Аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие аминокислотную замену в положении 59

Аналоги инсулиноподобного фактора роста-1 (igf-1), содержащие аминокислотную замену в положении 59

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым аналогам инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), к фармацевтическим композициям, содержащим указанные аналоги, и к применению указанных аналогов для лечения состояний, опосредованных IGF-1-рецептором, таких как низкорослость, терапии диабета, лечения нейродегенеративных заболеваний и для восстановления хряща. Более конкретно, настоящее изобретение относится к новым аналогам IGF-1, содержащим аминокислотную замену в положении 59, например (Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH и другую(ие) замену(ы), как это определено в описании.

Предшествующий уровень техники

IGF-1 представляет собой полипептидный гормон длиной 70 аминокислот, характеризующийся инсулиноподобной и митогенной ростовой биологической активностью. Данный гормон усиливает рост клеток в различных тканях, включая мышечно-скелетные системы, печень, почки, кишечник, ткани нервной системы, сердце и легкие.

IGF-1 дикого типа имеет следующую аминокислотную последовательность с тремя межцепочечными дисульфидными мостиками, где боковые цепи каждой пары остатков A⁶ и A⁴⁸, A⁴⁷ и A⁵² и A¹⁸ и A⁶¹ образуют дисульфидную связь (SEQ ID NO:50):

Хотя IGF-1 присутствует в разнообразных тканях организма, обычно он находится в неактивной форме, в которой он связан с IGF-связывающим белком (IGFBP). Известны шесть родственных IGFBP, и их обозначают IGFBP1-IGFBP6. См., например, Holly and Martin, "Insulin-like Growth Factor Binding Proteins: A Review of Methodological Aspects of Their Purification, Analysis and Regulation," Growth Regul., 4(Suppl 1):20-30 (1994). IGFBP играют важную роль в регуляции IGF-1 за счет наличия ингибиторного и/или стимулирующего эффектов на действие IGF-1. Например, примерно 90% циркулирующего IGF-1 присутствует в тримолекулярном комплексе, содержащем IGFBP-3 и чувствительную к кислотности дополнительную молекулу. IGF-1 в составе таких комплексов не может связываться с поверхностными рецепторами, и поэтому он не активен биологически. IGF-1, присутствующий в составе тримолекулярного комплекса, также характеризуется существенно более продолжительным периодом полужизни, чем не входящий в комплекс IGF-1.

Нарушение действия IGF-1 может вносить вклад в некоторые физиологические нарушения, включая нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь двигательного нейрона (т.е. боковой амиотрофический склероз (ALS)), мышечная дистрофия и рассеянный склероз, заболевания хрящей, такие как остеоартрит, костные заболевания, такие как остеопороз, воспалительные заболевания, такие как ревматоидный артрит, ишемические повреждения органов, таких как сердце, головной мозг или печень, и так далее.

Как хорошо известно специалистам в данной области, известные и потенциальные варианты применения IGF-1 разнообразны и многочисленны. Например, в ряде исследований сообщается о применении IGF-1 в качестве потенциального терапевтического средства для лечения нейродегенеративных состояний. См., например, Kanje et al., Brain Res., 486:396-398 (1989); Hantai et al., J. Neurol. Sci., 129:122-126 (1995); Contreras et al., Pharmac. Exp. Therap., 274:1443-1499 (1995); Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 22:1960 (1996); Di Giulio et al., Society for Neuroscience, 23:894 (1997); Hsu et al., Biochem. Mol. Med., 60(2):142-148 (1997); Gorio et al., Neuroscience, 82:1029-1037 (1998). Терапия IGF-1 показана при многих неврологических состояниях, включая ALS, инсульт, эпилепсию, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, острое травматическое повреждение и другие нарушения, ассоциированные с травмой, старением, заболеванием или повреждением. См., например, патенты США № 5093137; 5652214; 5703045; международные публикации WO 90/1483 и WO 93/02695.

Применение терапии IGF-1 при различных других состояниях упоминается в ряде публикаций. См. например, Schalch et al., "Modern Concepts of Insulin-Like Growth Factors," ed. Spencer (Elsevier, New York), p. 705-714 (1991); Clemmons and Underwood, J. Clin. Endocrinol. Metab., 79(1):4-6 (1994); и Langford et al., Eur. J. Clin. Invest., 23(9):503-516 (1993) (относящиеся, например, к резистентным к инсулину состояниям и диабету); и O'Shea et al., Am. J. Physiol., 264:F917-F922 (1993) (относящаяся, например, к почечной недостаточности). Также см. патент США № 7258864 (относящийся к низкорослости); патенты США № 5110604 и 5427778 (относящиеся, например, к заживлению ран); патент США № 5126324 (относящийся, например, к сердечным заболеваниям и задержке роста); патент США № 5368858 (относящийся, например, к дефектам или повреждениям хряща); патенты США № 5543441 и 5550188 (относящиеся, например, к косметической пересадке ткани); патент № 5686425 (относящийся, например, к ткани шрамов, локализованной мышечной дисфункции и недержанию мочи); и патент США № 5656598 (относящийся, например, к росту кости). Также см. международные публикации WO 91/12018 (относящуюся, например, к заболеваниям кишечника); WO 92/09301 и WO 92/14480 (относящиеся, например, к заживлению ран); WO 93/08828 (относящуюся, например, к повреждению нейронов, ассоциированному с ишемией, гипоксией или нейродегенерацией); WO 94/16722 (относящуюся, например, к устойчивости к инсулину); WO 96/02565A1 (относящуюся, например, к комплексу IGF/IGFBP для стимуляции образования кости и для регуляции реструктурирования кости); публикацию заявки на выдачу патента США 2003/0100505 (относящуюся, например, к остеопорозу) и публикацию заявки на выдачу патента США 2005/0043240 (относящуюся к ожирению).

