Рекомбинантные химерные полипептиды, несущие эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса borrelia burgdorferi sensu lato, и способ серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза

Рекомбинантные химерные полипептиды, несущие эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса borrelia burgdorferi sensu lato, и способ серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине, микробиологической промышленности и может быть использовано для получения методами генной инженерии рекомбинантных химерных полипептидов, несущих эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato. Указанные полипетиды могут быть использованы для диагностики иксодового клещевого боррелиоза (Лайм-боррелиоз, болезнь Лайма) методами иммуноферментного анализа (ИФА), иммунохроматографического анализа и вестерн-блот анализа, а также для получения сывороток животных, содержащих поликлональные антитела к соответствующим рекомбинантным химерным полипептидам, и создания молекулярных вакцин против возбудителя иксодового клещевого боррелиоза.

Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) - это инфекционное трансмиссивное природноочаговое заболевание, вызываемое спирохетами комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (B.burgdorferi s.l.), передающееся через иксодовых клещей. В настоящее время охарактеризовано 18 видов спирохет, входящих в состав комплекса В.burgdorferi s.l., из которых только четыре: В.burgdorferi sensu stricto, B.garinii, B.afzelii и B.spielmanii, являются патогенными для человека (1). По широте распространения и уровню заболеваемости ИКБ занимает одно из ведущих мест среди природно-очаговых заболеваний. Географическое распространение ИКБ обширно, оно встречается на всех континентах (кроме Антарктиды). В нашей стране природные очаги этой инфекции широко распространены в лесной зоне, от границ с Прибалтикой на западе до Южного Сахалина - на востоке (2). В России обнаружены четыре из шести видов боррелий, встречающихся в мире. Виды B.afzelii и B.garinii распространены по всей территории страны, от европейской части до Дальневосточного региона (3). B.burgdorferi sensu stricto обнаружена только на европейской части территории России - в Московской и Ленинградской областях (4, 5, 6). За последнее десятилетие проведены работы по изучению зараженности иксодовых клещей, распространенных на территории Западной Сибири, спирохетами комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato и определению видового состава боррелий (B.afzelii, B.garinii и, предположительно B.japonica, патогенность последнего не выявлена) (7, 8, 9).

Иксодовый клещевой боррелиоз представляет серьезную опасность для здоровья людей, поскольку может приводить к длительной нетрудоспособности и инвалидности. Клинически заболевание протекает с преимущественным поражением кожи, нервной системы, опорно-двигательного аппарата, сердца и характеризуется склонностью к хроническому, а также латентному течению (10).

Диагностика ИКБ является одной из актуальных проблем здравоохранения, и это обусловлено многими факторами: разнообразием клинических проявлений, наличием сопутствующих инфекций, возбудители которых переносятся иксодовыми клещами (анаплазмоз, бабезиоз, вирусный клещевой энцефалит и др.) (11), зависимостью проявлений инфекции как от видовой принадлежности возбудителя, так и от индивидуальных особенностей организма и др. На ранней стадии ИКБ хорошо поддается лечению антибиотикотерапией. На поздних стадиях лечение является более длительным и не всегда успешным. В раннем периоде развития ИКБ выделяют раннюю стадию инфекции (стадию локальной инфекции) и следующую за ней стадию дисссеминированной инфекции, соответствующую диссеминации боррелий в различные органы. Заболевание может иметь стертую клиническую картину течения или латентную форму или маскироваться под другие заболевания, что затрудняет его диагностику.

Основными методами, позволяющими быстро диагностировать ИКБ, являются методы, основанные на выявлении антител к возбудителю, при этом в качестве антигенов используют лизат боррелий или белки, входящие в их состав.

Известен лизат боррелий B.burgdorferi s.1., содержащий белки боррелий, которые используют в качестве антигенов для диагностики ИКБ (12). Недостатками использования антигенов в составе лизата боррелий является то, что лизат включает также белки теплового шока р75 и р60, имеющие гомологию аминокислотных последовательностей с белками, выполняющими сходные функции у ряда грам-отрицательных, грам-положительных микроорганизмов и микобактерий (13). Кроме того, флагеллин боррелий имеет общие эпитопы с флагеллинами других спирохет (T.pallidum, T.phagedenis B.persica, B.hermsii, B.duttoni и др.). Поэтому применение антигенов лизата боррелий в лабораторной практике приводит к получению ложноположительных результатов при тестировании сывороток больных сифилисом, пародонтозом, лептоспирозом, туберкулезом и многими другими заболеваниями (14). Специфичность анализа при использовании антигенов лизата боррелий невелика и составляет 60-70%.

