Scfv cинтетический аналог вариабельных участков моноклонального антитела 6313/g2 к рецептору ангиотензина ii типа 1

Scfv cинтетический аналог вариабельных участков моноклонального антитела 6313/g2 к рецептору ангиотензина ii типа 1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к scFv синтетическому аналогу (R6313/G2) вариабельных доменов моноклонального антитела 6313/G2 к рецептору ангиотензина II типа 1.

Ангиотензин II играет центральную роль в электролитном гомеостазе млекопитающих и регулировании кровяного давления (Peach Physiol. Rev 57 313-370 (1977); Vinson et al. "The Adrenal Cortex", Prentice Hall, Englefield Heights (1992)). Были обнаружены два основных типа рецепторов ангиотензина II, обозначенные как тип 1 и тип 2 (АТ1 и АТ2), однако большинство хорошо известных проявлений активности ангиотензина II происходит по механизму подтипа АТ1 (Herblin et al. Am. J. Hypertens. 4 299S-302S (1991); Ouali et al. J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. 43 271-280 (1992)).

Для изучения действия рецептора (Vinson et al. Mol. Med. Today 1 35-38 (1995)) применяли моноклональное антитело 6313/G2 к рецептору подтипа АТ1 (Barker et al. J. Mol. Endocrinol. 11 241-245 (1993)). Было предложено применять моноклональное антитело в качестве терапевтического агента для контроля сужения кровеносных сосудов, например, при лечении гипертензии или сокращения других клеток гладких мышц (например, матки).

Указанное антитело применяли в качестве специфического визуализирующего агента в различных тканях, например, при раке гортани (Marsigliante et al. Cancer Letters 110 19-27 (1996)), почек (Harrison-Bernard et al. Am. J. Physiol. 42 F170-F177 (1997); Cheng et al. J. Physiol. 43 F10-F17 (1998)) и головного мозга (Yang et al. J. Neuroscience 17 1660-1669 (1997)). Было показано, что данное антитело блокирует вызванную ангиотензином-II интернализацию рецептора АТ1 и активацию РКС (протеинкиназы С), но с другой стороны, стимулирует чувствительность к кальцию (Kapas et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 204 1292-1298 (1994); Vinson et al. J. Endocrinol. 141 R5-R9 (1994)). Сообщалось о присутствии рецепторов АТ1 и АТ2 в опухолях молочной железы, связываемом с местной выработкой ангиотензина (Inwang et al. Brit. J. Cancer 75 1279-1283 (1997); Tahmasebi et al. Eur. J. Cancer 34 1777-1782 (1998)).

Моноклональное антитело 6313/G2 секретируется гибридомной клеточной линией, депонированной 22 июля 1993 г. согласно Будапештскому договору в Европейскую коллекцию клеточных культур животных, Porton Down, Великобритания, с присвоением номера доступа 93072117. Депонирование было произведено доктором Gavin P Vinson и доктором Stewart Barker, отделение биохимии, колледжа Queen Mary & Westfield College, Mile End Road, Лондон Е1 4NS. Депонент уполномочил заявителя передать на рассмотрение материал, депонируемый в заявке, и предоставил его безусловное и безотзывное согласие на общедоступность в соответствии с Правилом 28(1)(d) Европейской Патентной Конвенции.

Данная гибридомная клеточная линия продуцирует антитело, которое специфично связывает аминокислотные остатки 8-17 рецептора АТ1 гладких мышц кровеносных сосудов крысы, данная последовательность была также обнаружена в рецепторе АТ1 клеток человека и быка. Эпитопная последовательность представляет собой следующую:

EDGIKRIQDD или альтернативно представлена в виде:

NH₂-Glu-Asp-Gly-Ile-Lys-Arg-Ile-Gln-Asp-Asp-COOH

Были получены моноклональные антитела к пептидной последовательности, содержащей N-концевую последовательность рецептора ангиотензина II типа 1 (Barker et al. Journal of Molecular Endocrinology 11 241-245 (1993); WO 95/09186). Сообщалось, что такие моноклональные антитела могут найти дополнительное терапевтическое применение при некоторых медицинских состояниях, где возможность такого терапевтического применения ранее не предполагалась или не была показана (WO 2004/018519). Предполагается, что такие терапевтические эффекты состоят в способности моноклональных антител блокировать вредное действие ангиотензина II при имеющих отношение к ангиотензину II медицинских состояниях, в то же время сохраняя полезные эффекты данной молекулы.