Хотя терапию IGF-1 используют для ряда физиологических показаний, результаты иногда непредсказуемы. Краткосрочные благоприятные эффекты иногда не сохраняются (см., например, Miller et al., Kidney International, 46:201-207 (1994)), и могут возникать неблагоприятные побочные эффекты, в частности, от введения высоких доз и/или длительного введения (см., например, Jabri et al., Diabetes, 43:369-374 (1994); Wilton, Acta Paediatr., 393:137-141 (1992)). Также сообщалось, что высокие концентрации IGF-1 повышают риск рака предстательной железы (Chan et al., Science, 278:563-566 (1998)).

В соответствии с этим в данной области существует потребность в лучших путях лечения состояний, которые реагируют на IGF-1 и/или другие белки, которые связываются с белками, связывающими инсулиноподобный фактор роста. Настоящее изобретение удовлетворяет данные потребности и дополнительно предоставляет другие связанные с ними преимущества.

Сущность изобретения

Как обнаружено авторами настоящего изобретения, за счет замены остатка метионина в положении 59 IGF-1 дикого типа, который является химически нестабильным и может легко окисляться другой аминокислотой, как описано в настоящем документе, например, (Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH, полученные в результате аналоги IGF-1 становятся химически более стабильными и как таковые менее чувствительными к окислению во время продукции, очистки, хранения и т.д.

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к пептидным вариантам (т.е. аналогам) IGF-1 следующей формулы (I):

в которой:

A^-1 представляет собой Met, Ser или делетирована;

A¹ представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или делетирована;

A² представляет собой Pro, Ala, Arg, Asp, Gln, Glu, Lys или делетирована;

A³ представляет собой Glu, Ala, Asp, Gln или делетирована;

A⁴ представляет собой Thr, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Ser;

A⁵ представляет собой Leu, Acc, Ala, Ile или Val;

A⁶ представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A⁷ представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A⁸ представляет собой Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A⁹ представляет собой Glu, Ala, Asp или Gln;

A¹⁰ представляет собой Leu, Acc, Ala, Ile или Val;

A¹¹ представляет собой Val, Ala, Ile или Leu;

A¹² представляет собой Asp, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu или Lys;

A¹³ представляет собой Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu или Val;

A¹⁴ представляет собой Leu, Acc, Ala, Ile или Val;

A¹⁵ представляет собой Gln, Ala, Asn, Asp или Glu;

A¹⁶ представляет собой Phe, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Trp или Tyr;

A¹⁷ представляет собой Val, Ala, Ile или Leu;

A¹⁸ представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A¹⁹ представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A²⁰ представляет собой Asp, Ala, Asn, Gln или Glu;

A²¹ представляет собой Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A²² представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A²³ представляет собой Phe, Ala, Trp или Tyr;

A²⁴ представляет собой Tyr, Ala, Phe или Trp;

A²⁵ представляет собой Phe, Ala, Trp или Tyr;

A²⁶ представляет собой Asn, Ala, Asp, Gln, Glu, Ser или Thr;

A²⁷ представляет собой Lys, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu или Pro;

A²⁸ представляет собой Pro, Ala, Arg или Lys;

A²⁹ представляет собой Thr, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Ser;

A³⁰ представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A³¹ представляет собой Tyr, Ala, Phe или Trp;

A³² представляет собой Gly, Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A³³ представляет собой Ser, Ala, Thr или Val;

A³⁴ представляет собой Ser, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Thr;

A³⁵ представляет собой Ser, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Thr;

A³⁶ представляет собой Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A³⁷ представляет собой Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A³⁸ представляет собой Ala, Asn, Asp, Gln или Glu;

A³⁹ представляет собой Pro, Ala, Arg или Glu;

A⁴⁰ представляет собой Gln, Ala, Asn, Asp или Glu;

A⁴¹ представляет собой Thr, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Ser;

A⁴² представляет собой Gly, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A⁴³ представляет собой Ile, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A⁴⁴ представляет собой Val, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu или Lys;

A⁴⁵ представляет собой Asp, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu или Lys;

A⁴⁶ представляет собой Glu, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln или Lys;

A⁴⁷ представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A⁴⁸ представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A⁴⁹ представляет собой Phe, Ala, Arg, Ile, Leu, Lys, Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;

A⁵⁰ представляет собой Arg, Ala, Lys, Ser или Thr;

A⁵¹ представляет собой Ser, Aib, Ala, Arg, Lys или Thr;

A⁵² представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A⁵³ представляет собой Asp, Ala, Arg, Asn, Gln, Glu, Lys, Ser или Thr;

A⁵⁴ представляет собой Leu, Acc, Ala, Ile или Val;

A⁵⁵ представляет собой Arg, Ala, Ile, Leu, Lys, Phe, Trp, Tyr или Val;

A⁵⁶ представляет собой Arg, Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или Lys;

A⁵⁷ представляет собой Leu, Acc, Ala, Ile или Val;

A⁵⁸ представляет собой Glu, Acc, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln или Lys;

A⁵⁹ представляет собой Acc, Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu, Lys, Nle, Ser, D-Ser, Thr, Trp, Tyr или Val;

A⁶⁰ представляет собой Tyr, Ala, Phe или Trp;