Известны антигены внешних поверхностных белков и декорин-связывающих белков нативных штаммов боррелий (спирохет B.burgdorferi s.1.), которые используют для диагностики ИКБ (15). Однако при многократном пассировании культуры in vitro, боррелии теряют свои внехромосомные элементы (плазмиды), кодирующие иммунодоминантные белки, в том числе внешние поверхностные и декорин-связывающие белки. Это ограничивает количество получаемых антигенов ввиду небольшого числа циклов размножения возбудителя в условиях in vitro и делает их использование непрактичным.

В последние 15 лет для диагностики ИКБ в качестве антигенов используют иммунодоминантные белки возбудителей ИКБ, синтезируемые рекомбинантными штаммами Escherichia coli.

Известен лизат клеток Е.coli, продуцирующих поверхностный иммунодоминантный белок боррелий BmpA, используемый для диагностики ИКБ (16). Недостатком заявленного диагностического средства является то, что использование неочищенного из лизата белка BmpA существенно снижает чувствительность диагностики. Кроме того, он не может быть использован для диагностики ранней стадии ИКБ.

Известен рекомбинантный флагеллярный белок спирохет B.burgdorferi s.1. FlaA массой 38 кДа, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ на ранней стадии заболевания (17). Однако он не может быть использован для серодиагностики стадии диссеминированной инфекции ИКБ.

Известен рекомбинантный флагеллярный белок спирохет B.burgdorferi s.1. FlaB массой 41 кДа, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ, который вызывает иммунный ответ уже на ранних стадиях развития ИКБ, а иммуноглобулины к FlaB сохраняются в высоком титре на протяжении всей инфекции (18). Недостатком данного антигена является то, что он не позволяет дифференцировать раннюю стадию и стадию диссеминированной инфекции ИКБ.

Известен рекомбинантный белок OspC из семейства внешних поверхностных липопротеинов боррелий, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ (15), который является сильным иммунодоминантным белком B.burgdorferi s.1., индуцирующим гуморальный иммунный ответ на ранней стадии инфекции. Недостатком OspC является его непригодность для диагностики стадии диссеминированной инфекции ИКБ.

Известен рекомбинантный белок OspA из семейства внешних поверхностных белков боррелий, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ (19). Данный маркер позволяет диагностировать ИКБ с преимущественным поражением суставов на стадии диссеминированной инфекции, он не пригоден для диагностики ранней стадии ИКБ

Известна комбинация рекомбинантных белков OspA и VIsE (variable major protein-like sequence, expressed), совместно используемых в качестве антигенов для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции. Данная комбинация антигенов недостаточна для исключения ложноположительной реакции у здоровых пациентов (20). Кроме того, она не позволяет диагностировать раннюю стадию ИКБ.

Известен рекомбинантный декоринсвязывающий белок (DbpA) боррелий, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции, что позволяет выявлять 100% больных с такой формой ИКБ, как нейроборрелиоз и 62% при ИКБ с преимущественным поражением суставов (21). Использование DbpA без сочетания с другими маркерами ИКБ не позволяет диагностировать раннюю стадию заболевания.

Диагностическую значимость для выявления ИКБ на стадии диссеминированной инфекции имеет также другой декоринсвязывающий белок боррелий - DbpB (22). Однако установлено, что использование декоринсвязывающих белков в качестве антигенов для диагностики ИКБ не позволяет диагностировать раннюю стадию заболевания (22).

Известен рекомбинантный белок боррелий ВтрА (р39) из семейства основных мембранных белков, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции. BmpA вызывает сильный иммунный ответ в организме. Зрелый белок BmpA имеет молекулярную массу около 39 кДа и является наряду с флагеллярными белками достаточно консервативным иммуногенным белком спирохет комплекса B.burgdorferi s. 1.: гомология аминокислотных последовательностей BmpA различных видов спирохет В.burgdorferi s.1., патогенных для человека и распространенных в Европе, составляет от 86% до 91% (23). Чувствительность диагностических тест-систем, основанных на использовании BmpA, полученного на основе одного вида боррелий зависит от распространенности данного вида в том регионе, в котором инфицирован пациент. Использование BmpA для диагностики ИКБ не позволяет выявлять раннюю стадию заболевания.

