении моноцитов из пуповинной крови, используемая в настоящем изобретении пуповинная кровь предпочтительно представляет собой такую пуповинную кровь, которую предпочтительно получают непосредственно после родов, хранят при комнатной температуре в течение 12~48 часов после получения или хранят при 3~5°C в течение 6~72 часов после получения.

Выделение стволовых клеток из происходящих из пуповинной крови моноцитов характеризуется использованием фибронектина. Как применяют в настоящем документе, термин «сосуд для культивирования, содержащий фибронектин», предназначен для обозначения условия, при котором моноциты могут подвергаться взаимодействию с фибронектином. Например, фибронектин можно наслаивать на сосуд для культивирования или фибронектин может содержаться в среде для культивирования в форме сфер или трехмерных структур. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, в случае, если сосуд для культивирования покрывают фибронектином, фибронектин может содержаться из расчета удельного содержания от 0,1 до 1 мг/мл.

Фибронектин, пригодный в настоящем изобретении, может быть животного происхождения, без ограничения, и предпочтительно человеческого происхождения. Также, фибронектин можно получать искусственным синтезом (например, химический синтез, синтез с использованием пептидного синтезатора и т.д.) или биосинтезом (например, технология рекомбинантных ДНК, культура фибробластов и т.д.) или можно выделять из плазмы крови животных, включая людей, из внеклеточных матриксов. Фибронектин может представлять собой фрагмент или пептидную последовательность фибронектина или может содержать фрагмент или пептид.

Никаких конкретных ограничений не предъявляют к среде при культивировании моноцитов в сосуде для культивирования, содержащем фибронектин. В качестве основной среды для культивирования моноцитов предпочтительно используют SNU-1 или EGM-2.

Среда SNU-1 содержит следующую композицию (Таблица 1).

Таблица 1
	SNU-1 (мг/л)		SNU-1 (мг/л)		SNU-1 (мг/л)
CaCl2 (безводный)	200	L-изолейцин	78	i-инозитол	3
KCL	400	L-лейцин	78	Рибофлавин	0,15
MgSO4 (безводный)	97,67	L-лизин HCL	108,75	Тиамин HCL	1.5
NaCl	7635	L-метионин	22,5	L-аланин	17,8
NaH2PO4 H2O	140	L-фенилаланин	48	L-аспарагин H2O	30
D-глюкоза	1000	L-серин	21	L-аспарагиновая кислота	26.6
Феноловый красный	10	L-треонин	72	L-глютаминовая кислота	29,4
Пируват натрия	110	L-триптофан	15	L-пролин	23
L-аргинин HCL	189	L-тирозин 2Na 2H2O	54	Никотинамид	1,5
L-цистин 2HCL	36	L-валин	69	Пиридоксин Hcl	1,5
L-глютамин	292	D-Ca пантотенат	1,5	NaHCO3	1000
Глицин	15	Холинхлорид	1,5
L-гистидин HCL H2O	63	Фолиевая кислота	1.5

В настоящем изобретении, основную среду предпочтительно обогащают FGF-B (Фактор роста фибробластов), аскорбиновой кислотой, EGF (эпидермальный фактор роста), гидрокортизоном, IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста-1) или VEGF (Фактор роста эндотелия сосудов) и гепарином и необязательно GA-1000 (Гентамицина сульфат, Амфотерицин-B), если необходимо.

Более предпочтительно, основную среду обогащают 20% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), bFGF (Фактор роста фибробластов) 1~40 нг/мл, аскорбиновой кислотой 0,1~5,0 мкг/мл, EGF (эпидермальный фактор роста) 1~40 нг/мл, гидрокортизоном 0,1~1 мкг/мл, IGF-I (инсулиноподобный фактор роста-1) 1~40 нг/мл или VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) 1~5 нг/мл и гепарином 20~25 мкг/мл и необязательно GA-1000 (Гентамицина сульфат, Амфотерицин-B), если необходимо.