К настоящему времени было показано, что scFv синтетические аналоги моноклональных антител, специфичные к рецептору АТ1, обладают ценными и неожиданными свойствами, позволяющими предложить применение таких аналогов для терапии или лечения заболеваний. Авторы настоящего изобретения получили как аналоги scFv мышей, так и гуманизированные варианты аналогов scFv мышей.

Согласно первому аспекту настоящего изобретения, предложена специфически связывающаяся молекула, которая специфически связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность EDGIKRIQDD, и содержит полипептид, включающий V_L домен иммуноглобулина, связанный с V_H доменом иммуноглобулина, причем домен V_L содержит участки, определяющие комплементарность (CDRs) VLCDR1, VLCDR2 и VLCDR3, и домен V_H содержит участки, определяющие комплементарность (CDRs) VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, каждый из которых соответственно имеет следующую аминокислотную последовательность, где

VHCDR1 представляет собой GYSFTGYNMN

VHCDR2 представляет собой NIDPYYGGTTYNQKFKG

VHCDR3 представляет собой EVDY

VLCDR1 представляет собой RASKSVSTSGYSYMH

VLCDR2 представляет собой LVSNLES

VLCDR3 представляет собой QHIRELTRSEG

или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную указанным последовательностям.

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения, предложена специфически связывающаяся молекула, которая специфически связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность EDGIKRIQDD, и содержит полипептид, включающий домен иммуноглобулина V_L, связанный с V_H доменом иммуноглобулина, причем домен V_L содержит участки, определяющие комплементарность (CDRs) VLCDR1, VLCDR2 и VLCDR3, и домен V_H содержит участки, определяющие комплементарность (CDRs) VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, каждый из которых соответственно имеет следующую аминокислотную последовательность, где

VHCDR1 представляет собой GYSFTGYNMN или GYSFTGYNMS

VHCDR2 представляет собой NIDPYYGGTTYNQKFKG

VHCDR3 представляет собой EVDY

VLCDR1 представляет собой RASKSVSTSGYSYMH

VLCDR2 представляет собой LVSNLES

VLCDR3 представляет собой QHIRELTRSEG

или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную указанным последовательностям.

В другом варианте реализации настоящего изобретения CDRs специфически связывающиеся молекулы имеют следующие аминокислотные последовательности:

VHCDR1 представляет собой GYSFTGYNMN или GYSFTGYNMS

VHCDR2 представляет собой NIDPYYGGTTYNQKFKG

VHCDR3 представляет собой EVDY

VLCDR1 представляет собой RASKSVSTSGYSYMH

VLCDR2 представляет собой LVSNLES или LVSDLED

VLCDR3 представляет собой QHIRELTRSEG.

CDRs обозначены согласно определению комбинаций консервативных последовательностей (Kabat et al. in "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Nat'l. Inst. Health, Bethesda, MD (1987)), и структурному определению (Chothia and Lesk J. Mol Biol. 196: 901-17 (1987)). Данные определения также впоследствии были описаны в источнике Carter et al, Proc Nat'l Acad Sci USA. 89: 4285-9 (1992).

Аминокислоты могут быть названы с применением трехбуквенной или однобуквенной кодировки, а также в следующем виде: глицин (G или Gly), аланин (А или Ala), валин (V или Val), лейцин (L или Leu), изолейцин (I или Не), пролин (Р или Pro), фенилаланин (F или Phe), тирозин (Y или Tyr), триптофан (W или Trp), лизин (К или Lys), аргинин (R или Arg), гистидин (Н или His), аспарагиновая кислота (D или Asp), глутаминовая кислота (Е или Glu), аспарагин (N или Asn), глутамин (Q или Gln), цистеин (С или Cys), метионин (М или Met), серин (S или Ser) и треонин (Т или Thr). Если остатком является аспарагиновая кислота или аспарагин, могут применяться символы Asx или В. Если остатком является глутаминовая кислота или глутамин, могут применяться символы Glx или Z. Ссылки на аспарагиновую кислоту включают аспартат, а ссылки на глутаминовую кислоту включают глутамат, если из контекста не следует обратное.

Настоящее изобретение также включает варианты вышеуказанных пептидных последовательностей. Примером варианта настоящего изобретения является гибридный белок, содержащий вышеуказанный пептид, в котором одна или более аминокислот заменена на одну или более из других аминокислот. Специалист в данной области знает, что различные аминокислоты имеют похожие свойства. Одна или более из таких аминокислот в составе вещества часто может быть заменена на одну или более из других таких аминокислот без потери необходимой активности такого вещества.