A⁶¹ представляет собой Cys, D-Cys, hCys, D-hCys, β-Me-Cys, D-β-Me-Cys, N-Me-Cys, D-N-Me-Cys, Ala, Pen или D-Pen;

A⁶² представляет собой Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu или Val;

A⁶³ представляет собой Pro, D-Pro, Ala, Ser, Thr или делетирована;

A⁶⁴ представляет собой Leu, D-Leu, des-Leu, Ala, Ile, Val или делетирована;

A⁶⁵ представляет собой Lys, D-Lys, des-Lys, Ala, Arg, Ile, Leu, Val или делетирована;

A⁶⁶ представляет собой Pro, D-Pro, Ala или делетирована;

A⁶⁷ представляет собой Ala, D-Ala, Aib или делетирована;

A⁶⁸ представляет собой Lys, D-Lys, Ala, Arg, Ile, Leu, Val или делетирована;

A⁶⁹ представляет собой Ser, D-Ser, Aib, Ala, Thr или делетирована;

A⁷⁰ представляет собой Ala, D-Ala, Asn, Asp, Gln, Glu или делетирована;

A⁷¹ представляет собой Asn, Ala, Asp, Gln, Glu, Lys, Ser, Thr или делетирована; и

R¹ представляет собой OH или NH₂;

при условии, что боковые цепи каждой пары остатков A⁶ и A⁴⁸, A⁴⁷ и A⁵² и A¹⁸ и A⁶¹ образуют дисульфидную связь; и

также при условии, что, когда A⁵⁹ представляет собой Leu, Ile, Nle, Thr или Val, аналог содержит по меньшей мере одну дополнительную аминокислотную замену или вставку, определенную в настоящем документе.

В формуле (I) предпочтительные аминокислотные замены и дополнения определены следующим образом:

A^-1 представляет собой Met, Ser или делетирована;

A¹ представляет собой Gly или делетирована;

A² представляет собой Pro, Lys или делетирована;

A³ представляет собой Glu или делетирована;

A⁴ представляет собой Thr;

A⁵ представляет собой Leu;

A⁶ представляет собой Cys, hCys, β Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A⁷ представляет собой Gly;

A⁸ представляет собой Ala;

A⁹ представляет собой Glu;

A¹⁰ представляет собой Leu;

A¹¹ представляет собой Val;

A¹² представляет собой Asp;

A¹³ представляет собой Ala;

A¹⁴ представляет собой Leu;

A¹⁵ представляет собой Gln;

A¹⁶ представляет собой Phe;

A¹⁷ представляет собой Val;

A¹⁸ представляет собой Cys, hCys, β-Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A¹⁹ представляет собой Gly;

A²⁰ представляет собой Asp;

A²¹ представляет собой Arg;

A²² представляет собой Gly;

A²³ представляет собой Phe;

A²⁴ представляет собой Tyr;

A²⁵ представляет собой Phe;

A²⁶ представляет собой Asn;

A²⁷ представляет собой Lys, Arg или Pro;

A²⁸ представляет собой Pro или Lys;

A²⁹ представляет собой Thr;

A³⁰ представляет собой Gly;

A³¹ представляет собой Tyr;

A³² представляет собой Gly;

A³³ представляет собой Ser;

A³⁴ представляет собой Ser;

A³⁵ представляет собой Ser;

A³⁶ представляет собой Arg;

A³⁷ представляет собой Arg;

A³⁸ представляет собой Ala;

A³⁹ представляет собой Pro;

A⁴⁰ представляет собой Gln;

A⁴¹ представляет собой Thr;

A⁴² представляет собой Gly;

A⁴³ представляет собой Ile;

A⁴⁴ представляет собой Val;

A⁴⁵ представляет собой Asp;

A⁴⁶ представляет собой Glu;

A⁴⁷ представляет собой Cys, hCys, β-Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A⁴⁸ представляет собой Cys, hCys, β-Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A⁴⁹ представляет собой Phe, Arg, Leu или Thr;

A⁵⁰ представляет собой Arg или Ser;

A⁵¹ представляет собой Ser, Aib, Arg или Thr;

A⁵² представляет собой Cys, hCys, β-Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A⁵³ представляет собой Asp, Arg или Ser;

A⁵⁴ представляет собой Leu или A6c;

A⁵⁵ представляет собой Arg или Tyr;

A⁵⁶ представляет собой Arg или Gln;

A⁵⁷ представляет собой Leu;

A⁵⁸ представляет собой Glu или Arg;

A⁵⁹ представляет собой A6c, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu, Nle, Ser, D-Ser, Trp или Tyr;

A⁶⁰ представляет собой Tyr или Phe;

A⁶¹ представляет собой Cys, hCys, β-Me-Cys, N-Me-Cys или Pen;

A⁶² представляет собой Ala или Asn;

A⁶³ представляет собой Pro, D-Pro, Thr или делетирована;

A⁶⁴ представляет собой Leu, D-Leu, des-Leu или делетирована;

A⁶⁵ представляет собой Lys, D-Lys, des-Lys, Arg или делетирована;

A⁶⁶ представляет собой Pro, D-Pro или делетирована;

A⁶⁷ представляет собой Ala, D-Ala, Aib или делетирована;

A⁶⁸ представляет собой Lys, D-Lys, Arg или делетирована;

A⁶⁹ представляет собой Ser, D-Ser, Aib, Thr или делетирована;

A⁷⁰ представляет собой Ala, D-Ala, Glu или делетирована; и

A⁷¹ представляет собой Asp, Glu, Lys, Ser или делетирована.