Известен рекомбинантный полипептид, включающий фрагмент аминокислотной последовательности (позиции 139-273) OspC боррелий штамма Borrelia burgdorferi sensu stricto, рекомбинантный полипептид, включающий фрагмент 160-170 указанной аминокислотной последовательности OspC, а также рекомбинантный химерный полипептид, включающий комбинацию фрагментов аминокислотных последовательностей OspC (1-164, 165-179, 180-216, 217-273) от четырех разных штаммов боррелий, которые могут быть использованы для получения молекулярных вакцин против ИКБ (24). Недостатком применения названных рекомбинантных полипептидов и химерного полипептида для диагностики ИКБ в Сибири является то, что источником генов для получения данных полипептидов являются типичные европейские изоляты боррелий, существенно отличающиеся по антигенным свойствам от спирохет, распространенных в Сибири. Кроме того, использование OspC или его фрагментов, в том числе в составе рекомбинантного химерного полипептида, для диагностики ИКБ не позволяет диагностировать стадию диссеминированной инфекции.

Известны рекомбинантные белки OspA, OspB, их фрагменты, рекомбинантный химерный полипептид OspA-OspB, полипептид FlaB, которые могут быть использованы для диагностики ИКБ (25). Недостатком применения названных рекомбинантных полипептидов для диагностики ИКБ в России является то, что они получены на основе генов североамериканских изолятов Borrelia burgdorferi sensu stricto (штаммы N40, В31 и ZS7), которые в России встречаются только в Московской и Ленинградской областях и отсутствуют на других территориях, в том числе в Сибири. Кроме того, выбранная структура гена flaB кодирует перекрестные эпитопы с флагеллярными белками других видов патогенов, главным образом, возбудителя сифилиса - Treponema palladium (29), что обусловливает получение ложноположительных результатов при использовании для диагностики рекомбинантного полипептида FlaB, кодируемого данным геном. Рекомбинантные белки, получаемые согласно данному аналогу, синтезируются слитыми с глутатионтрансферазой, что может приводить к искажениям результатов при диагностике ИКБ.

Известны рекомбинантные белки OspA и FlaB, кодируемые полноразмерными генами ospA и flab, полученными амплификацией методом ПЦР на ДНК североамериканского изолята Borrelia burgdorferi, штамм ZS7 (26). Недостатком применения их для диагностики ИКБ является то, что они обладают отличающимися антигенными свойствами, по сравнению с аналогичными полипептидами, кодируемыми генами изолятов боррелий, встречающихся на территории России, в частности в Сибири, что снижает эффективность использования основанных на их применении тест-систем диагностики ИКБ на территории России. Кроме того, как отмечено выше, OspA пригоден для диагностики ИКБ главным образом на стадии диссеминированной инфекции, и только к FlaB имеются антитела, как на ранней стадии заболевания, так и на стадии диссеминированной инфекции. Таким образом, совместное использование этих антигенов для серодиагностики ИКБ не обеспечивает надежную постановку диагноза на ранней стадии инфекции.

Известен рекомбинантный белок OspC, кодируемый геном, относящимся к инвазивным группам A, B, I и K Borrelia burgdorferi s.1. или группам A, B Borrelia afzelii (27). Недостатком применения данного полипептида для диагностики ИКБ в России является то, что он получен на основе гена боррелий, не встречающихся в популяциях иксодовых клещей на территории России. Кроме того, OspC не пригоден для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции.

Известен рекомбинантный белок OspC, и рекомбинантный полипетид, соответствующий фрагменту белка FlaB западносибирского изолята B.garinii подгруппы NT29, совместно используемые в качестве антигенов для диагностики ИКБ. Недостатком фрагмента белка FlaB является то, что он содержит восемь дополнительных аминокислотных остатков зрелого α-токсина Staphylococcus aureus, что дает при диагностике ИКБ ложноположительные результаты, т.е. не может обеспечить высокую специфичность диагностики ИКБ (28). Кроме того, сочетание двух указанных рекомбинантных полипептидов не обеспечивает надежной диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции, т.к. антитела к OspC нарабатываются у больных только на ранней стадии, и только антитела к FlaB могут присутствовать как на ранней стадии, так и на стадии диссеминированной инфекции.

Известен рекомбинантный белок FlaA вида B.burgdorferi s.s. (штамм В31), распространенного на североамериканском континенте и в странах Западной Европы (29). Недостатком применения этого белка для диагностики ИКБ в России является то, что он отличается по антигенным свойствам от белков FlaA, свойственных боррелиям, циркулирующим в популяциях иксодовых клещей на территории Сибири и Дальнего Востока. Кроме того, FlaA не пригоден для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции.