Так, аминокислоты глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин часто могут быть заменены на другие (аминокислоты, содержащие алифатические боковые цепи). Из указанных допустимых замещений предпочтительно, чтобы взаимозаменялись аминокислоты глицин и аланин (поскольку они содержат относительно короткие боковые цепи) и чтобы взаимозаменялись аминокислоты валин, лейцин и изолейцин (поскольку они содержат алифатические боковые цепи большего размера, которые являются гидрофобными). Другие аминокислоты, которые могут взаимозаменяться, включают: фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, содержащие ароматические боковые цепи); лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты, содержащие боковые цепи основного характера); аспартат и глутамат (аминокислоты, содержащие боковые цепи кислотного характера); аспарагин и глутамин (аминокислоты, содержащие амидные боковые цепи), и цистеин и метионин (аминокислоты, содержащие в боковых цепях серу).

Замены такого рода часто называют "консервативными" или "полуконсервативными" аминокислотными заменами.

В аминокислотной последовательности вышеуказанного гибридного белка также могут производиться делеции и вставки аминокислот. Так, например, аминокислоты, не оказывающие существенного влияния на активность полипептида или по меньшей мере те аминокислоты, удаление которых не устраняет указанную активность, могут быть удалены. Такие делеции могут быть ценными, поскольку они влекут уменьшение общей длины и молекулярной массы полипептида без ущерба для сохранения активности. Это может помочь уменьшить количество полипептида, требуемого для достижения конкретной цели, например могут быть уменьшены уровни дозировки.

В аминокислотной последовательности вышеуказанного гибридного белка могут производиться вставки. Это может быть. сделано для изменения свойств вещества согласно настоящему изобретению (например, для облегчения идентификации, очистки или экспрессии, как объяснено выше по отношению к гибридным белкам).

Изменения аминокислотной последовательности, представленные выше, могут быть произведены с применением любой подходящей технологии, например с применением направленного мутагенеза или твердофазного синтеза.

Считается предпочтительным, что замены или вставки аминокислот в пределах объема притязаний настоящего изобретения могут производиться с применением встречающихся в природе или не встречающихся в природе аминокислот. Независимо от того, применяли ли природные или синтетические аминокислоты, предпочтительно, чтобы присутствовали только L-аминокислоты.

"Идентичность", как известно специалистам в данной области техники, является соотношением между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, определяемым путем сравнения последовательностей. В данной области техники идентичность также означает степень сходства последовательностей между двумя полипептидными или полинуклеотидными последовательностями, которую в зависимости от обстоятельств, можно определить сопоставлением цепочек таких последовательностей. Несмотря на то, что существует ряд способов для оценки идентичности двух полипептидных или двух нуклеотидных последовательностей, наиболее часто применяют способы, которые позволяют определить идентичность при помощи закодированных компьютерных программ. Предпочтительные компьютерные программы для определения идентичности двух последовательностей включают пакет программ GCG (Devereux, et al., Nucleic acids Research, 12, 387 (1984), BLASTP, BLASTN и FASTA (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990), но не ограничиваются им.

Предпочтительно аминокислотная последовательность CDRs согласно данному изобретению имеет идентичность по меньшей мере 70%, которая определена с примением параметров, принимающих значение по умолчанию для компьютерной программы BLAST (Atschul et al,, J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990), предлагаемой HGMP (Проект картирования генома человека), на аминокислотном уровне, к вышеописанной аминокислотной последовательности CDRs V_H и V_L.

Более предпочтительно последовательность CDR может иметь по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% по меньшей мере 99% идентичности на аминокислотном уровне по отношению к последовательностям, показанным выше.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения специфически связывающаяся молекула может иметь следующее размещение CDRs

(R6313клон12D и гуманизированные варианты HuCY и вар3)

VHCDR1:GYSFTGYNMN

VHCDR2: NIDPYYGGTTYNQKFKG

VHCDR3: EVDY

VLCDR1: RASKSVSTSGYSYMH

VLCDR2: LVSNLES

VLCDR3: QHIRELTRSEG

или

(Р6313клон 11В)

VHCDR1: GYSFTGYNMS

VHCDR2: NIDPYYGGTTYNQKFKG

VHCDR3: EVDY

VLCDR1: RASKSVSTSGYSYMH

VLCDR2: LVSNLES

VLCDR3: QHIRELTRSEG

или

(гуманизированный вариант вар4)

VHCDR1: GYSFTGYNMN

VHCDR2: NIDPYYGGTTYNQKFKG

VHCDR3: EVDY

VLCDR1: RASKSVSTSGYSYMH

VLCDR2: LVSDLED

VLCDR3: QHIRELTRSEG.

