Гены диацилглицерол-ацилтрансферазы и их использование

Гены диацилглицерол-ацилтрансферазы и их использование

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему новую диацилглицерол-ацилтрансферазу, и способ его использования.

Предпосылки изобретения

Триацилглицеролы, представляющие собой запасные липиды, получаются путем переноса ацильных групп на диацилглицеролы. Ферменты, переносящие ацильную группу на диацилглицерол, называются диацилглицерол-ацилтрансферазами (DGAT). Известна ацил-CoA:диацилглицерол-ацилтрансфераза (EC 2.3.1.20), относящаяся к типу, для которого ацильным донором ацила служит ацил-CoA, и фосфолипид:диацилглицерол-ацилтрансфераза PDAT (EC 2.3.1.158), относящаяся к типу, для которого донором ацила служит фосфолипид.

DGAT, использующие в качестве донора ацила ацил-CoA, разделяются на 2 семейства DGAT1 и DGAT2 на основании разницы в первичной структуре (непатентные документы 1 и 2). Клонированы гены DGAT дрожжей, растений и т.д. (патентный документ 1 и непатентные документы 3 и 4). Известно, что среди этих DGAT, DGAT, полученная из Arabidopsis, использует в качестве доноров ацила различные фосфолипиды, включая фосфатидную кислоту, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и т.п., и может переносить ацильные группы в пределах C₁₀-C₂₂ (непатентный документ 5).

DGAT дрожжей Saccharomyces cerevisiae изучены лучше по сравнению с DGAT грибков. Известны гены дрожжей, кодирующие DGAT, DGA1 (YOR245C), принадлежащую к семейству DGAT2 (непатентный документ 6) и LRO1 (YNR008W), представляющую собой PDAT. Фермент, кодируемый этими двумя генами, обеспечивает большую часть активности DGAT в дрожжах, но даже при одновременной деструкции этих генов некоторая активность DGAT сохраняется. Известно, что в этой оставшейся активности участвует DGAT-активность фермента, кодируемого генами ARE1 и ARE2, которые представляют собой гены ацил-CoA:стерол-ацилтрансферазы (непатентный документ 7).

У Mortierella alpina (M. alpina), представляющей собой грибок, продуцирующий липиды, известны 4 типа DGAT, использующих ацил-CoA в качестве донора ацила, и их гены (два типа генов семейства DGAT1 и два типа генов семейства DGAT2) (патентные документы 2 и 3 и непатентный документ 8).

Однако у M. alpina не было обнаружено гомологов PDAT, использующих фосфолипид в качестве донора ацила. Десатураза жирных кислот Δ5 представляет собой фермент, катализирующий окисление дигомо-γ-линоленовой кислоты (DGLA) до арахидоновой кислоты (ARA). Известно, что, поскольку у M. alpina фермент воздействует главным образом на DGLA, находящуюся в виде ацильных остатков на фосфатидилхолине, арахидоновая кислота образуется в виде ацильных остатков фосфатидилхолина (непатентный документ 9). Таким образом, для образования триацилглицеролов, содержащих арахидоновую кислоту, требуются ферменты, синтезирующие триацилглицеролы, содержащие арахидоновую кислоту, из арахидоновой кислоты, находящейся в виде ацильных остатков фосфолипидов, таких как фосфатидилхолин и т.п.

Патентные документы

Патентный документ 1: нерассмотренная публикация заявки на японский патент № 2002-541783.

Патентный документ 2: патент США № 2006/0094086.

Патентный документ 3: патент США № 2006/0091087.

Непатентные документы

Непатентный документ 1: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 13018-13023, 1998.

Непатентный документ 2: J.B.C., 276 (42) 38862-38869, 2001.

Непатентный документ 3: J.B.C., 275 (21), 15609-15612, 2000.

Непатентный документ 4: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(12), 6487-6492.

Непатентный документ 5: Plany Physiology, 135, 1324-1335.

Непатентный документ 6: J. Bacteriol., 184, 519-524, 2002.

Непатентный документ 7: J.B.C., 277 (8), 6478-6482, 2002.

Непатентный документ 8: Collected Abstract of the 2003 Annual Meeting of the Japan Society for Agricultural and Biological Chemistry.