Наиболее близкими к заявленным являются химерные рекомбинантные полипептиды, несущие эпитопы различного размера из белков OspA, свойственных видам североамериканских и европейских изолятов боррелий и одного или двух других рекомбинантных полипептидов указанных боррелий в следующих комбинациях: OspA и OspA, OspA-OspB, OspA-OspB-OspC, OspA-p83, а также химерные рекомбинантные полипептиды OspB-FlaB и OspB-FlaB-OspC (30). Применение названных химерных антигенов для диагностики ИКБ в Сибири не приемлемо ввиду следующих причин:

- в их состав входят преимущественно эпитопы высоковариабельных антигенов североамериканских и европейских изолятов боррелий, таких как: OspA, OspB и OspC, существенно отличающихся от аналогичных аминокислотных последовательностей сибирских изолятов боррелий, что обусловливает их различную аффинность к антителам сывороток больных и снижает чувствительность анализа;

- количество консервативных антигенов, по которым различия между видами боррелий различных регионов менее выражены, ограничивается белками р83 и FlaB, входящими в состав химерных антигенов OspA-p83, OspB-FlaB-OspC и OspB-FlaB, однако сочетание в составе одного рекомбинантного химерного полипептида маркеров ранней стадии и стадии диссеминированной инфекции затрудняет дифференциальную диагностику этих стадий заболевания.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала рекомбинантных полипептидов, пригодных для диагностики ИКБ, повышение специфичности и чувствительности диагностики ИКБ в регионах распространения западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.1., в том числе дифференциальной диагностики ранней стадии и стадии диссеминированной инфекции.

Решение поставленной задачи достигается тем, что предложены следующие новые рекомбинантные химерные полипептиды, полученные на основе экспрессии генов, синтезированных методом ПЦР на ДНК, выделенных из западносибирских изолятов B.garinii и B.afzelii:

1. Рекомбинантный химерный полипептид - _rmBmpA-_frp83 (SEQ ID NO 4) размером 591 а.о. с молекулярной массой 65,89 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность зрелого белка BmpA западносибирского изолята Borrelia garinii (_rmBmpA) размером 324 а.о. с молекулярной массой 35,3 кДа, а с С-конца - аминокислотную последовательность C-концевого фрагмента белка р83 (_frp83) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 248 а.о. с молекулярной массой 28,17 кДа.

2. Рекомбинантный химерный полипептид - _mOspA-_frp83 (SEQ ID NO 6) размером 521 а.о. с молекулярной массой 57,99 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspA (_rmOspA) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 257 а.о. с молекулярной массой 27,79 кДа, а с С-конца - аминокислотную последовательность C-концевого фрагмента белка р83 (_frp83) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 248 а.о. с молекулярной массой 28,17 кДа.

3. Рекомбинантный химерный полипептид - _rmDbpB-_rmOspA (SEQ ID NO 8) размером 432 а.о. с молекулярной массой 47,13 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка DbpB (_rmDbpB) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 156 а.о. с молекулярной массой 17,02 кДа, а с С-конца - рекомбинантного зрелого белка OspA (_rmOspA) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 257 а.о. с молекулярной массой 27,79 кДа.

4. Рекомбинантный химерный полипептид - _rmFlaA-_frFlaB (SEQ ID NO 10) размером 587 а.о. с молекулярной массой 64,76 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка FlaA (rmFlaA) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 318 а.о. с молекулярной массой 35,82 кДа, а с С-конца - аминокислотную последовательность фрагмента флагеллярного белка FlaB (_frFlaB) специфичного для спирохет B.burgdorferi s.1. размером 250 а.о. с молекулярной массой 26,62 кДа.

5. Рекомбинантный химерный полипептид - _rmOspC_Bg-_rmOspC_Ba (SEQ ID NO 12) размером 390 а.о. с молекулярной массой 40,83 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspC западносибирского изолята Borrelia garinii (_rmOspC_Bg) размером 188 а.о. с молекулярной массой 19,70 кДа, а с С-конца - аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspC западносибирского изолята Borrelia afzelii (_rmOspC_Ba) размером 186 а.о. с молекулярной массой 19,19 кДа.

В кратких обозначениях белков нижние индексы означают: «m» - зрелый (mature), «fr» - фрагмент «r» - рекомбинантный, Bg и Ba - принадлежность белка к боррелиям видов Borrelia garinii и Borrelia afzelii соответственно.

Известны способы серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза методами иммуноферментного анализа с применением коммерческих тест-систем.

Известен способ серодиагностики ИКБ методом иммуноферментного анализа, включающий применение нативного антигена в виде лизата спирохет, полученного из штамма П1 В.afzelii, выделенного на территории Московской области (производитель:

Государственный научный центр прикладной микробиологии, г.Оболенск, Россия) (31). Недостатком известного способа является то, что он не обеспечивает удовлетворительной специфичности по отношению к ИКБ в регионах распространения западносибирских изолятов боррелий, т.к. они существенно отличаются по структуре антигенов от изолятов боррелий, распространенных в Московской области. Кроме того, способ не позволяет дифференцировать раннюю стадию и стадию диссеминированной инфекции. Использование лизатов спирохет обеспечивает высокую чувствительность способа, но он обладает очень низкой специфичностью ввиду присутствия в лизатах антигенов, имеющих перекрестную антигенную реактивность с антигенами других микроорганизмов, включая симбионтов человека. Кроме того, получение лизатов связано с дорогостоящим культивированием спирохет, причем в процессе нескольких пассажей спирохеты могут терять антигены, кодируемые плазмидными ДНК этих микроорганизмов.