В одном из вариантов реализации изобретения специфически связывающаяся молекула может содержать вариабельную тяжелую цепь (V_H) и вариабельную легкую цепь (V_L), соединяемые пептидным линкером. Линкер может содержать от 1 до 20 аминокислот, таких как, например, 1, 2, 3 или 4 аминокислоты, 5, 10 или 15 аминокислот, или другое промежуточное количество в диапазоне от 1 до 20, в зависимости от необходимости. Пептидный линкер может быть образован остатками любых обычно применяемых аминокислот, таких как глицин и/или серин. Одним из примеров подходящего линкера является Gly₄Ser. Можно применять мультимеры таких линкеров, такие как, например, димер, тример, тетрамер или пентамер, например (Gly₄Ser)₂, (Gly₄Ser)₃, (Gly₄Ser)₄ или (Gly₄Ser)₅. Однако в других вариантах реализации изобретения пептидный линкер может присутствовать, и домен V_L может быть связан с доменом V_H пептидной связью.

Специфически связывающаяся молекула может представлять собой одноцепочечный вариабельный аналог (scFv). Специфически связывающаяся молекула или scFv может быть связана с другими специфически связывающимися молекулами (например, с другими scFv, фрагментами антител, Fab, химерными антителами IgG (например, с человеческими каркасными участками)) или связана с другими scFv согласно настоящему изобретению таким образом, чтобы образовался мультимер, представляющий собой мультиспецифично связывающий белок, например, димер, тример или тетрамер Специфичные к двум молекулам scFv иногда называют диателами, специфичные к трем молекулам называют триателами и специфичные к четырем молекулам тетрателами, в которых каждый scFv в димере, тримере или тетрамере обладает различной специфичностью. Диатела, триатела и тетратела также могут являться моноспецифичными, если каждый scFv в димере, тримере или тетрамере обладает одинаковой специфичностью.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения специфически связывающаяся молекула может представлять собой scFv аналог моноклонального антитела, идентифицируемый как R6313/G2. В настоящей заявке данный scFv также обозначают как R6313клон120 или клон 12D с последовательностью, показанной на Фиг.14. В другом варианте реализации настоящего изобретения специфически связывающаяся молекула может представлять собой scFv аналог моноклонального антитела, идентифицируемый как К6313клон11В в настоящей заявке, обозначенный также клон как 11 В с последовательностью, показанной также на Фиг.14.

scFv может быть получен в соответствии с любой пригодной технологией с применением стандартных химических или молекулярно-биологических способов. В одном варианте реализации изобретения аналоги моноклонального антитела могут быть приготовлены в виде scFv из демонстрационной библиотеки фаговых антител человека, ранее не подвергавшихся экспериментам (McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990); также описанной в WO 92/01047).

Аналог моноклонального антитела может быть гуманизирован за счет модификации аминокислотной последовательности scFv. Способы уменьшения иммуногенности специфично связывающих молекул согласно изобретению могут включать имплантацию CDR (участков, определяющих комплементарность) на подходящий участок трехмерной подложки каркаса антитела или реконструкцию вариабельных остатков на поверхности, например посредством сайт-специфичного мутагенеза или других технологий, общепринятых в молекулярной биологии (Roguska et al. Protein Eng. 9 895-904 (1996)).

Другие приемлемые способы могут включать идентификацию потенциальных эпитопов Т-клеток внутри молекулы с последующим их удалением, например, посредством сайт-специфичного мутагенеза (де иммунизация). Гуманизация специфично связывающейся молекулы может стать необходимой, если молекулу предполагается применять в качестве терапевтического агента. При необходимости может проводиться гуманизация CDR участков или окружающих их каркасных последовательностей.

Авторы настоящей заявки продуцировали, гуманизированные варианты scFv R6313/G2, как описано в примерах.

В одном из вариантов реализации изобретения специфически связывающаяся молекула может представлять собой одно или более гуманизированных scFv, идентифицируемых как HuCY, вар3 и/или вар4. Последовательности этих гуманизированных scFv показаны на Фиг.14.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая вышеописанную специфически связывающуюся молекулу.

Композиция, применяемая в соответствии с данным аспектом изобретения, может быть приготовлена любым подходящим способом. Как правило, лекарственное средство будет поставляться как составная часть стерильной фармацевтической композиции, обычно содержащей фармацевтически приемлемый носитель. Композиции согласно изобретению можно применять в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или носителями, или адъювантом, и/или разбавителем. Такие носители могут включать, не ограничиваясь перечисленными: физиологический раствор, буферный физиологический раствор, декстрозу, липосомы, воду, глицерин, полиэтиленгликоль, этанол и их комбинации. Данная фармацевтическая композиция может находиться в любой подходящей форме (в зависимости от требуемого способа введения пациенту).