Непатентный документ 9: J.B.C., 278(37), 35115-35126, 2003.

Раскрытие изобретения

В сложившихся обстоятельствах, в области техники существует потребность в новом ферменте, пригодном для продукции триацилглицеролов, содержащих арахидоновую кислоту, в M. alpina.

В результате всесторонних исследований авторам настоящего изобретения удалось клонировать ген, кодирующий гомолог PDAT (MaLRO1) у M. alpina, представляющего собой грибок, продуцирующий липиды. На этом основании выполнено настоящее изобретение. В частности, в настоящем изобретении представлены следующие полинуклеотиды, белки, векторы экспрессии, трансформанты, способ получения композиций липидов или жирных кислот, а также пищевых продуктов с использованием трансформантов, пищевые продукты и т.п., полученные с помощью способа и т.д.

Таким образом, в настоящем изобретении представлено следующее:

[1] Полинуклеотид, согласно любому, выбираемому из группы, состоящей из (а)-(е) ниже:

(а) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или 4;

(b) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;

(с) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до 100 аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью;

(d) полинуклеотид, кодирующий белок, чья аминокислотная последовательность гомологична по меньшей мере на 60% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и который обладает диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью; и

(е) полинуклеотид, гибридизующийся в жестких условиях с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 4, и кодирующий белок, обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.

[2] Полинуклеотид по вышеприведенному п.[1], представляющий собой полипептид, определенный в (g) или (f) ниже:

(f) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до 10 аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью; и

(g) полинуклеотид, кодирующий белок, у которого аминокислотная последовательность гомологична по меньшей мере на 75% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и который обладает диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.

[3] Полинуклеотид по вышеприведенному п.[1], содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или 4.

[4] Полинуклеотид по вышеприведенному п.[1], кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.

[5] Полинуклеотид по любому из вышеприведенных пп.[1]-[4], представляющий собой ДНК.

[6] Белок, кодируемый полинуклеотидом по любому из вышеприведенных пп.[1]-[5].

[7] Вектор, включающий полинуклеотид по любому из вышеприведенных пп.[1]-[5].

[8] Трансформант-не человек, с введенным полинуклеотидом по любому из вышеприведенных пп.[1]-[5].

[9] Трансформант-не человек, с введенным вектором по вышеприведенному п.[7].

[10] Трансформант по вышеприведенным пп.[8] или [9], где трансформант представляет собой грибок, продуцирующий липиды.

[11] Трансформант по вышеприведенному п.[10], где грибок, продуцирующий липиды, представляет собой Mortierella alpina.

[12] Способ получения композиции липидов или жирных кислот, включающей сбор композиции липидов или жирных кислот из культуры трансформанта по любому из вышеприведенных пп.[8]-[11].

[13] Способ по вышеприведенному п.[12], где липид представляет собой триацилглицерол.

[14] Способ по вышеприведенному п.[12], где жирная кислота представляет собой арахидоновую кислоту или дигомо-γ-линоленовую кислоту.

[15] Пищевой продукт, лекарственный препарат, косметический продукт или мыло, включающие композицию липидов или жирных кислот, собранных с помощью способа получения по вышеприведенному п.[12].

Полинуклеотид согласно настоящему изобретению можно использовать для трансформации грибка, продуцирующего липиды (например, M. alpina), дрожжей, растений и т.д. Таким образом, полинуклеотид согласно настоящему изобретению вводят в соответствующую клетку-хозяина для получения трансформанта, экспрессирующего вышеописанный полинуклеотид и, как следствие, эффективно продуцирующего триацилглицеролы, богатые DGLA или ARA. Трансформант (грибок, продуцирующий липиды, дрожжи, растения и т.д.), полученный таким образом, может использоваться для продукции композиций жирных кислот, пищевых продуктов, косметических продуктов, лекарственных препаратов, мыл и т.д.

В частности, для трансформанта согласно настоящему изобретению характерна чрезвычайно высокая эффективность продукции липидов и жирных кислот. Соответственно, настоящее изобретение может эффективно использоваться для производства медикаментов или продуктов здорового питания, требующих большого количества липидов или жирных кислот.

Краткое описание фигур

На фиг.1А представлено выравнивание геномной последовательности и кодирующей последовательности MaLRO1.