После культивирования в течение трех суток, моноциты, которые остались в суспензии, удаляли, и подвергали культивированию только прикрепленные клетки. Среди моноцитов, прикрепленных к сосуду, пролиферируют только стволовые клетки. Через 12-20 суток после выделения можно наблюдать быструю пролиферацию стволовых клеток. В связи с этим, предпочтительно заменять среду свежей каждые двое или трое суток.

Для получения из культуры происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток можно использовать FACS с использованием проточного цитометра с функцией сортировки (Int. Immunol., 10(3):275, 1998), магнитные шарики или способ пэннинга, основанный на специфичности антител к мезенхимальным стволовым клеткам (J. Immunol., 141(8):2797, 1998). Для получения плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток из массовой культуры можно использовать колонку, на которой по отдельности или в комбинации иммобилизованы антитела, специфичные для молекул, экспрессированных на клеточной поверхности (далее в настоящем документе, обозначаемые как «поверхностный антиген»).

Проточную цитометрию с сортировкой клеток можно выполнять посредством электростатической зарядки капель или «улавливания» клеток. В обоих процессах антитела, специфично распознающие поверхностный антиген, метят флуоресцентной меткой, после чего измеряют интенсивность флуоресценции меченого конъюгата антитело-антиген и сигнал переводят в электрические сигналы для определения уровня экспрессии антигена на поверхности клеток. Дополнительно, различные виды флуорофоров можно использовать в комбинации для разделения клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены. Среди флуорофоров представлены FITC (флуоресцеинизотиоцианат), PE (фикоэритрин), APC (алло-фикоцианин), TR (TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color и QuantumRed.

В FACS с использованием проточного цитометра, стволовые клетки, собранные из культуры, например, центрифугированием, могут подвергаться прямому иммуноокрашиванию с антителом или пролиферировать в подходящей среде перед иммуноокрашиванием с антителом. Для иммуноокрашивания образец клетки-мишени смешивают с первичным антителом, специфичным для поверхностного антигена, и инкубируют в течение 0,5-1 часа на льду. Если первичное антитело помечено флуорофором, клеточный образец промывают и разделяют в проточном цитометре. Если первичное антитело не помечено флуорофором, клеточный образец, обработанный первичным антителом, промывают и смешивают с флуоресцентно меченным вторичным антителом, которое может связываться с первичным антителом. Затем иммуноокрашенные клетки вновь инкубируют в течение от 0,5 до 1 часа на льду и промывают перед разделением посредством проточного цитометра.

Происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки, выделенные по настоящему изобретению, обладают по меньшей мере одним из следующих свойств:

(a) демонстрируют положительную иммунологическую характеристику по отношению к факторам транскрипции c-myc и ZNF281;

(b) прикрепляются к поверхности покрывающего внеклеточного матрикса и через 5-30 суток после прикрепления образуют клеточные колонии веретенообразной или сферической формы;

(c) демонстрируют CPDL (кумулятивный уровень удвоения популяций) от 30 до 45;

(d) демонстрирует негативную иммунологическую характеристику в отношении CD14, CD31, CD34, CD45 и HLA-DR;

(e) способность к дифференцировке в мезодермальные, эндодермальные и эктодермальные клетки;

(f) секретируют по меньшей мере один цитокин или хемокин, выбранный из группы, состоящей из TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, ЭОТАКСИН, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, лептин, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI, и PFGF-bb.

Факт того, что полученные из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению остаются недифференцированными, очевиден из наличия экспрессии Oct-4, Sox-2, Rex-1, c-myc и ZNF281 в стволовых клетках.

Кроме того, демонстрирующие CPDL (кумулятивный уровень удвоения популяций) от 30 до 45, полученные из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению являются высоко пролиферативными. Анализ кариотипа показал, что клетки по настоящему изобретению активно пролиферируют, но обладают нормальной хромосомной структурой.

Происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению являются иммунологически негативными в отношении CD14, CD31, CD34, CD45 и HLA-DR, каждый из которых известен как маркер гематопоэтических стволовых клеток или связанный с иммунным отторжением маркер. Вследствие отсутствия подобных маркеров гемопоэза или маркеров, связанных с иммунным отторжением, полученные из пуповинной крови стволовые клетки по настоящему изобретению можно трансплантировать с минимальной васкуляризацией и иммунным отторжением и таким образом можно эффективно использовать в аллогенной трансплантации.

Происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению также могут дифференцировать в гепатоциты из клеток, родственных мезодермальным клеткам, нейронам и клеткам сетчатой оболочки глаза из эктодермы, а также из мезодермы, в остеобласты, хондроциты и адипоциты. Таким образом, происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению можно использовать для лечения различных заболеваний.

Дополнительно, происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению могут секретировать различные цитокины или хемокины, включающие TIMP-2, TGF-β, RANTES CINC-3, ЭОТАКСИН, GM-CSF, IFN-γ, IL-1b, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, IL12p40, IL13, IL-16, IP-10, Лептин, MCP-2, MIG, MIP-3a, b-NGFm, sTNFRI и PFGF-bb. Происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению, обладающие способностью к секреции таких цитокинов или хемокинов, можно использовать для лечения различных заболеваний.

Новая особенность происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению происходит из того, что эти клетки обладают перечисленными выше характеристиками.

Как описано выше, происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению могут дифференцироваться в различные типы клеток, включающие остеобласты, хондроциты, адипоциты, гепатоциты и нейроны, и таким образом находить применения в терапии различных соответствующих заболеваний. Таким образом, настоящее изобретение относится к средству клеточной терапии, включающему происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению или дифференцированные из них клетки. Средство клеточной терапии по настоящему изобретению можно применять для лечения различных заболеваний, включающих, например, заболевания нервной системы (например, дегенеративные заболевания нервной системы), остеоартрит (например, дегенеративный артрит, ревматоидный артрит), остеопороз (например, остеопороз), заболевания печени (например, цирроз печени), и сердечно-сосудистые заболевания.

Предпочтительно, средство клеточной терапии по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один разбавитель, который может защищать и поддерживать жизнеспособность клеток. В качестве разбавителей можно использовать буферные растворы, такие как физиологический раствор, PBS (фосфатно-солевой буфер), HBSS (уравновешенный солевой раствор Хэнка) и компоненты плазмы или сыворотки.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к среде для культивирования новых стволовых клеток. Среда основана на среде EGM-2 или SNU-1 и, если необходимо, обогащена 20% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), bFGF (фактор роста фибробластов) 1~40 нг/мл, аскорбиновой кислотой 0,1-5,0 мкг/мл, EGF (эпидермальный фактор роста) 1~40 нг/мл, гидрокортизоном 0,1~1 мкг/мл, IGF-I (инсулиноподобный фактор роста-1) 1~40 нг/мл или VEGF (фактор роста эндотелия сосудов) 1~5 нг/мл и гепарином 20~25 мкг/мл, и необязательно GA-1000 (гентамицина сульфат, амфотерицин-B).

Среда для культивирования стволовых клеток является новой и используется в способе выделения происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению. Дополнительно, среда для культивирования по настоящему изобретению является пригодной для пролиферации всех стволовых клеток взрослых, включая происходящие из пуповинной крови стволовые клетки, и применима для культивирования стволовых клеток взрослых.

Согласно дополнительному аспекту настоящее изобретение относится к способу культивирования стволовых клеток, где способ включает культивирование и пролиферацию стволовых клеток в среде по настоящему изобретению. Предпочтительно, стволовые клетки могут представлять собой стволовые клетки взрослых.