Указанная композиция может быть представлена в единичной лекарственной форме, как правило, в герметичном контейнере, а также может быть представлена в виде составной части набора. Такой набор будет обычно включать (хотя и не обязательно) инструкции по применению. Он может содержать множество указанных единичных лекарственных форм.

Фармацевтическая композиция может быть приспособлена для введения любым приемлемым способом, например, пероральным (включая буккальный или подъязычный), ректальным, назальным, местным (включая буккальный, подъязычный или чрескожный), вагинальным или парентеральным способом (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный или внутрикожный). Такие композиции могут быть приготовлены любым способом, известным специалистам в фармации, например посредством смешивания активного ингредиента с носителем(носителями) или наполнителем(наполнителями) в стерильных условиях.

Фармацевтические композиции, предназначенные для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы или таблетки; в виде порошков или гранул; в виде растворов, сиропов или суспензий (в водных или неводных жидкостях; или в виде съедобных пен или взбитых масс, или в виде эмульсий).

Подходящие наполнители для таблеток или твердых желатиновых капсул включают лактозу, кукурузный крахмал или их производные, стеариновую кислоту или ее соли.

Подходящие наполнители для применения в виде мягких желатиновых капсул включают, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и так далее.

Для приготовления растворов и сиропов, могут применяться наполнители, которые могут включать, например, воду, полиолы и сахара. Для приготовления суспензий (например, в растительных маслах) можно применять масла, получая суспензии типа масло-в-воде или вода-в-масле.

Фармацевтические композиции, приспособленные для чрескожного введения, могут быть представлены в виде дискретных пластырей, предназначенных для сохранения тесного контакта с эпидермисом реципиента в течение продолжительного периода времени. Например, активный ингредиент может доставляться из пластыря путем лекарственного электрофореза, как в общем виде описано в Pharmaceutical Research, 3(6):318 (1986).

Фармацевтические композиции, предназначенные для местного применения, можно получать в виде мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, растворов, паст, гелей, спреев, аэрозолей или масел. При инфекциях глаза и других внешних тканей, например, рта и кожи, данные композиции предпочтительно наносят местно в виде мази или крема. При приготовлении мази можно применять активный ингредиент совместно с парафиновой или смешиваемой с водой основой для мази. Альтернативно активный ингредиент может быть введен в состав крема с основой типа масло-в-воде или вода-в-масле. Фармацевтические композиции, приспособленные для местного введения в глаз, включают глазные капли, в которых активный ингредиент растворен или суспендирован в подходящем носителе, в особенности в водном растворителе. Фармацевтические композиции, приспособленные для местного введения в рот включают лепешки, пастилки и растворы для полоскания полости рта.

Фармацевтические композиции, приспособленные для ректального введения могут быть представлены в виде суппозиториев или клизм.

Фармацевтические композиции, приспособленные для назального введения, в которых носитель представляет собой твердое вещество, включают крупный порошок с диаметром частиц в диапазоне от 20 до 500 микрон, который вводится при вдыхании через нос, то посредством быстрой ингаляции через носовой проход из контейнера, удерживаемого вблизи носа. Подходящие композиции, в которых носитель является жидким, для введения в виде назального спрея или капель в нос, включают водные или масляные растворы активного ингредиента.

Фармацевтические композиции, приспособленные для введения при ингаляции, включают мелко размолотые пудры или аэрозоли, которые могут быть получены с применением различных типов ингаляторов отмеренных доз, работающих под давлением, распылителей, или инсуффляторов.

Фармацевтические композиции, приспособленные для вагинального введения, могут быть представлены в составе пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пен или спреев.

Фармацевтические композиции, приспособленные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, делающие композицию по существу изотоничной с кровью целевого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии; которые могут содержать суспендирующие агенты и загустители. Наполнители, которые можно применять в растворах для инъекций включают, например, воду, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла. Композиции могут быть предоставлены в контейнерах для единичной дозы или контейнерах, содержащих многократные дозы, например в герметичных ампулах и флаконах, которые могут храниться в лиофилизованном состоянии, при применении которых требуется только добавление непосредственно перед использованием стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций. Инъекционные растворы и суспензии для приготовления могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток.