Подмножество соединений, охватываемое формулой (I), включает соединения, в которых A⁵⁹ представляет собой Asn.

Другое подмножество соединений, охватываемое формулой (I), включает соединения, в которых A⁵⁹ представляет собой Leu, где указанные соединения содержат по меньшей мере одну дополнительную аминокислотную замену или вставку, выбранную из группы, состоящей из Arg²⁷, Arg⁶⁵, Arg⁶⁸, Leu⁴⁹, β-Me-Cys⁴⁷, β-Me-Cys⁵², Thr⁵¹, Thr⁶⁹, Asp⁷¹, Glu⁷¹, Lys⁷¹ и Ser⁷¹.

Еще одно подмножество соединений, охватываемое формулой (I), включает соединения, в которых A⁵⁹ представляет собой Nle, где указанные соединения содержат по меньшей мере одну дополнительную аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из Aib⁵¹, Aib⁶⁷, Aib⁶⁹, A6c⁵⁴, N-Me-Cys⁴⁷, N-Me-Cys⁴⁸, Pen⁵² и Pen⁶¹.

Еще одно подмножество соединений, охватываемое формулой (I), включает соединения, в которых A⁵⁹ представляет собой Ile, где указанные соединения содержат по меньшей мере одну аминокислотную замену, выбранную из группы, состоящей из Arg⁵⁸, Arg⁴⁹, Arg⁵¹ и Arg⁵³.

Еще одно подмножество соединений, охватываемое формулой (I), включает соединения, в которых A⁵⁹ представляет собой Arg, Asp, A6c, Gln, Glu, Ser, Trp или Tyr.

Предпочтительные соединения формулы (I) представляют собой:

Пример 1: (Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:1)

Пример 2: (Asn⁵⁹)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:2)

Пример 3: (Asn⁵⁹)hIGF-1(4-70)-OH; (SEQ ID NO:3)

Пример 4: (Pro²⁷, Lys²⁸, Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:4)

Пример 5: (Pro²⁷, Lys²⁸, Asn⁵⁹)hIGF-1(1-62)-OH; (SEQ ID NO:5)

Пример 6: (Ser⁵³, Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:6)

Пример 7: (Ser-Gly¹, Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:7)

Пример 8: (Asn⁵⁹, Thr⁶³, des-Leu⁶⁴, des-Lys⁶⁵, Glu⁷⁰)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:8)

Пример 9: (Tyr⁵⁵, Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:9)

Пример 10: (Thr⁴⁹, Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:10)

Пример 11: (Asn^59,62)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:11)

Пример 12: (Asn⁵⁹, Phe⁶⁰)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:12)

Пример 13: (Ser⁵⁰, Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:13)

Пример 14: (Gln⁵⁶, Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:14)

Пример 15: (Asn⁵⁹, D-Pro⁶³)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 16: (Asn⁵⁹, D-Leu⁶⁴)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 17: (Asn⁵⁹, D-Lys⁶⁵)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 18: (Asn⁵⁹, D-Pro⁶⁶)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 19: (Asn⁵⁹, D-Ala⁶⁷)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 20: (Asn⁵⁹, D-Lys⁶⁸)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 21: (Asn⁵⁹, D-Ser⁶⁹)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 22: (Asn⁵⁹, D-Ala⁷⁰)hIGF-1(1-70)-OH;

Пример 23: (Arg^27,65,68, Leu⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:15)

Пример 24: (Leu⁵⁹, Arg^65,68)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:16)

Пример 25: (Leu^49,59)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:17)

Пример 26: (β-Me-Cys⁵², Leu⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:18)

Пример 27: (β-Me-Cys⁴⁷, Leu⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:19)

Пример 28: (Leu⁵⁹, Glu⁷¹)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID N0:20)

Пример 29: (Leu⁵⁹, Asp⁷¹)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:21)

Пример 30: (Leu⁵⁹, Lys⁷¹)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:22)

Пример 31: (Leu⁵⁹, Ser⁷¹)hIGF-1(1-71)-OH; (SEQ ID NO:23)

Пример 32: (Leu⁵⁹, Thr⁶⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:24)

Пример 33: (Thr⁵¹, Leu⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:25)

Пример 34: (N-Me-Cys⁴⁷, Nle⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:26)

Пример 35: (Nle⁵⁹, Aib⁶⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:27)

Пример 36: (N-Me-Cys⁴⁸, Nle⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:28)

Пример 37: (Nle⁵⁹, Aib⁶⁷)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:29)

Пример 38: (hCys⁵², Nle⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQIDNO:30)

Пример 39: (Aib⁵¹, Nle⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID N0:31)

Пример 40: (Pen⁵², Nle⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:32)

Пример 41: (Nle⁵⁹, Pen⁶¹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:33)

Пример 42: (A6c⁵⁴, Nle⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:34)

Пример 43: (Arg⁵³, Ile⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:35)

Пример 44: (Arg⁴⁹, Ile⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:36)

Пример 45: (Arg⁵¹, Ile⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:37)

Пример 46: (Arg⁵⁸, Ile⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:38)

Пример 47: (A6c⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:39)

Пример 48: (Asp⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:40)

Пример 49: (Trp⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:41)

Пример 50: (Ser⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:42)

Пример 51: (Tyr⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:43)

Пример 52: (Glu⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:44)

Пример 53: (Gln⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:45)

Пример 54: (Arg⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH; (SEQ ID NO:46) и