На фиг.1В представлено выравнивание геномной последовательности и кодирующей последовательности MaLRO1, продолженное с фиг.1А.

На фиг.2А приведена кодирующая последовательность MaLRO1 и его предполагаемая аминокислотная последовательность.

На фиг.2В приведена кодирующая последовательность MaLRO1 и его предполагаемая аминокислотная последовательность, продолженная с фиг.2А.

На фиг.3 приведено выравнивание аминокислотных последовательностей гомологичных белков PDAT различных грибков. Аминокислотные остатки, помеченные «*», важны для активности PDAT и являются консервативными у разных видов грибков и не только.

На фиг.4 приведено содержание жирных кислот в липидной фракции, экстрагированной из клеток дрожжей.

На фиг.5 приведена композиция жирных кислот в липидной фракции, экстрагированной из клеток дрожжей.

Лучший вариант осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение описывается детально. Воплощения, приведенные ниже, приведены для описания изобретения с помощью примеров, однако изобретение не ограничено только этими воплощениями. Настоящее изобретение можно осуществлять различными способами без отхода от сущности изобретения.

Все публикации, опубликованные заявки на патенты, патенты и другие патентные документы, процитированные в настоящей заявке, включены в нее полностью путем ссылки. Таким образом, в настоящую заявку включено путем ссылки содержание описания изобретения и чертежей заявки на японский патент (№ 2009-289287), поданной 21 декабря 2009 года, на приоритет которой претендует настоящая заявка.

Авторам настоящего изобретения впервые удалось клонировать ген полноразмерной кДНК гена (MaLRO1) гомологов PDAT, полученных из грибка M. alpina, продуцирующего липиды, что будет более подробно описано ниже в примерах. Авторы настоящего изобретения также определили нуклеотидную последовательность геномной ДНК MaLRO1 M. alpina и его предполагаемую аминокислотную последовательность. Последовательность открытой рамки считывания (ORF MaLRO1), предполагаемая аминокислотная последовательность MaLRO1, кодирующая последовательность MaLRO1, последовательность кДНК MaLRO1 и геномная последовательность MaLRO1 приведены в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 соответственно. Эти полинуклеотиды и ферменты можно получить с помощью способов, описанных в примерах ниже, известных генно-инженерных техник, известных способов синтеза и т.д.

1. Полинуклеотид по изобретению

В настоящем изобретении представлен полинуклеотид, выбираемый из группы, состоящей из (а)-(е) ниже:

(а) полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 или 4;

(b) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;

(с) полинуклеотид, кодирующий белок, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой от 1 до 100 аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью;

(d) полинуклеотид, кодирующий белок, у которого аминокислотная последовательность гомологична по меньшей мере на 85% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и который обладает диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью; и

(е) полинуклеотид, гибридизующийся в жестких условиях с полинуклеотидом, состоящим из нуклеотидной последовательности, комплементарной SEQ ID NO:1 или 4, и кодирующий белок, обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.

Термин «полинуклеотид», используемый в настоящей заявке, означает ДНК или РНК.

Термин «полинуклеотид, гибридизующийся в жестких условиях», используемый в настоящей заявке, означает полинуклеотид, получаемый способом гибридизации колоний, способом гибридизации бляшек, способом гибридизации по Саузерну и т.п., с использованием в качестве зонда, например, полинуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 4, или целого или части полинуклеотида, состоящего из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2. Использованные способы гибридизации описаны, например, в «Sambook & Russel, Molecular Cloning; A Laboratory Manual», vol.3, Cold Spring Harbor Laboratory press, 2001» и «Ausubel Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons», 1987-1997, и т.п.

Термин «жесткие условия», используемый в настоящей заявке, может означать условия слабой жесткости, условия средней жесткости и условия сильной жесткости. «Условия слабой жесткости» представляют собой, например, 5×SSC, 5× раствор Денхардта, 0,5% SDS, 50% формамида при 32°С. «Условия средней жесткости» представляют собой, например, 5×SSC, 5× раствор Денхардта, 0,5% SDS, 50% формамида при 42°С или 5×SSC, 1% SDS, 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 50% формамида при 42°С. «Условия сильной жесткости» представляют собой, например, 5×SSC, 5× раствор Денхардта, 0,5% SDS, 50% формамида при 50°С или 0,2×SSC, 0,1% SDS при 65°С. Ожидается, что в этих условиях можно эффективно получить ДНК с более высокой гомологией при более высокой температуре, однако на жесткость условий гибридизации влияет множество факторов, включая температуру, концентрацию зонда, длину зонда, ионную силу, время, концентрацию солей и т.д.; специалист в области техники может рассчитать все эти факторы для достижения сходных по жесткости условий.