Известен способ серодиагностики ИКБ методом иммуноферментного анализа, включающий применение природного антигена, выделенного из штамма РКо В.afzelii (производитель тест-системы: «Dade Behring Marburg GmbH», Германия) (32). Известный способ обладает теми же недостатками.

Известен способ серодиагностики ИКБ методом иммуноферментного анализа, включающий применение в качестве антигенов смеси следующих рекомбинантных полипептидов трех видов боррелий: р21 и OspC из В.burgdorferi sensu stricto и В.garinii, p41i - внутренняя часть флагеллина, из В.garinii, p18 и р100 из В.afzelii (производитель: «Biomedica», Австрия) (33). Недостатком заявленного способа является то, что известные антигены получены на основе боррелий, распространенных в Западной Европе, что ограничивает его применение на территориях, где распространены западносибирские изоляты боррелий. Кроме того, известный способ не позволяет дифференцировать раннюю стадию и стадию диссеминированной инфекции. Другим недостатком способа является то, что использование трех-четырех антигенов недостаточно для достижения высокой чувствительности и специфичности способа.

Известен способ серодиагностики ИКБ методом иммуноферментного анализа, включающий применение в качестве антигенов рекомбинантного полипептида VlsE и лизата клеток В.afzelii, В.arinii для диагностики стадии диссеминированной инфекции ИКБ (выявления антител к боррелиям класса IgG), рекомбинантного полипептида FlaB и природного очищенного OspC для диагностики ранней стадии ИКБ (для выявления антител к боррелиям класса IgM) (производитель тест-ситемы: компания «NovaTec GmbH», Германия) (34). Недостатком заявленного способа является то, что известные антигены получены на основе боррелий, распространенных в Западной Европе, что ограничивает его применение на территориях, где распространены западносибирские изоляты боррелий. Использование лизатов клеток обеспечивает высокую чувствительность способа, но он обладает очень низкой специфичностью ввиду присутствия в лизатах антигенов, имеющих перекрестную антигенную реактивность с антигенами других микроорганизмов.

Известен способ серодиагностики ИКБ инфекции методом иммуноферментного анализа, включающий применение в качестве антигенов смеси рекомбинантных полипетидов трех видов боррелий: VlsE из В.burgdorferi sensu stricto, FlaB (p41) и BmpA из В.garinii, OspC из В.afzelii (производитель: ЗАО «Вектор-Бест», г.Новосибирск, Россия). Известный способ является недостаточно чувствительным и специфичным, в том числе на территории Сибири. Это обусловлено небольшим количеством используемых антигенов, а также использованием в качестве антигенов рекомбинантных белков боррелий, которые не встречаются на территории Сибири (B.burgdorferi sensu stricto) либо существенно отличаются по аминокислотной последовательности от белков западносибирских изолятов боррелий. Кроме того, в способе используют рекомбинантный белок OspC только вида В.afzelii, который в Сибири менее распространен, чем В.garinii.

Наиболее близким к заявляемому является способ серодиагностики ИКБ методом иммуноферентного анализа, включающий применение в качестве антигенов смеси рекомбинантных антигенов DbpA из В.afzelii и В.garinii, FlaB (p41) из В.garinii, OspC из В.afzelii и В.garinii, p35 из В.afzelii (производитель тест-ситемы: ООО «Омникс», г.Санкт-Петербург, Россия) (31). Поскольку он основан на антигенах, свойственных европейским изолятам боррелий, то обладает сниженной чувствительностью и специфичностью при диагностике ИКБ, вызываемого боррелиями, циркулирующими на территории Сибири. Кроме того, он недостаточно надежно выявляет ИКБ на ранней стадии, т.к. для этого используется только один маркер - OspC. Наличие же в сыворотке антител к FlaB встречается у пациентов как на ранней стадии, так и на стадии диссеминированной инфекции.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышение специфичности и чувствительности способа диагностики ИКБ, дифференциальной диагностики ранней стадии и стадии диссеминированной инфекции ИКБ на территории распространения западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.1.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве антигенов для иммуноферментного анализа используют рекомбинантные химерные полипептиды _rmBmpA-_frp83, _rmOspA-_frp83, _rmDbpB-_rmOspA, _rmFlaA-_frFlaB, _rmOspC_Bg-_rmOspC_Ba, заявленные в настоящем изобретении, полученные на основе ДНК западносибирских изолятов Borrelia garinii, Borrelia afzelii; для диагностики ИКБ на ранней стадии используют рекомбинантные химерные полипептиды _rmFlaA-_frFlaB и _rmOspC_Bg-_rmOspC_Ba;

для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции - рекомбинантные химерные полипептиды _rmBmpA-_frp83, _rmOspA-_frp83 и _rmDbpB-_rmOspA.