Пример 55: (Met-Gly¹, Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH. (SEQ ID NO:47)

Подробное описание изобретения

В заявке используются следующие общепринятые сокращения:

Acc: 1-амино-1-цикло(C₃-C₉)алкилкарбоновая кислота

Acc включает:

A3c: 1-амино-1-циклопропанкарбоновую кислоту

A4c: 1-амино-1-циклобутанкарбоновую кислоту

A5c: 1-амино-1-циклопентанкарбоновую кислоту

A6c: 1-амино-1-циклогексанкарбоновую кислоту

Aib: α-аминоизомасляная кислота

Ala или A: аланин

Arg или R: аргинин

Asn или N: аспарагин

Asp или D: аспарагиновая кислота

Cys или C: цистеин

цистин: дисульфидный димер цистеина

hCys: гомоцистеин

β-Me-Cys: бета-метилцистеин, т.е.

(2S,3S)-2-амино-3-меркаптомасляная кислота

N-Me-Cys: N-метилцистеин

Gln или Q: глутамин

Glu или E: глутаминовая кислота

Gly или G: глицин

Ile или I: изолейцин

Leu или L: лейцин

des-Leu: делетированный Leu

Lys или K: лизин

des-Lys: делетированный Lys

Met или M: метионин

Nle: норлейцин

Pen: пеницилламин

Phe или F: фенилаланин

Pro или P: пролин

Ser или S: серин

Thr или T: треонин

Trp или W: триптофан

Tyr или Y: тирозин

Val или V: валин

Все сокращения (например, Ala) аминокислот в данном описании обозначают структуру -NR-CR'(R”)-CO-, в которой каждый из R' и R” независимо представляет собой водород или боковую цепь аминокислоты (например, R'=H и R”=CH₃ для аланина) и в которой R=H или CH₃, кроме пролина, т.е.

Пептид по данному изобретению также обозначают в настоящем документе в другом формате, например (Asn⁵⁹)hIGF-1(1-70)-OH (SEQ ID NO:1), с аминокислотами, замещенными по сравнению с природной последовательностью, размещенными между скобками (т.е. Asn вместо Met в положении 59 IGF-1 дикого типа). Интервал, находящийся в скобках, относится к тем аминокислотам, которые находятся в аналоге. Например, “IGF-1(4-68)-OH” (SEQ ID NO:48) указывает, что аналог содержит аминокислоты от 4 до 68, которые соответствуют пептидной последовательности IGF-1 дикого типа. “NH₂” в “IGF-1(1-70)-NH₂” (SEQ ID NO:49) указывает на то, что C-конец пептида амидирован. “IGF-1(1-70)” или “IGF-1(1-70)-OH” указывает на то, что C-конец представляет собой свободную кислоту (SEQ ID NO:50).

Некоторые другие сокращения, применяемые в настоящем документе, определены следующим образом:

Act: ацетонитрил

Boc: трет-бутилоксикарбонил

BSA: бычий сывороточный альбумин

DCM: дихлорметан

DIPEA: диизопропилэтиламин

DMEM: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла

ДМФА: диметилформамид

DTT: дитиотреитол

ESI: ионизация электрораспылением

FCS: эмбриональная телячья сыворотка

Fmoc: 9-флуоренилметилоксикарбонил

HBTU: гексафторфосфат 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония

HOBt: N-гидроксибензотриазол

ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография

LC-MS: жидкостная хроматография-масс-спектрометрия

MPAA: 4-меркаптофенилуксусная кислота

NMP: N-метилпирролидинон

OtBu: O-трет-бутиловый сложный эфир

Pbf: 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил

QC: контроль качества

tBu: трет-бутил

TCA: трихлоруксусная кислота

TCEP: трис-2-карбоксиэтилфосфин

TIS: триизопропилсилан

ТФУК: трифторуксусная кислота

Tris: 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол

Trt: тритил

УФ-спектроскопия: ультрафиолетовая спектроскопия

«Алкил» относится к углеводородной группе, содержащей один или несколько атомов углерода, где множественные атомы углерода, если они присутствуют, соединены одинарными связями. Примеры этой группы включают, но не ограничиваются ими, метил, этил, пропил и бутил. Алкильная углеводородная группа может быть линейной или может содержать одну или несколько ветвей или циклических групп, примеры которых включают, но не ограничиваются ими, изопропил и трет-бутил.

«Замещенный алкил» относится к алкилу, в котором один или несколько водородных атомов углеводородной группы заменены одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, OH, CN, SH, NH₂, NHCH₃, NO₂, (C_1-2)-алкила, замещенного 1-6 галогенами, CF₃, OCH₃, OCF₃ и (CH₂)_0-4-COOH. В других вариантах осуществления присутствуют 1, 2, 3 или 4 заместителя.

«Арил» относится к необязательно замещенной ароматической группе, по меньшей мере с одним кольцом, имеющим конъюгированную систему пи-электронов, содержащей до трех конъюгированных или конденсированных кольцевых систем. Арил включает карбоциклический арил, гетероциклический арил и биарильные группы. Предпочтительно, арил представляет собой 5- или 6-членное кольцо. Предпочтительные атомы для гетероциклического арила представляют собой один или несколько атомов серы, кислорода и/или азота. Примеры арила включают фенил, 1-нафтил, 2-нафтил, индол, хинолин, 2-имидазол и 9-антрацен. Арильные заместители выбирают из группы, состоящей из -C_1-20-алкила, -C_1-20-алкокси, галогена, -OH, -CN, -SH, -NH₂, -NO₂, -C_1-20-алкила, замещенного галогенами, -CF₃, -OCF₃ и -(CH₂)_0-20-COOH. В других вариантах осуществления арил содержит 0, 1, 2, 3 или 4 заместителя.