При использовании для гибридизации коммерческих наборов реактивов, можно использовать, например, систему прямого мечения и детекции Alkphos Direct Labeling and Detection System (GE Healthcare). В этом случае в соответствии с вложенным протоколом, после инкубации с меченым зондом в течение ночи мембрану отмывают первым промывочным буфером с массовой долей SDS 0,1% при 55°С и таким образом детектируют гибридизованную ДНК. Альтернативно, при получении зонда на основе нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 или 4, или на основе полноразмерной или части нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, гибридизацию можно детектировать с помощью набора реактивов для детекции нуклеиновых кислот DIG Nucleic AcidDetection Kit (Roche Diagnostics), пометив пробу диоксигенином (DIG) и используя коммерческий реактив (например, смесь для мечения PCR Labeling Mix производства Roche Diagnostics) и т.д.

Помимо описанных выше, другие гибридизующиеся полинуклеотиды включают ДНК, идентичную по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 51%, по меньшей мере на 52%, по меньшей мере на 53%, по меньшей мере на 54%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 56%, по меньшей мере на 57%, по меньшей мере на 58%, по меньшей мере на 59%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 61%, по меньшей мере на 62%, по меньшей мере на 63%, по меньшей мере на 64%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 67%, по меньшей мере на 68%, по меньшей мере на 69%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, по меньшей мере на 99,7%, по меньшей мере на 99,8%, по меньшей мере на 99,9% или более последовательности ДНК, приведенной в SEQ ID NO:1 или 4, или ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, рассчитанной с помощью программного обеспечения для поиска гомологии, такого как FASTA и BLAST, с использованием параметров, заданных по умолчанию.

Идентичность аминокислотных последовательностей или нуклеотидных последовательностей можно определить с помощью алгоритма BLAST, разработанного Karlin и Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873, 1993). На основе алгоритма BLAST были разработаны компьютерные программы BLASTN, BLASTX, BLASTP, tBLASTN и tBLASTX (Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). При секвенировании нуклеотидной последовательности с использованием BLASTN, значения параметров могут составлять, например, score=100 и wordlength=12. При секвенировании аминокислотной последовательности с использованием BLASTP, значения параметров могут составлять, например, score=50 и wordlength=3. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST используются значения, принятые по умолчанию для каждой программы.

Вышеописанные полинуклеотиды согласно настоящему изобретению можно получать с помощью известных генно-инженерных техник, известных способов синтеза и т.д.

2. Белок по изобретению

В настоящем изобретении представлен нижеописанный белок.

(i) Белок, кодируемый полинуклеотидом по любому из вышеприведенных (а)-(е).

(ii) Белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

(iii) Белок, включающий аминокислотную последовательность, в которой одна или более аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.

(iv) Белок с аминокислотной последовательностью, гомологичной по меньшей мере на 60% аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью.

Белки, описанные выше в (iii) или (iv), обычно представляют собой естественные мутанты белка SEQ ID NO:2 и включают белки, получаемые искусственно с помощью сайт-специфического мутагенеза, описанного, например, в «Sambrook & Russell Molecular Cloning: A Laboratory Manual», vol.3, ColdSpring Harbor Laboratory Press, 2001»; «Ausubel Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997»; Nuc. Acids Res., 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Nuc. Acids Res., 13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985) и т.д.