В одном из вариантов осуществления среду для культивирования стволовых клеток в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для культивирования происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению. При культивировании в среде по настоящему изобретению, полученные из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению можно подвергать пассированию предпочтительно через 3-5 суток после образования клеточных колоний веретенообразной формы. Культивирование предпочтительно осуществляют в условиях 5% CO₂ и его можно проводить в течение 5~30 суток, но настоящее изобретение не ограничено этими условиями.

В соответствии с еще одним аспектом, настоящее изобретение относится к способу увеличения «стволовости» стволовых клеток, для которого характерно использование сферической культуры или трехмерной культуры стволовых клеток, таким образом, культивируют стволовые клетки. Для трехмерной культуры предпочтительно используют MEF (эмбриональные клетки-фибробласты мыши). Дополнительно, стволовые клетки предпочтительно могут представлять собой взрослые стволовые клетки.

Как применяют в настоящем документе, термин «увеличение стволовости» обозначает образование колонии, подобной колонии эмбриональной стволовой клетки, или экспрессию на высоком уровне факторов транскрипции, таких как Oct4, Sox2 и т.д.

Полезные эффекты

При культивировании в присутствии фибронектина, как подробно описано выше, полученные из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки человека по настоящему изобретению активно пролиферируют без дифференцировки в течение продолжительного периода времени, по сравнению с общепринятыми стволовыми клетками взрослых. Кроме того, обладающие способностью к дифференцировки в различные типы клеток, такие как хондроциты, остеобласты и адипоциты, плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки по настоящему изобретению можно эффективно использовать для лечения традиционно неизлечимых заболеваний, а также заболеваний нервной системы, сердечно-сосудистых заболеваний и заболеваний костной системы.

Описание чертежей

На ФИГ.1 представлены фотографии, демонстрирующие колонии, образованные после того, как моноциты, выделенные из пуповинной крови человека, культивировали в течение 14, 15, 16, 17 и 18 суток (A, B, C, D и E соответственно) и клетки после 3 пассажа (F);

На ФИГ.2 представлен график, на котором изображен кумулятивный клеточный рост в зависимости от времени.

На ФИГ.3 представлены результаты кариотипического анализа после культивирования происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток в течение длительного периода времени.

На ФИГ.4 представлены цитограммы проточного цитометра, демонстрирующие профили экспрессии различных маркеров на происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению.

На ФИГ.5 представлены профили экспрессии различных маркеров недифференцированных клеток на происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению, как измерено посредством проточной цитометрии и иммуноокрашивания (A: цитограмма проточной цитометрии клеток, экспрессирующих Oct4, B: изображение подвергнутого иммуноокрашиванию Oct4, C: изображение окрашенного ядра в клетках, экспрессирующих Oct4, D: совмещенное изображение экспрессии Oct4 и окрашивания ядер).

На ФИГ.6 представлена экспрессия ZNF281 в terra-1, hUCB-MSC, AD-MSC и AM (верхняя вставка) и в hUCB-MSC после 3~9 пассажей (нижняя вставка), как проанализировано посредством FACS.

На ФИГ.7 представлена экспрессия ZNF281, Oct4, Sox2, c-myc и Rex-1, каждый из которых важен для поддержания недифференцированного состояния, у происходящих из пуповинной крови человека плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток по настоящему изобретению, как измерено посредством ОТ-ПЦР.

На ФИГ.8 представлены фотографии, показывающие дифференциацию происходящих из пуповинной крови человека плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток в остеобласты, адипоциты, хондроциты и нейроны (A: индуцированный к неостеогенной дифференцировке контроль после окрашивания ализариновым красным S, B: индуцированные к остеогенной дифференцировке клетки после окрашивания ализариновым красным S, C: индуцированный к неадипогенной дифференцировке контроль после окрашивания масляным красным O, D: индуцированные к адипогенной дифференцировке клетки после окрашивания масляным красным O, E: индуцированные к хондрогенной дифференцировке клетки после окрашивания толуидиновым синим, F: сгусток индуцированных к хондрогенной дифференцировке клеток, G: клетки, подвергнутые иммуноокрашиванию на относящиеся к нервной системе маркеры Tuj-1 и MAP2 после нейрогенной дифференцировки).