«Алкиларил» относится к «алкилу», присоединенному к «арилу».

Процедуры синтеза

Представленные в качестве примера аналоги IGF-1 по настоящему изобретению получали посредством первой стадии синтеза пептидных фрагментов, второй стадии сшивания (лигирования) и третьей стадии фолдинга. Следующие процедуры синтеза иллюстрируют, как специалист-химик может обеспечить получение любого из представленных в качестве примера аналогов IGF-1 по настоящему изобретению.

A) Синтез пептидного фрагмента (Gln ⁵⁶ , Asn ⁵⁹ )hIGF-1(48-70)-OH, т.е. Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu-Arg-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Ala-Pro-Leu-Lys-Pro-Ala-Lys-Ser-Ala-OH_(SEQ ID NO:51)

Основанный на Fmoc твердофазный пептидный синтез применяли для сборки указанного в заголовке пептидного фрагмента с использованием вспомогательной микроволновой обработки на пептидном синтезаторе Liberty (CEM; Matthews, NC, USA). Первый фрагмент из 14 остатков, например остатков 57-70 hIGF-1, или пептид из C-концевых кислот синтезировали в масштабе 1,0 ммоль с использованием Fmoc-Ala-смолы Ванга (0,72 мг-экв./г). Полученный в результате пептидный фрагмент затем разделяли на четыре партии по 0,25 ммоль для удлинения и разделения. Образец смолы массой 1,36 г помещали в коническую пробирку на 50 мл вместе с 15 мл раствора 1:1 ДМФА и DCM, которую загружали в заданное положение в синтезатор. Затем смолу переносили в реакционный сосуд посредством автоматического процесса синтезатора. Использовали стандартный протокол Liberty для масштаба 1,0 ммоль. Протокол включал удаление N-концевой защитной группы Fmoc путем обработки 20 мл 20% пиперидина, содержащего 0,1 M HOBt в ДМФА. Исходная стадия снятия защиты с помощью микроволновой энергии (45 ватт, максимальная температура 75°C) и барботирования азотом (3 секунды включено, 7 секунд выключено) продолжалась в течение 30 секунд. Из реакционного сосуда удаляли раствор и смолу тщательно промывали ДМФА несколько раз. Затем добавляли следующую аминокислоту (цикл 1), которую следовало присоединить к растущему пептиду (Fmoc-Ser(tBu)-OH), полученную в виде маточного раствора 0,2 M в ДМФА (15 мл, 3 эквивалента). Добавляли 6,0 мл 0,45 M (3 эквивалента) HBTU в ДМФА, после чего вносили 3,0 мл 2 M (6 эквивалентов) DIPEA в NMP. Стадию присоединения проводили с использованием микроволновой энергии (20 ватт, максимальная температура 75°C) с барботированием азотом в том же отношении, как на стадии снятия защиты, в течение периода 5 минут. Затем из реакционного сосуда удаляли раствор в слив и повторяли стадию присоединения.

Протокол присоединения для Fmoc-Cys(Trt)-OH представлял собой слегка модифицированную версию стандартного протокола. Для остатков Cys в течение первых 2 минут не использовали микроволновую энергию.

Затем следовал 4-минутный отрезок использования микроволновой энергии (20 ватт, максимальная температура 50°C). Все аминокислоты вводили одинаковым путем, используя стратегию двойного присоединения на всем протяжении целой последовательности. Циклы синтеза для указанного в заголовке пептидного фрагмента после первого Ser были следующими: цикл 2, Fmoc-Lys(Boc)-OH; цикл 3, Fmoc-Ala-OH; цикл 4, Fmoc-Pro-OH; цикл 5, Fmoc-Lys(Boc)-OH; цикл 6, Fmoc-Leu-OH; цикл 7, Fmoc-Pro-OH; цикл 8, Fmoc-Ala-OH; цикл 9, Fmoc-Cys(Trt)-OH; цикл 10, Fmoc-Tyr(tBu)-OH; цикл 11, Fmoc-Asn(Trt)-OH; цикл 12, Fmoc-Glu(OtBu)-OH; и цикл 13, Fmoc-Leu-OH.

Как только исходный пептидный фрагмент был завершен, смолу переносили обратно в коническую пробирку на 50 мл с использованием ДМФА в качестве растворителя. Смолу вручную равномерно разделяли на четыре образца, которые помещали в четыре конические пробирки на 50 мл, которые затем устанавливали обратно в синтезатор. Оставшуюся часть указанного в заголовке пептида синтезировали в масштабе 0,25 ммоль. Используемый протокол был тем же самым, как тот, который использовали для синтеза в большем масштабе, однако использовали меньшие количества реагентов. Удаление N-концевой защитной группы Fmoc состояло из обработки раствором, содержащим 10 мл 20% пиперидина и 0,1 M HOBt в ДМФА. Исходная стадия снятия защиты с помощью микроволновой энергии (45 ватт, максимальная температура 75°C) и барботирования азотом (3 секунды включено, 7 секунд выключено) продолжалась в течение 30 секунд. Затем из реакционного сосуда удаляли раствор и смолу тщательно промывали несколько раз ДМФА. Затем вводили следующую аминокислоту (цикл 14), полученную в виде 0,2 M маточного раствора в ДМФА (5,0 мл, 4 эквивалента), в растущий пептид (Fmoc-Gln(tBu)-OH). Затем добавляли 2,0 мл 0,45 M раствора (4 эквивалента) HBTU в ДМФА, после чего вносили 1,0 мл 2 M раствора (8 эквивалентов) DIPEA в NMP.