Термин «белок, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна или более аминокислот делетированы, заменены, вставлены и/или добавлены к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью» включает белки, содержащие аминокислотную последовательность, в которой, например, от 1 до 100, от 1 до 90, от 1 до 80, от 1 до 70, от 1 до 60, от 1 до 50, от 1 до 40, от 1 до 39, от 1 до 38, от 1 до 37, от 1 до 36, от 1 до 35, от 1 до 34, от 1 до 33, от 1 до 32, от 1 до 31, от 1 до 30, от 1 до 29, от 1 до 28, от 1 до 27, от 1 до 26, от 1 до 25, от 1 до 24, от 1 до 23, от 1 до 22, от 1 до 21, от 1 до 20, от 1 до 19, от 1 до 18, от 1 до 17, от 1 до 16, от 1 до 15, от 1 до 14, от 1 до 13, от 1 до 12, от 1 до 11, от 1 до 10, от 1 до 9 (от 1 до нескольких), от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3, от 1 до 2 или одна аминокислота делетирована, заменена, вставлена и/или добавлена к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающие диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью. В целом, предпочтительно меньшее число делеций, замен, вставок и/или добавлений.

Такие белки включают белок с аминокислотной последовательностью, гомологичной по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 61%, по меньшей мере на 62%, по меньшей мере на 63%, по меньшей мере на 64%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 66%, по меньшей мере на 67%, по меньшей мере на 68%, по меньшей мере на 69%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 71%, по меньшей мере на 72%, по меньшей мере на 73%, по меньшей мере на 74%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 76%, по меньшей мере на 77%, по меньшей мере на 78%, по меньшей мере на 79%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 81%, по меньшей мере на 82%, по меньшей мере на 83%, по меньшей мере на 84%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, по меньшей мере на 99,1%, по меньшей мере на 99,2%, по меньшей мере на 99,3%, по меньшей мере на 99,4%, по меньшей мере на 99,5%, по меньшей мере на 99,6%, по меньшей мере на 99,7%, по меньшей мере на 99,8%, по меньшей мере на 99,9% или более аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 и обладающий диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью. В целом, предпочтителен белок с более высокой степенью гомологии.

Диацилглицерол-ацилтрансферазную активность можно оценить, например, с помощью способа, описанного в Stahl et al., Plant Physiology 135, 1324-1335 (2004).

Наличие диацилглицерол-ацилтрансферазной активности также можно подтвердить с помощью эксперимента с использованием штаммов дрожжей Δdga1, Δrol1 с пониженной продукцией триацилглицеролов. Если при экспрессии полинуклеотида, кодирующего фермент, в штаммах Δdga1, Δrol1 продукция триацилглициролов повышается, белок или пептид, кодируемый полинуклеотидом, обладает диацилглицерол-ацилтрансферазной активностью. В примерах описано фракционирование липидов на фракцию триацилглицеролов (TG) и фракцию фосфолипидов (PL) и подтверждение повышения уровня продуцируемых триацилглицеролов. Однако изменения уровня продуцируемых фосфолипидов не наблюдалось (фиг.4).

В настоящем изобретении диацилглицерол-ацилтрансферазная активность может представлять собой ацил-CoA:диацилглицерол-ацилтрансферазную активность или фосфолипид:диацилглицерол-ацилтрансферазную активность, предпочтительно, фосфолипид:диацилглицерол-ацилтрансферазную активность.

Делеция, замена, вставка и/или добавление одного или более аминокислотных остатков к аминокислотной последовательности белка согласно изобретению означает, что один или множество аминокислотных остатков делетируют, заменяют, вставляют и/или добавляют в одном или нескольких положениях одной и той же аминокислотной последовательности. Одновременно могут иметь место два или более типа делеций, замен, вставок и добавлений.

Примеры взаимозаменяемых аминокислотных остатков приведены ниже. Аминокислотные остатки одной и той же группы являются взаимозаменяемыми. Группа А: лейцин, изолейцин, норлейцин, валин, норвалин, аланин, 2-аминобутановая кислота, метионин, о-метилсерин, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин и циклогексилаланин; группа В: аспартат, глутамат, изоаспартат, изоглутамат, 2-аминоадипиновая кислота и 2-аминосубериновая кислота; группа С: аспарагин и глутамин; группа D: лизин, аргинин, орнитин, 2,4-диаминобутановая кислота и 2,3-аминопропионовая кислота; группа Е: пролин, 3-гидроксипролин и 4-гидроксипролин; группа F: серин, треонин и гомосерин; и группа G: фенилаланин и тирозин.