Фармацевтические композиции могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, подсластители, красители, ароматизаторы, соли (вещества согласно настоящему изобретению могут сами непосредственно быть представлены в форме фармацевтически приемлемой соли), буферы, покрытия или антиоксиданты. Фармацевтические композиции могут также содержать терапевтически активные агенты дополнительно к веществу согласно настоящему изобретению.

В некоторых вариантах реализации композиция концентрата активного лекарственного средства может содержать агент для поддержания фармацевтически приемлемой тоничности, буферный агент и фармацевтически приемлемое поверхностно-активное вещество.

Альтернативно композиция может содержать активный ингредиент плюс фосфат натрия, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, хлорид натрия, полисорбат 80 или полисорбат 20 (поверхностно-активное вещество для минимизации риска агрегации, вызванной встряхиванием) и воду (Фармакопея США/Европейская Фармакопея), необязательно при значении рН, доведенном до от примерно 6,0 до 7,0, например около 6,5.

Концентрат активного лекарственного средства может быть лиофилизован или нелиофилизован.

Другие композиции могут содержать в качестве буферного агента ацетат натрия тригидрат, хлорид натрия для модифицирования тоничности, уксусную кислоту для доведения значения рН и воду для инъекций.

Концентрат активного лекарственного средства перед введением может быть разбавлен 0,9% хлористым натрием.

Дозы вещества согласно настоящему изобретению могут варьироваться в широких пределах в зависимости от заболевания или расстройства, подлежащего лечению, возраста и состояния субъекта, подлежащего лечению и других факторов, в итоге адекватные дозы, которые необходимо применить, определяет лечащий врач.

Введение дозы можно повторять столько раз, сколько это уместно. При развитии побочных эффектов дозировка и/или частота введения доз может быть уменьшена в соответствии с обычной клинической практикой.

При введении млекопитающим, и в частности людям, ожидается, что ежедневная доза активного агента будет составлять от 1 мкг/кг до 10 мг/кг массы тела, как правило, от примерно 10 мкг/кг до 1 мг/кг массы тела. Врач в любом случае определит фактическую дозу, наиболее подходящую для данного субъекта, которая будет зависеть от ряда факторов, включая возраст, массу тела, пол и чувствительность субъекта. Вышеприведенные дозы приведены в качестве примера для среднего случая. Конечно, могут возникать обстоятельства, когда будут предпочтительными более высокие или более низкие дозы, и как таковые они будут находиться в пределах объема настоящего изобретения.

Вышеописанные специфически связывающиеся молекулы могут найти применение в медицине, например, для лечения рака. Не желая углубляться в теорию, авторы считают, что виды рака, связанные с ангиотензиновым рецептором типа 1 (AT1R) могут оказаться особенно чувствительными к терапии с применением специфически связывающихся молекул согласно изобретению. Такие виды рака многочисленны и включают рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак матки, рак прямой и толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак гипофиза, хориокарциному, болезнь Ходжкина, рак кожи, рак почек, опухоли надпочечников, рак печени, рак легких, лейкоз и клетки нейробластомы.

Таким образом, данный аспект изобретения также включает способ лечения рака у субъекта, включающий введение указанному субъекту специфически связывающейся молекулы, описанной выше. Поэтому данное изобретение также включает применение вышеописанной специфически связывающейся молекулы для получения лекарственного средства для лечения рака. Способ лечения может относиться к субъекту, такому как человек или животное, и изобретение в равной мере распространяется на медицину для людей и/или ветеринарную медицину.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен комбинированный препарат вышеописанной специфически связывающейся молекулы и ангиотензина II для раздельного, одновременного или последовательного введения для лечения рака у субъекта. Рак может быть таким, как описано выше.

Согласно настоящему изобретению также предложена композиция, содержащая специфически связывающуюся молекулу согласно изобретению, как определено выше, и ангиотензин II. Такие композиции могут быть получены в виде фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый адъювант и/или разбавитель.

Альтернативно, согласно настоящему изобретению также предложен набор составных частей, содержащих специфически связывающуюся молекулу согласно изобретению и ангиотензин II, причем каждая из составных частей включена для введения в состав фармацевтического препарата, включая, но не ограничиваясь перечисленными: таблетки для перорального введения, ингаляторы для введения в легкие и растворы для инъекций для внутривенного введения.