Протоколы присоединения для Fmoc-Cys(Trt)-OH и Fmoc-Arg(Pbf)-OH представляли собой слегка модифицированные версии стандартного протокола. Для присоединения остатков Cys микроволновую энергию вначале выключали на первые 2 минуты, затем включали на 4 минуты (20 ватт, максимальная температура 50°C). Для присоединения остатков Arg микроволновую энергию не использовали при первом присоединении, однако требовалась вторая стадия стандартного присоединения. В циклах 14, 16 и 21 использовали процедуру кэппинга, которая следовала непосредственно за стадией присоединения, включающей добавление 7 мл 0,5 M уксусного ангидрида, содержащего 0,015 M HOBt и 2 мл 2 M DIPEA, причем оба соединения были растворены в NMP, используя при этом многостадийный протокол микроволновой обработки (50 ватт в течение 30 секунд с максимальной температурой 65°C, затем без обработки в течение 30 секунд, 50 ватт в течение 30 секунд с максимальной температурой 65°C, затем без обработки в течение 30 секунд). Циклы синтеза для указанного в заголовке пептидного фрагмента после Gln были следующими: цикл 15, Fmoc-Arg(Pbf)-OH; цикл 16, Leu-OH; цикл 17, Fmoc-Asp(OtBu)-OH; цикл 18, Fmoc-Cys(Trt)-OH; цикл 19, Fmoc-Ser(tBu)-OH; цикл 20, Fmoc-Arg(Pbf)-OH; цикл 21, Fmoc-Phe-OH; и цикл 22, Fmoc-Cys(Trt)-OH.

После завершения пептидного остова удаляли N-концевую защитную группу Fmoc, а смолу вновь промывали ДМФА. Затем смолу переносили обратно в коническую пробирку на 50 мл с использованием ДМФА в качестве растворителя для переноса.

Смолу переносили в реакционный сосуд с фильтром из пористого стекла. Удаляли ДМФА и смолу интенсивно промывали DCM. Пептидный фрагмент отщепляли и освобождали от защиты обработкой следующим реагентом: 5% TIS : 5% вода : 90% ТФУК. Реакционную смесь оставляли инкубироваться в течение 3 часов при комнатной температуре и постоянном перемешивании. Затем раствор фильтровали в коническую пробирку на 50 мл. Уровень ТФУК снижали упариванием в потоке газообразного азота. Пептидный фрагмент осаждали добавлением 40 мл холодного простого этилового эфира с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут при 4°C в центрифуге с охлаждением (Sorvall Legend RT; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Полученный в результате осадок растворяли в 0,1% ТФУК в воде перед очисткой путем препаративной ВЭЖХ, укомплектованной колонкой с обращенной фазой C18 (Luna, 10 мкм, колонка 250×21,2 мм), с использованием градиента 0-60% ацетонитрила (0,1% ТФУК) в течение 50 минут при скорости потока 10 мл/мин. Очищенный пептидный фрагмент анализировали путем ВЭЖХ (Luna C18, 3 мкм, колонка 4,6×100 мм) с градиентом 5-80% ацетонитрила (0,08% ТФУК) в течение 30 минут со скоростью потока 1 мл/мин и путем масс-спектрометрии (LCQ Advantage; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Пептидный фрагмент затем лиофилизировали и хранили при -50°C для дальнейшего применения.

B) Синтез пептидного фрагмента hIGF-1(1-47)-тиоэфир, т.е. Gly-Pro-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Ala-Glu-Leu-Val-Asp-Ala-Leu-Gln-Phe-Val-Cys-Gly-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Asn-Lys-Pro-Thr-Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr-Gly-Ile-Val-Asp-Glu-Cys-тиоэфирпропионил-Leu-NH ₂ (SEQ ID NO:52)

N-концевой пептидный фрагмент, например остатки 1-47 hIGF-1, объединяли с использованием основанного на Boc-химии твердофазного пептидного синтеза. Для синтеза в масштабе 0,5 ммоль использовали пептидный синтезатор ABI 433A (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA), модифицированный для запуска стандартного протокола FastBoc. Реакционный сосуд, содержащий 0,645 мг 0,77 мг-экв./г смолы Tampal, помещали на синтезатор. Для набухания смолы вводили ДМФА. Протокол ABI FastBoc 0,5 использовали для получения фрагмента. Каждый цикл состоял из деблокирования N-концевой защитной группы Boc с помощью чистой ТФУК с последующей обильной промывкой ДМФА. Предварительно упакованные картриджи на 2,0 ммоль (4 эквивалента) каждой аминокислоты затем растворяли в 0,40 M HBTU и ДМФА. После полного растворения каждой аминокислоты раствор автоматически перемещали в емкость для активации. Раствор DIPEA (чистого) вводили в сосуд для активации и подвергали воздействию смолы в течение длительного периода. Реакционный сосуд опорожняли и смолу промывали ДМФА. Для картриджей Arg/Asn требовалось продолжительное время активации, чтобы гарантировать растворимость. Кроме того, любую аминокислоту, добавленную непосредственно после присоединения остатка Gln, промывали DCM до и после выполнения протокола деблокирования. Время присоединения составляло 30 минут. Следующие аминокислоты использовали для указанного в заголовке пептидного фрагмента: Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Asp(cHex)-OH, Boc-Glu(cHex)-OH, Boc-Asn(Xan)-OH, Boc-Cys(4Me-Bzl)-OH, Boc-Lys(ClZ)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Ser(OBzl)-OH, Boc-Thr(OBzl)-OH и Boc-Tyr(BrZ)-OH.