Белок согласно настоящему изобретению также можно получать способами химического синтеза, такими как способ Fmoc (флуоренилметилоксикарбониловый способ), способ t-Boc (трет-бутилоксикарбониловый способ) и т.д. Кроме того, для химического синтеза могут применяться синтезаторы пептидов производства Advanced Automation Peptide Protein Technologies, Perkin Elmer, Protein Technology Instrument, PerSeptive, Applied Biosystems, SHIMADZU Corp. и т.д.

3. Вектор по изобретению и трансформанты, индуцированные вектором

В другом воплощении в настоящем изобретении также представлен вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по изобретению.

Вектор согласно изобретению конструируют так, чтобы он содержал кассету экспрессии, включающую:

(i) промотор, транскрибируемый в клетке-хозяине;

(ii) любой из полинуклеотидов, описанный в (a)-(g) выше, связанный с промотором; и

(iii) кассету экспрессии, включающую в качестве компонента сигнал, функционирующий в клетке-хозяине как сигнал терминации транскрипции и полиаденилирования молекулы РНК.

Вектор, сконструированный таким образом, вводят в клетку-хозяина. Примеры клеток-хозяев, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают грибки, продуцирующие липиды, дрожжи и т.п.

Грибки, продуцирующие липиды, которые могут использоваться в настоящем изобретении, представляют собой штаммы, описанные, например, в MYCOTAXON, т. XLIV, № 2, стр. 257-265 (1992). Конкретные примеры включают микроорганизмы, принадлежащие к роду Mortierella, включая микроорганизмы, принадлежащие к подроду Mortierella, например Mortierella elongata IFO8570, Mortierella exigua IFO 8571, Mortierella hydrophila IFO5941, Mortierella alpina IFO8568, ATCC 16266, ATCC 32221, ATCC 42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70 и CBS754.68 и т.д., или микроорганизмы, принадлежащие к подроду Micromucor, например, Mortierella isabellina CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308 и IFO7884, Mortierella nana IFO8190, Mortierella ramanniana IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185 и IFO8287, Mortierella vinacea CBS236.82 и т.д. Из этих грибков предпочтительна Mortierella alpina.

Примерами дрожжей могут служить Saccharomyces cerevisiae NBRC1951, NBRC1952, NBRC1953, NBRC1954 и т.д.

При введении вектора согласно изобретению в дрожжи и оценке диацилглицерол-трансферазной активности белка, кодируемого вектором, отсутствие у дрожжей, используемых в качестве хозяев, генов диацилглицерол-трансферазы (DGA1 и LRO1) дает возможность оценивать только ферментативную активность белка. Соответственно, в воплощении настоящего изобретения у предпочтительных дрожжевых клеток-хозяев отсутствуют гены DGA1 и LRO1.

Эти клетки-хозяева, трансформированные вектором согласно изобретению, продуцируют большее количество липидов, предпочтительно триацилглицеролов (также называемых «триглицериды»), более предпочтительно, триглицеролов, содержащих арахидоновую кислоту или DGLA, и наиболее предпочтительно, триглицеролов, содержащих арахидоновую кислоту, по сравнению с клетками-хозяевами, не трансформированными вектором согласно изобретению.

Векторы для введения в грибки, продуцирующие липиды, включают, но не ограничиваются, например, pDura5 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004)).

Выбор вектора для введения в грибки, продуцирующие липиды, не сильно ограничен, можно использовать любой вектор, способный экспрессировать вставку в клетках дрожжей, включая, например, pYE22m (Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995). Выбор вектора для введения в Mortierella alpina не сильно ограничен, можно использовать любой вектор, способный экспрессировать вставку в клетках Mortierella alpina, включая, например, pDuraMCS для экспрессии в M. alpina.

Промоторы/терминаторы, регулирующие экспрессию в клетках-хозяевах, могут представлять собой произвольную комбинацию, функционирующую в клетках-хозяевах. Например, может использоваться промотор гена гистона H4.1, промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и т.д.

В качестве селективного маркера для трансформации могут использовать ауксотрофные маркеры (ura5, niaD), маркеры химической устойчивости (гигромицин, зеоцин), ген устойчивости к генетицину (G418r), ген устойчивости к меди (CUP1) (Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337, 1984), ген устойчивости к церулеину (fas2m, PDR4) (Junji Inokoshi et al., Biochemistry, 64, 660, 1992; и Hussain et al., Gene, 101: 149, 1991 соответственно).