Описание сущности изобретения

Согласно заявленному изобретению предложены следующие новые рекомбинантные химерные полипептиды, пригодные для диагностики иксодового клещевого боррелиоза на территории распространения западносибирских изолятов боррелий:

1. Рекомбинантный химерный полипептид - _rmBmpA-_frp83 (SEQ ID NO 4) размером 591 а.о. с молекулярной массой 65,89 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка BmpA (_rmBmpA) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 324 а.о. с молекулярной массой 35,3 кДа, а с С-конца - аминокислотную последовательность С-концевого фрагмента белка р83 (_frp83) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 248 а.о. с молекулярной массой 28,17 кДа.

2. Рекомбинантный химерный полипептид - _rmOspA-_frp83 (SEQ ID NO 6) размером 521 а.о. с молекулярной массой 57,99 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspA (_rmOspA) западносибирского изолята Borrelia garmii размером 257 а.о. с молекулярной массой 27,79 кДа, а с С-конца - аминокислотную последовательность С-концевого фрагмента белка р83 (_frp83) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 248 а.о. с молекулярной массой 28,17 кДа.

3. Рекомбинантный химерный полипептид - _rmDbpB-_rmOspA (SEQ ID NO 8) размером 432 а.о. с молекулярной массой 47,13 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка DbpB (_rmDbpB) западносибирского изолята Borrelia garmii размером 156 а.о. с молекулярной массой 17,02 кДа, а с С-конца - аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspA (_rmOspA) западносибирского изолята Borrelia garmii размером 257 а.о. с молекулярной массой 27,79 кДа.

4. Рекомбинантный химерный полипептид - _rmFlaA-_frFlaB (SEQ ID NO 10) размером 587 а.о. с молекулярной массой 64,76 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка FlaA (_rmFlaA) западносибирского изолята Borrelia garmii размером 318 а.о. с молекулярной массой 35,82 кДа, а с С-конца - аминокислотную последовательность фрагмента флагеллярного белка FlaB (_frFlaB) специфичного для спирохет B.burgdorferi s.1. размером 250 а.о. с молекулярной массой 26,62 кДа.

5. Рекомбинантный химерный полипептид - _rmOspC_Bg-_rmOspC_Ba (SEQ ID NO 12) размером 390 а.о. с молекулярной массой 40,83 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspC западносибирского изолята Borrelia garmii (_rmOspC_Bg) размером 188 а.о. с молекулярной массой 19,70 кДа, а с С-конца - аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspC западносибирского изолята Borrelia afzelii (_rmOspC_Ba) размером 186 а.о. с молекулярной массой 19,19 кДа.

Предложенные рекомбинантные химерные полипептиды позволяют существенно расширить арсенал средств, которые могут быть использованы для диагностики ИКБ. Они пригодны в качестве антигенов для диагностики ИКБ на территориях распространения западносибирских изолятов боррелий, т.к. они созданы на основе ДНК боррелий этих регионов. Одновременное использование при диагностике ИКБ заявленных рекомбинантных химерных полипепидов, включающих в составе химер различные комбинации из 8 белков западносибирских изолятов боррелий, позволяет обеспечить высокую специфичность и чувствительность диагностики. Повышение специфичности и чувствительности дифференциальной диагностики ранней стадии и стадии диссеминированной инфекции ИКБ обеспечивается тем, что в состав рекомбинантных химерных полипептидов согласно пп.1-3 входят 4 маркера стадии диссеминированной инфекции, а рекомбинантны химерные полипептиды по пп.4, 5 включают 4 маркера ранней стадии ИКБ.

Заявленные рекомбинантные химерные полипептиды получены следующим образом.