После последнего цикла присоединения смолу промывали DCM и сушили. С пептидного фрагмента снимали защиту и отщепляли его от смолы с использованием обработки 10 мл фтороводорода и анизола. Реакции давали проходить в течение 70 минут, причем к этому моменту фтороводород вымывали струей азота. Остаток промывали простым эфиром и затем пептид растворяли в 10-15 мл ТФУК. Пептидный фрагмент осаждали путем фильтрования ТФУК в 40 мл холодного простого этилового эфира с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут при 4°C в центрифуге с охлаждением (Sorvall Legend RT; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Полученный в результате осадок растворяли в 0,1% ТФУК в воде и очищали путем препаративной ВЭЖХ, укомплектованной колонкой с обращенной фазой C18 (Luna, 10 мкм, колонка 250×21,2 мм), с использованием градиента 20-40% ацетонитрила (0,1% ТФУК) в течение 120 минут со скоростью потока 10 мл/мин. Очищенный пептидный фрагмент анализировали путем ВЭЖХ (Luna C18, 3 мкм, колонка 4,6×100 мм) с градиентом 5-80% ацетонитрила (0,08% ТФУК) в течение 30 минут со скоростью потока 1 мл/мин и путем масс-спектрометрии (LCQ Advantage; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). Затем пептидный фрагмент лиофилизировали и хранили при -50°C для дальнейшего использования.

C) Общая процедура сшивания

Полноразмерные аналоги hIGF-1 конструировали способом химического сшивания, которое происходит в природе между N-концевым фрагментом со сложным тиоэфиром, например hIGF-1(1-47)-S-(CH₂)₂C(0)-Leu-NH₂ (SEQ ID NO:52), и C-концевым фрагментом, например (Gln⁵⁶, Asn⁵⁹)hIGF-1(48-70)-OH (SEQ ID NO:51), который содержит на своем N-конце остаток цистеина.

Для начала способа получения указанного в заголовке пептида 5,5 мг C-концевого фрагмента hIGF-1 растворяли в 0,5 мл буфера для сшивания (200 мМ фосфат натрия, pH 8,5, 6M гидрохлорид гуанидина) в пробирке Эппендорфа на 1,5 мл. К данному раствору добавляли 100 мкл раствора TCEP (40 мг/мл) и смесь встряхивали. Смесь переносили во вторую пробирку Эппендорфа, содержащую 6,5 мг N-концевого фрагмента hIGF-1 со сложным тиоэфиром. Реагенты тщательно смешивали. Небольшой образец (5 мкл) удаляли и анализировали путем LC-MS (LCQ Deca XP; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA). К реакционной смеси добавляли 100 мкл раствора MPAA (20 мг/мл) с последующим перемешиванием. Образцы (5 мкл) периодически извлекали, чтобы следить за процессом реакции с использованием LC-MS. Приблизительно через 3,5 часа, когда реакция была близка к завершению, смесь гасили и разбавляли добавлением 9,5 мл 0,1% ТФУК в воде. Продукт сшивания очищали путем полупрепаративной ВЭЖХ (Vydac 218TP101510, C18, 10-15 мкм, 10×250 мм) в градиенте 5-80% ацетонитрила (0,1% ТФУК) в течение 40 минут со скоростью потока 5 мл/мин. Пик продукта лиофилизировали и хранили при -50°C. Массу не подвергшегося фолдингу продукта сшивания определяли путем физического измерения.

D) Общая процедура фолдинга (окислительно-восстановительная пара глутатиона) для примера 14, т.е. (Gln ⁵⁶ , Asn ⁵⁹ )hIGF-1 (1-70)-OH (SEQ ID NO:14)

Белок, полученный в процессе сшивания на стадии C), как описано выше, растворяли в буфере для сшивания (200 мМ фосфат натрия, pH 8,5, 6M гидрохлорид гуанидина) до концентрации 1 мг/мл. Затем добавляли буфер для фолдинга (100 мМ Tris, pH 8,5, 1 мМ окисленный глутатион, 10 мМ восстановленный глутатион) до достижения конечной концентрации белка 0,25 мг/мл. Обеспечивали осуществление процесса фолдинга в течение 3 часов. После этого реакцию гасили путем добавления по каплям ТФУК до достижения в реакционной смеси pH ≤3. Затем продукт очищали путем полупрепаративной ВЭЖХ (Vydac 218TP101510, C18, 10-15 мкм, колонка 10×250 мм) в градиенте 5-60% ацетонитрила (0,1% ТФУК) в течение 40 минут со скоростью потока 5 мл/мин. Продукт лиофилизировали. Содержание белка определяли путем повторного растворения продукта в 0,1% ТФУК в воде, измеряя затем оптическую плотность при 280 нм (спектрофотометр NanoDrop ND1000). Затем белок анализировали для QC (ВЭЖХ и MS).

E) Процедура окисления для получения (глиоксилил-Gly ¹ , Asn ⁵⁹ )hIGF-1(1-70)-OH (SEO ID NO:53) из примера 7, т.е. (Ser-Gly ¹ , Asn ⁵⁹ )hIGF-1(1-70)OH (SEQ ID NO:7)