Для трансформации клеток-хозяев могут использоваться известные способы. Например, для трансформации грибков, продуцирующих липиды, можно использовать способ электропорации (Mackenzie D.A. et al., Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000) и способ доставки частиц (способ, описанный в заявке на японский патент № 2005-287403 «Способ выведения грибков, продуцирующих липиды»). Для трансформации дрожжей можно использовать способ электропорации, сферопластный способ (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, стр. 1929 (1978)), литий-ацетатный способ (J. Bacteriology, 153, стр. 163 (1983)) и способы, описанные в Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, стр. 1929 (1978), Methods in yeast genetics, изд. Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual (2000) и т.п.

Кроме того, общие техники генетического клонирования описаны по ссылке: Sambrook & Russell, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», т. 3, изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press», 2001, «Methods in yeast genetics: A laboratory manual», изд. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

4. Способ продукции композиции липидов или жирных кислот по изобретению

В другом воплощении в настоящем изобретении далее представлен способ изготовления композиции липидов или жирных кислот, включающей использование вышеописанного трансформанта грибка, продуцирующего липиды, или дрожжей.

Термин «липид», используемый в настоящей заявке, означает простой липид, включая вещество, состоящее из жирной кислоты и спирта, присоединенного с помощью сложноэфирной связи (например, глицерида), или его аналога (например, сложного эфира холестерола) и т.п.; сложный липид, в котором к части простого липида присоединены фосфорная кислота, аминокислота (аминокислоты), или сахарид (сахариды) и т.д.; или производное липида, представляющее собой гидролизат вышеупомянутого липида, нерастворимый в воде.

Термин «масло и жир», используемые в настоящей заявке, означают сложный эфир глицерола и жирной кислоты (глицерид).

Термин «жирная кислота», используемый в настоящей заявке, означает алифатическую монокарбоксикислоту (карбоксикислоту с одной карбоксильной группой и атомами углерода, соединенными в цепочку), в общем случае обозначаемую формулой RCOOH (где R представляет собой алкил). Жирные кислоты включают насыщенные жирные кислоты, не содержащие двойных связей и ненасыщенные кислоты, чья углеводородная цепочка содержит двойную связь (связи).

Композицию липидов или жирных кислот согласно настоящему изобретению можно экстрагировать из клеток, трансформированных согласно настоящему изобретению, следующим образом. Организм-трансформант (например, грибок, продуцирующий липиды, или дрожжи) культивируют и затем обрабатывают стандартным способом, например, с помощью центрифугирования или фильтрации, для получения культивируемых клеток. Клетки тщательно промывают водой и предпочтительно высушивают. Высушивать можно с помощью лиофилизации, высушивания на воздухе и т.д. Высушенные клетки разрушают предпочтительно с помощью дезинтегратора Dynomill или ультрасонификации и далее экстрагируют органическим растворителем предпочтительно в токе азота. Примеры органических растворителей, доступных для использования, включают эфир, гексан, метанол, этанол, хлороформ, дихлорметан, петролейный эфир и т.д. Альтернативно, также хорошие результаты получаются при попеременной экстракции метанолом и петролейным эфиром или экстракцией однофазным растворителем хлорофом-метанол-вода. При дистилляции органического растворителя из экстракта при пониженном давлении получаются липиды, содержащие жирные кислоты. Экстрагированные жирные кислоты можно превратить в метиловые эфиры с помощью соляной кислоты и метанола и т.д.

Кроме того, жирные кислоты можно отделить в виде смеси жирных кислот или смеси сложных эфиров жирных кислот от вышеупомянутых липидов, содержащих жирные кислоты, с помощью стандартных процедур концентрации и сепарации (например, добавления мочевины, сепарации при охлаждении, колоночной хроматографии и т.д.).

Липиды, полученные способом согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой триглицеролы, более предпочтительно представляют собой триглицеролы, содержащие арахидоновую или дигомо-γ-линоленовую кислоты, и наиболее предпочтительно представляют собой триацилглицеролы, содержащие арахидоновую кислоту.