Экспрессирующий вектор pET36b⁽⁺⁾ («Novagen», США) был модифицирован путем встраивания под регуляторную область промотора бактериофага Т7 полилинкера, представляющего из себя фрагмент ДНК, содержащий сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции EcoRI, KpnI, BssHII, BstEII, HindIII и XhoI. Такая структура полилинкера была получена для удобства клонирования выбранных генов боррелий. За полилинкером следует нуклеотидная последовательность, кодирующая 8-ми гистидиновый аминокислотный фрагмент в C-концевой области рекомбинантных белков. Это позволяет очищать рекомбинантные полипептиды с помощью аффинной хроматографии на металло-хелатных сорбентах. Модифицированный вектор был назван pETm, структура встроенного полилинкера приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO 1. Целевые рекомбинантные полипептиды, получаемые с помощью модифицированного экспрессирующего вектора pETm, не содержат протяженных чужеродных аминокислотных последовательностей, вследствие чего не дают неспецифических сигналов в иммуноферментных анализах. Это, в свою очередь, обеспечивает повышение специфичности диагностики.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pETm размером 5305 п.н. содержит:

- фрагмент ДНК размером 48 п.н. - полилинкер, содержащий сайты рестрикции EcoRI, KpnI, BssHII, BstEII, HindIII;

- уникальные сайты рестрикции XbaI, FauNDI, EcoRI, BssHII, BstEII, KpnI, HindIII, XhoI, DraIII, XmaI, SapI;

- XhoI-FauNDI фрагмент плазмидной ДНК pET36b⁽⁺⁾ размером 5257 п.н., включающий:

1) фрагмент ДНК размером 47 п.н., содержащий последовательность терминатора транскрипции гена 10 бактериофага Т7;

2) фрагмент ДНК размером 468 п.н., содержащий ориджин репликации однонитчатого бактериофага f1;

3) фрагмент ДНК, размером 813 п.н., содержащий ген неомициптрансферазы, обусловливающей устойчивость клеток E.coli к капамицину;

4) фрагмент ДНК размером 468 п.н., содержащий ориджин репликации плазмиды рМВ1;

5) фрагмент ДНК размером 1080 п.н., кодирующий область гена-регулятора lacI оперона lac E.coli;

6) фрагмент ДНК размером 468 п.н., содержащий промотор гена 10 бактериофага Т7.

Структура вектора pETm приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO 2.

Вектор pETm был использован для клонирования и экспрессии индивидуальных генов (или фрагментов генов) белков _rmOspC_Bg, _rmDbpB, _rmOspA, _rmFlaA, _frFlaB, _rmBmpA и _frp83, свойственных западносибирским изолятам Borrelia garinii, белка _rmOspC_Ba западносибирского изолята Borrelia afzelii, а также химерных генов данных белков в заявленных сочетаниях.

В настоящем изобретении были получены и клонированы в составе вектора pETm рекомбинантные химерные ДНК, кодирующие рекомбинантные химерные полипептиды следующего состава: _rmBmpA-_frp83, _rmOspA-_frp83, _rmDbpB-_rmOspA, _rmFlaA-_frFlaB и _rmOspC_Bg-_rmOspC_Ba. В кратких обозначениях белков нижние индексы означают: «m» - зрелый (mature), «fr» - фрагмент, Bg и Ba - принадлежность белка к боррелиям видов Borrelia garinii и Borrelia afzelii соответственно.

Аналогичным образом были названы рекомбинантные химерные ДНК, кодирующие вышеперечисленные полипептиды. Сконструированные плазмиды, содержащие рекомбинантные химерные ДНК, были названы соответственно: pETm-_rmbmpA-_frp83, pETm-_rmospA-_frp83, pETm-_rmdbpB-_rmospA, pETm-_rmflaA-_frflaB и pETm-_rmospC_Bg-_rmospC_Ba.

Рекомбинантная химерная ДНК _rmbmpA-_frp83 в составе вектора pETm обеспечивает синтез рекомбинантного химерного полипептида, содержащего эпитопы иммунодоминантных белков _rmBmpA и _frp83, специфичных для сибирского изолята В.garinii подгруппы 20047^T. Рекомбинантная химерная ДНК _rmbmpA-_frp83 имеет размер 1773 п.н. и включает следующие элементы (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды pETm-_rmbmpA-_frp83):

- фрагмент гена bmpA B.garinii размером 972 п.н., кодирующий рекомбинантный зрелый белок BmpA (_rmBmpA) западносибирского изолята Borrelia garimi, позиция фрагмента 5097-6068 п.н.;

- сайты эндонуклеазы рестрикции XhoI размером 6 п.н., позиции сайтов 6069-6074 п.н. и 6819-6824;

- фрагмент гена р83 B.garinii размером 744 п.н., кодирующий C-концевой фрагмент белка р83 западносибирского изолята Borrelia garimi (_frp83), позиции фрагмента 6075-6818 п.п.;

- уникальные сайты рестрикции: KpnI (GGTACC), позиция сайта 5091-5096; BglII (AGATCT) позиция сайта 5454-5459 п.н.; HindIII (AAGCTT) позиции 6522-6527 п.н.