На ФИГ.9 представлены уровни РНК в происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клетках после индукции остеогенной дифференцировки и адипогенной дифференцировки, как измерено посредством RT-ПЦР (PPAR-γ и FABP-4 представляют собой маркеры адипогенной дифференцировки, и коллаген 1 типа представляет собой маркер остеогенной дифференцировки. PPAR-γ: γ-рецептор, активирующий пролиферацию пероксисом, FABP-4: белок-4, связывающий жирные кислоты, GAPDH: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа).

На ФИГ.10 представлены профили экспрессии связанных с сетчаткой глаза белков в происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клетках по настоящему изобретению.

На ФИГ.11 представлена секреция различных цитокинов в средах для культивирования происходящих из пуповинной крови человека плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, как проанализировано посредством микроматрицы антител (A: hUCB-MSC1, B: hUCB-MSC2, C: hUCB-MSC3, D: расположение антител, POS: положительный контроль, NEG: отрицательный контроль, GCSF: гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, GM-CSF: гранулоцитарно-моноцитарный колониестимулирующий фактор, ICAM-1: внутриклеточная молекула адгезии, IFN-γ: интерферон-γ, IL: интерлейкин, MCP: моноцитарный белок-хемоаттрактант, M-CSF: моноцитарный колониестимулирующий фактор, MIG: монокин, индуцированный интерфероном-гамма, MIP: макрофагальный белок воспаления, RANTES: регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными T-клетками, TGF-β: трансформирующий фактор роста-β, TNF: Фактор некроза опухоли, sTNFR: растворимый рецептор фактора некроза опухоли, PDGF-BB: полученный из тромбоцитов фактор роста-BB, TIMP2: тканевой ингибитор металлопротеиназ-2).

На ФИГ.12 и 13 представлены фотографии, демонстрирующие трехмерные культуры происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, с использованием способа сферической культуры и клетки STO и профили экспрессии факторов транскрипции Oct4 и Sox2, как измерено посредством ОТ-ПЦР (фиг.12: трехмерная культура происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток посредством способа сферической культуры, ФИГ.13: трехмерная культура происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток на клетках STO).

Способ изобретения

Лучшего понимания сущности изобретения можно достичь посредством следующих примеров, которые представлены для иллюстрации, но которые не следует рассматривать как ограничивающие настоящее изобретение.

ПРИМЕР 1: Культивирование, пролиферация и кариотипический анализ плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, происходящих из пуповинной крови

Образцы UCB доношенных детей (n=20) отбирали непосредственно после получения от матерей информированного согласия на проведение отбора. Образцы UCB доношенных детей смешивали с HetaSep (Stem cells Technologies INC, Vancouver, BC) для уменьшения количества эритроцитов. Далее получали моноциты посредством общепринятого центрифугирования в градиенте плотности Фиколла. Моноциты высевали из расчета плотности 1×10^5~8 клеток/лунку на 6-луночные планшеты, покрытые 0,1 мг/мл - 1 мг/мл фибронектина и сохраняли в SNU-1 или EGM-2 (Lonza), обогащенными EGM-2 SingleQuots, содержащим 20% FBS. EGM-2 SingQouts содержал гепарин, аскорбиновую кислоту, rhEGF, гидрокортизон, VEGF, rhFGF-B, R³-IGF-1 и GA-1000. Моноциты, которые через трое суток культивирования все еще оставались неприкрепленными, удаляли, кроме того, среду заменяли свежей каждые двое или трое суток.