Варианты реализации настоящего изобретения, относящиеся к применению ангиотензина II, могут включать любую, удобную в практическом смысле форму ангиотензина, приемлемую для применения для лечения людей или ветеринарной медицине. Приемлемо, если ангиотензин II представлен в форме лиофилизованного продукта, в котором остаток образован из раствора, содержащего Ангиотензин II, трегалозу, альбумин сыворотки человека и уксусную кислоту. Одним из поставщиков ангиотензина II является NIBSC, South Mimms, Великобритания, который поставляет ангиотензин II в виде ампул, содержащих лиофилизованный остаток, приготовленный из 0,5 мл раствора, содержащего 2,5 мкг ангиотензина II (Ileu5), 3 мг трегалозы, 1 мг альбумина сыворотки человека, уксусной кислоты концентрации 2×10^-3 моль/л.

Синтетические аналоги вариабельных участков моноклонального антитела 6313/G2, такие как scFv, называемые R6313/G2, обладают уникальными и ценными свойствами, в особенности по сравнению с исходным гибридомным антителом. Например:

1. R6313/G2 существенно ингибировал рост раковых клеток, содержащихся в системе полых волокон у интактных бестимусных мышей (nu/nu mice). Это неожиданно, потому что при концентрациях 13 нмоль/кг, вводимых дважды в сутки, не было обнаружено влияния на массу тела, концентрацию альдостерона в кровотоке или активность животного, то есть другие функции, связанные с ангиотензином, оказались назатронутыми. (Примечание: исходное гибридомное антитело увеличивало секрецию альдостерона in vitro).

2. R6313/G2 в отдельности ингибирует инвазию клетки T-47D через воспроизведенные белки матрикса (ЕСМ) базальной мембраны, извлеченные из опухоли мышей Engelbroth-Holm-Swam (EHS) в концентрациях 50 и 250 нмоль/л (см. Фиг.9(b)). Очищенное моноклональное антитело (при 100 нмоль/л) не проявило значимого ингибирующего эффекта. Более того, в присутствии ангиотензина II в концентрации 100 нмоль/л (на Фиг.9(b)) эффект R6313/G2 становится значительно более выраженным при наибольшей концентрации R6313/G2 (250 нмоль/л) - до 25% ингибирования инвазии клеток в течение периода исследования более 24 часов.

3. В присутствии до 100 нмоль/л ангиотензина II R6313/G2 значительно ингибирует пролиферации клеток рака молочной железы. Это неожиданно, потому что требуется присутствие ангиотензина II, и R6313/G2 в отсутствие ангиотензина II неэффективен.

4. У интактных крыс in vivo, R6313/G2 существенно ингибирует повышение кровяного давления, вызванное стрессом. Это. неожиданно, поскольку R6313/G2 не уменьшает и даже может увеличить кровяное давление крови в состоянии покоя.

5. В присутствии, но не в отсутствие ангиотензина II до 100 нмоль/л R6313/G2 усиливает в клетках молочной железы апоптоз, приводимый в действие каспазой. Отсутствие ангиотензина блокирует данный эффект. По этой причине присутствие ангиотензина II неожиданно необходимо для проявления активности R6313/G2.

6. Неожиданно обнаружили, что R6313/G2 оказался намного более эффективным in vivo, чем in vitro. Так, при дозе 25 нмоль/кг in vivo показан противораковый эффект в клетках, эквивалентный эффекту, достижимому in vitro в концентрации 3,3 микромоль/л.

7. У интактных бестимусных мышей (nu/nu mice), содержащих ксенотрансплантат клеток раковых опухолей R6313/G2, существенно ингибировал рост клеток рака в дозе 13 нмоль/кг, также без проявления других эффектов.

8. Как можно увидеть из Фиг.12, на повторно обработанной поверхности (гуманизированного) scFv наблюдалось повышенное связывание пептидного антигена по сравнению с scFv мыши. Следовательно, данное обстоятельство предоставляет преимущество как с точки зрения потенциальной стоимости лечения, так и с учетом выгоды от уменьшения потенциала активации иммунного ответа у человека. Более того, гуманизированный вариант вар4 показал гораздо более существенное увеличение связывания по сравнению с материнским scFv мыши. Данное обстоятельство было неожиданным, поскольку один из CDR (VLCDR2) указанного варианта был модифицирован относительно материнского scFv мышей.

Предпочтительные признаки второго и последующих аспектов настоящего изобретения представляют собой те же, что и для первого аспекта mutatis mutandis (с соответствующими изменениями).

Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения предложена специфически связывающаяся молекула, содержащая полипептид с последовательностью, показанной на Фиг.14.