Структура рекомбинантной химерной ДНК _mbmpA-_frp83 представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 3, кодируемая ею аминокислотная последовательность рекомбинантного химерного полипептида _mBmpA-_frp83 отдельно представлена под номером SEQ ID NO 4.

Рекомбинантная химерная ДНК _rmospA-_frpSS в составе вектора pETm обеспечивает синтез рекомбинантного химерного полипептида, содержащего эпитопы иммунодоминантных белков _rmOspA и _frp83, специфичных для сибирского изолята В.garinii подгруппы 20047^T. Рекомбинантная химерная ДНК _rmospA-_frp83 имеет размер 1563 п.н. и включает следующие элементы (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды pETm-_rmospA-_frp83):

- фрагмент гена ospA B.garinii размером 771 п.н., кодирующий рекомбинантный зрелый белок OspA западносибирского изолята Borrelia garimi (_rmOspA), позиция фрагмента 5088-5858 п.н.;

- сайты эндонуклеазы рестрикции XhoI размером 6 п.н., позиции сайтов 5859-5864 п.н. и 6609-6614;

- фрагмент гена р83 B.garinii размером 744 п.н., кодирующий C-концевой фрагмент белка р83 западносибирского изолята Borrelia garinii (_frp83), позиции фрагмента 5865-6608 п.п.;

- уникальные сайты рестрикции: EcoRI (GAATTC), позиция сайта 5081-5086; BamHI (GGATTC), позиция сайта 5496-5501 п.н.; BglII (AGATCT), позиция сайта 5828-5833 п.н.; HindIII (AAGCTT), позиция сайта 6312-6317 п.н.

Структура рекомбинантной химерной ДНК _rmospA-_frp83 представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 5, кодируемая ею аминокислотная последовательность рекомбинантного химерного полипептида _rmOspA-_frp83 отдельно представлена под номером SEQ ID NO 6.

Рекомбинантная химерная ДНК _rmdbpB-_rmospA в составе вектора pETm обеспечивает синтез рекомбинантного химерного полипептида, содержащего эпитопы иммунодоминантных белков _rmDbpB и _rmOspA, специфичных для сибирского изолята B.garinii подгруппы 20047^T. Рекомбинантная химерная ДНК _rmbpB-_rmOspA имеет размер 1296 п.н. и включает следующие элементы (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды pETm-_rmdbpB-_rmospA):

- фрагмент гена _rmdbpB B.garinii размером 468 п.н., кодирующий зрелый белок _rmDbpB, позиция фрагмента 5097-5564 п.н.;

- сайты эндонуклеазы рестрикции XhoI размером 6 п.н., позиции сайтов 5565-5570 п.н. и 6342-6347;

- фрагмент гена _rmospA B.garinii размером 771 п.н., кодирующий зрелый белок _rmOspA, позиции фрагмента 5571-6341 п.н.;

- уникальные сайты рестрикции: EcoRI (GAATTC), позиция сайта 5081-5086; KpnI (GGTACC), позиция сайта 5091-5096; BamHI (GGATTC), позиция сайта 5979-5984 п.н.; BglII (AGATCT) позиция сайта 6311-6316 п.н.

Структура рекомбинантной химерной ДНК _rmdbpB-_rmospA представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 7, кодируемая ею аминокислотная последовательность рекомбинантного химерного полипептида _rmDbpB-_rmOspA отдельно представлена под номером SEQ ID NO 8.

Рекомбинантная химерная ДНК _rmflaA-_frflaB в составе вектора pETm обеспечивает синтез рекомбинантного полипептида, содержащего эпитопы иммунодоминантных белков _frFlaB и _rmFlaA, специфичные для сибирского изолята B.garinii подгруппы 20047^T. Рекомбинантная химерная ДНК _rmflaA-_frflaB имеет размер 1761 п.н. и включает следующие элементы (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды рЕТ- _rmflaA-_frflaB):

- фрагмент гена flaA B.garinii размером 954 п.н., кодирующий зрелый белок _rmFlaA позиция фрагмента 5097-6050 п.п.;

- сайты эндонуклеазы рестрикции XhoI размером 6 п.н., позиции сайтов 6051-6056 п.н. и 6807-6812 п.н.;

- фрагмент кодирующей области гена flaB B.garinii размером 756 п.н., позиции фрагмента 6057-6812 п.н.;

- уникальные сайты рестрикции - EcoRI (GAATTC) позиция сайта 5081-5086 п.н. и KpnI (GGTACC), позиции сайта 5091-5096 п.н.

Структура рекомбинантной химерной ДНК _rmflaA-_frflaB представлена в перечне п