Прикрепленные клетки, как наблюдали, образуют колонии, демонстрирующие веретенообразную морфологию через 5~30 суток после культивирования в условиях с 5% CO₂ (фиг.1A). Образовавшись, колонии быстро пролиферировали. Клетки суспендировали в 0,125% Трипсин-ЭДТА через 3~7 суток после образования колоний и переносили в новые планшеты, где продолжали поддерживание культуры клеток (ФИГ.1B, 1C, 1D, 1E и 1F). На ФИГ.1 представлены фотографии, демонстрирующие рост культивируемых клеток. Как видно из ФИГ.1, клеточная колония увеличивается с течением времени. Кроме того даже после пассажа морфология клеток оставалась одинаковой (ФИГ.1. выделение и пролиферация происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток. Колонии, образованные после того, как моноциты культивировали в течение 14 суток (A), 15 суток (B), 16 суток (C), 17 суток (D) и 18 суток (E) и клетки после 3 пассажа (F)).

Так как культивирование клеток продолжалось, то анализировали способность к пролиферации выделенных плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, происходящих из пуповинной крови, измеряя CPDL (кумулятивный уровень удвоения популяций) (Cristofalo et al., Proc.) Natl. Acad. Sci., USA 95, 1998). Клетки размножали делением надвое. Таким образом, уровень роста клеток можно определять периодом времени, которое необходимо одной клетке для разделения надвое, называемое временем удвоения. CDPL 10 обозначает 10 делений одной клетки, что приводит в результате к пролиферации одной клетки до приблизительно 1000 клеток. Одной из самых важных проблем традиционных происходящих из пуповинной крови стволовых клеток является то, что они имеют существенно более низкую способность к пролиферации по сравнению с мезенхимальными стволовыми клетками, полученными из жировой ткани или из костного мозга. Так как при клиническом применении требуется большое количество стволовых клеток, способность к пролиферации у стволовых клеток является важным параметром. Измерение проводили, как указано далее. Во-первых, происходящие из пуповинной крови плюрипотентные/мультипотентные стволовые клетки трех типов выделяли из различных образцов пуповинной крови и высевали на 100 планшетов из расчета плотности 2×10⁵ клеток и подвергали пассажам через равные промежутки времени от трех до четырех суток, так как клетки подлежали подсчету с использованием цитометра. Подсчет клеток проводили до прекращения роста клеток. На основе измерений количества клеток получали значения CPDL, согласно следующей математической формуле 1

[Математическая формула 1]

N_н/N_I=2^X или [log(N_H)-log(N_I)]/log(2)=X

где N_I обозначает количество клеток в первоначальной культуре; N_H обозначает количество клеток в условии насыщения при пассаже.

Значения CPDL рассчитывали, пока продолжали поддерживать культуру клеток. В качестве контроля для сравнения использовали hUCB-EPC (эндотелиальные клетки-предшественники, полученные из пуповинной крови человека). Результаты представлены на ФИГ.2. Как можно видеть из графика на ФИГ.2, для hUCB-EPC значение CPDL составляет приблизительно 20 в течение двух месяцев, в то время как значения CPDL всех происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток из трех различных образцов, как наблюдали, варьирует между 40 и 45. Эти численные значения показывают, что клетки могут теоретически расти до значения 10¹² в одной колонии.

В итоге, клетки со способностью к быстрой пролиферации могут стать злокачественными, демонстрирующими бурный рост. Став злокачественными, клетки, по-видимому, пролиферируют независимо от различных регуляторных сигналов в организме, и таким образом не могут быть использованы в качестве средства клеточной терапии и являются несовместимыми с целью исследования. Таким образом, необходимо определять, является ли нормальным хромосомный набор плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток, происходящих из пуповинной крови и выделенных по настоящему изобретению. В связи с этим, для исследования хромосом клеток проводили кариотипический анализ. Как можно видеть на ФИГ.3, обнаружили, что даже после 10 пассажа клетки обладают нормальной хромосомной структурой.