Настоящее изобретение будет дополнительно описано посредством следующих примеров, которые приводятся только в иллюстративных целях. В примерах делаются ссылки на ряд графических материалов, в которых:

На Фиг.1 представлен иммуноблоттинг подтипов рецептора ангиотензина II. Содержание рецептора АТ1 (А) и рецептора АТ2 (В) анализировали в лизатах трех линий клеток рака молочной железы (Дорожка В, T47D; Дорожка С, MDA-MB-231; Дорожка D, MCF-7) и клетках гладк мышц (Дорожка А). Только лизаты трех линий рака молочной железы (Дорожки B-D) содержали рецептор АТ2, хотя клетки MDA-MB-231 содержали относительно меньшее количество: в RASMC (клетки гладких мышц аорты крысы) (Дорожка А) не было определимых количеств рецептора АТ2.

На Фиг.2 представлены (А) зависимое от дозы ингибирование выживания клеток при помощи R6313/G2 в присутствии 100 нмоль/л ангиотензина II, определенное посредством исследования с помощью ХТТ (набор для изучения пролиферации клеток) через 48 часов. Пороговые значения (*) для трех линий клеток (Р<0,05 или лучше) были 0,05 мкМ для MCF-7 и MDA-MB-231 клеток, и 1,25 мкМ для клеток T47D; значения IC₅₀ составили: 2,8 мкмоль/л, 1,53 нмоль/л и 30 нмоль/л для T47D, MDA-MB-231 и MCF-7 клеток, соответственно. (В) Лозартан в отдельности демонстрировал ингибирование роста клеток T47D при 25 мкмоль/л на 43%, влияние на другие виды клеток в примененных дозах отсутствовало. Результаты являются средними для восьми образцов ±S.D. (квадратичное отклонение).

На Фиг.3 представлено (А и В) влияние R6313/G2 на активность каспазы -3/7 в клетках T47D в присутствии и при отсутствии 100 нмоль/л ангиотензина II через 12 часов и 48 часов. Через 12 часов активность каспазы 3/7, ингибируемая ангиотензином II, сравнивали с контрольными значениями для необработанных клеток, и это ингибирование было блокировано R6313/G2. Данное блокирующее действие R6313/G2 было менее выражено, если применяли более высокие дозы, но через 48 часов R6313/G2 сам по себе обусловил зависимое от дозы увеличение активности каспазы -3/7. (С) в клетках MCF7, R6313/G2 в отдельности уменьшал активность каспазы-3/7, но в присутствии ангиотензина II он зависимо от дозы увеличивал активность каспазы 3/7. Данные являются средними из восьми образцов ±S.D. *Р<0,05, **Р<0,01.

На Фиг.4 представлено: (А) в исследовании in vitro в системе полых волокон R6313/G2 в зависимости от дозы ингибировал выживание клеток рака молочной железы во всех трех линиях (T47D, MCF-7 и MDA-MB-231) в присутствии ангиотензина II через 48 часов. (В) в исследовании in vivo в системе полых волокон в месте подкожного введения R6313/G2 в зависимости от дозы ингибировал выживание клеток MCF-7, хотя клетки MDA MB 231 ингибировались только в самой высокой дозе. (С) в исследовании in vivo в системе полых волокон, в месте введения внутрибрюшинно R6313/G2, ингибировал выживание клеток MCF7 у животных, получавших 0,07 и 0,7 мг/кг (2,5 и 25 нмоль/кг) дважды в сутки, и клеток T47D и MBA MB 231 при 0,7 мг/кг (25 нмоль/кг) дважды в сутки. Значения выражены в виде средних значений ±S.D. *Р<0,05, **Р<0,001. (D) Показано, что за период лечения массы тела животных не изменились.

На Фиг.5 показано, что лечение R6313/G2 животных с имплантированными ксенотрансплантатами клеток MCF7 in vivo в дозах 0,4 мг/кг (13 нмоль/кг; -■-) и 0,8 мг/кг (27 нмоль/кг; -▲-); дважды за сутки не привело к уменьшению массы тела, и что за время лечения не было гибели животных, а в группе, получавшей 0,8 мг/кг group, четыре животных погибли на восьмые сутки. Масса тела существенно уменьшилась у животных, получавших 1,36 мг/кг (45,3 нмоль/кг; -•- *Р<0,05), и все они погибли на восьмые сутки 8. Данные являются средними ±S.E.M. (стандартная ошибка среднего), n=8, если не указано иное (значения n в скобках). Контроль (-♦-).

На Фиг.6 представлено влияние R6313/G2 на ксенотрансплантаты клеток MCF-7 in vivo. (А) объемы опухоли MCF-7, среднее значение ±S.E.M. (В) Те же данные, что