ПРИМЕР 2: Анализ поверхностного антигена происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток

Для анализа характеристик клеток, суспендированных в среде, осуществляли способ проточной цитометрии. Для фенотипирования поверхностных клеточных антигенов клетки, собранные после 3~4 пассажей, окрашивали антителом, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) или фикоэритрином (PE), и анализировали FACSAria (Becton Dickinson, NY).

Для анализа характеристик происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток (в частности, плюрипотентная/мультипотентная стволовая клетка), выделенных в настоящем изобретении, использовали поверхностные антигены, которые включали CD10 (маркер T-клеток), CD14 (маркер моноцитов), CD24 (маркер эпителиальных клеток), CD29 (маркер моноцитов), CD31 (маркер эндотелиальных клеток), CD34 (маркер гематопоэтических стволовых клеток), CD44 (маркер мезенхимальных стволовых клеток), CD45 (маркер негематопоэтических стволовых клеток), CD51/61 (маркер остеокластов), CD73 (маркер мезенхимальных стволовых клеток), CD90 (маркер мезенхимальных стволовых клеток), CD105 (маркер мезенхимальных стволовых клеток), CD133 (маркер гематопоэтических стволовых клеток) и HLA-DR (маркер иммунного отторжения) и анализировали с использованием проточного цитометра. Результаты суммированы в таблице 2 и графически представлены на ФИГ.4.

Таблица 2
Антиген CD на поверхности плюрипотентных/мультипотентных стволовых клеток	Количество положительно окрашенных клеток/суммарное количество клеток (%)
CD10	0,2±0,1
CD14	2,0±1,0
CD24	68,7±2,9
CD29	100±0,0
CD31	0,4±0,7
CD34	3,5±3,4
CD44	100±0,1
CD45	0,0±0,1
CD51/61	6,4±10,8
CD73	99,6±0,5
CD90	99,7±0,3
CD105	99,5±0,8
CD133	0,1±0,1
HLA-DR	2,0±3,2

ПРИМЕР 3: Профиль экспрессии ZNF281 и основного фактора транскрипции в происходящих из пуповинной крови плюрипотентных/мультипотентных стволовых клетках

ZNF281 (белок 281 «цинковые пальцы») является одним из основных факторов транскрипции ESC (Wang J et al. (2006) Nature 444, 364-368). ZNF281, также называемый ZBP-99, содержит четыре Kruppel-подобных «цинковых пальца», которые в совокупности разделяют 91% сходности аминокислотной последовательности и 79% идентичности последовательности с Kruppel-подобными «цинковыми пальцами», найденными в ZBP-89. Кроме того, существуют высококонсервативные аминокислотные последовательности в карбоксиконцевых сегментах двух генов. Предполагаемая открытая рамка считывания кДНК ZNF281 кодирует белок массой 99 кДа. EMSA (анализ сдвига электрофоретической подвижности) показал, что белок ZNF281 специфически связывается с богатыми GC последовательностями промоторными элементами генов GASTRIN и ОРНИТИН-ДЕКАРБОКСИЛАЗЫ (Law DJ et al. (1999) Biochem Biophys Res Commun 262, 113-120; Lisowsky T et al. (1999) FEBS Lett 453, 369-374). ZNF281 идентифицировали как белок, связанный с c-MYC посредством техники масс-спектрометрической многомерной белковой идентификации и тандемной аффинной очисткой (Koch HB et al. (2007) Cell Cycle 6, 205-217.).

Как известно, гены Oct3/4, такие как семейство факторов транскрипции POU, не присутствуют в дифференцированных тканях, но экпрессируются, в частности, в недифференцированных стволовых клетках, которые обладают высокой пролиферативной способностью (Tai M-H. et al., Carcinogenesis 26:4 95, 2005; Tondreau T. et al., Stem cells, 23:1105, 2005). Таким образом, Oct3/4 в основном используют в качестве маркеров для эмбриональных стволовых клеток и