Жирные кислоты, полученные способом согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой арахидоновую или дигомо-γ-линоленовую кислоты и наиболее предпочтительно представляют собой арахидоновую кислоту. Содержание липидов, полученных способом согласно настоящему изобретению, и состав жирных кислот, содержащихся в липидах, можно подтвердить с помощью способа экстракции липидов или способа сепарации жирных кислот, описанных выше, или их комбинации.

Композиция липидов или жирных кислот, полученных способом продукции согласно настоящему изобретению, может использоваться для продукции, например, продуктов питания, лекарственных препаратов, промышленных материалов (сырья для косметических продуктов, мыла и т.д.), содержащих масла и жиры, и т.п.

Еще в одном воплощении в настоящем изобретении представлен способ получения пищевых продуктов, косметических продуктов, лекарственных препаратов, мыл и т.д. с использованием грибка-трансформанта, продуцирующего липиды, или дрожжей-трансформантов согласно настоящему изобретению. Способ включает стадию образования липидов или жирных кислот с использованием грибка-трансформанта, продуцирующего липиды, или дрожжей-трансформантов согласно настоящему изобретению. Продукты питания, косметические продукты, лекарственные препараты, мыла и т.д., содержащие образованные липид или жирные кислоты, получают стандартными способами. В целом, продукты питания, косметические продукты, лекарственные препараты, мыла и т.д., полученные способом согласно настоящему изобретению, содержат липиды или жирные кислоты, полученные с использованием грибка-трансформанта, продуцирующего липиды, или дрожжей-трансформантов согласно настоящему изобретению. В настоящем изобретении далее представлены продукты питания, косметические продукты, лекарственные препараты, мыла и т.д., полученные с помощью способа.

Форма косметического продукта (композиции) или лекарственного препарата (фармацевтической композиции) согласно настоящему изобретению не ограничена и может представлять собой любую форму, включая вид раствора, пасты, геля, твердого вещества или порошка. Косметическая композиция или фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может использоваться как косметический продукт или местнодействующее средство для кожи, включая масло, лосьон, крем, эмульсию, гель, шампунь, ополаскиватель для волос, кондиционер для волос, лак, основу под макияж, губную помаду, пудру для лица, маску для лица, мазь, парфюмерный продукт, пудру, одеколон, зубную пасту, мыло, аэрозоль, очищающую пенку и т.д., противовозрастное средство для ухода за кожей, противовоспалительное средство для кожи, средство для ванн, лекарственный тоник, эссенцию красоты, средство для защиты от солнца, или защитное и лечебное средство для проблем с кожей, связанных с травмой, обветриванием или растрескиванием и т.д.

Косметическая композиция согласно настоящему изобретению также может при необходимости включать другие масла и жиры и/или красители, ароматические вещества, консерванты, поверхностно-активные вещества, пигменты, антиоксиданты и т.д. Специалист в области техники может определить необходимую долю этих веществ в составе композиции в зависимости от ее использования (например, массовая доля масел и жиров в композиции может составлять от 1 до 99,99%, предпочтительно от 5 до 99,99% и наиболее предпочтительно от 10 до 99,95%). При необходимости фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также включать другие фармацевтически активные компоненты (например, противовоспалительные компоненты) или вспомогательные компоненты (например, смазка или носитель). Примеры других компонентов, обычно используемых в косметических продуктах или препаратах для обработки кожи для наружного применения, включают средство против угревой сыпи, средство для предотвращения перхоти или зуда, антиперспирант и дезодорант, противоожоговое средство, средство против клещей и вшей, средство, размягчающее кератин, средство против ксеродермы, противовирусное средство, средство, повышающее чрезкожную абсорбцию и т.п.

Пищевые продукты согласно настоящему изобретению включают пищевые добавки, здоровое питание, функциональное питание, пищевые продукты для детей младшего возраста, детское питание, модифицированное молоко для младенцев, модифицированное молоко для недоношенных младенцев, питание для пожилых людей и т.д. При использовании в тексте настоящей заявки, питание или пищевые продукты может означать твердые, текучие и жидкие пищевые продукты, а также их смесь, и в совокупности означает продукты, годные для употребления в пищу.

Термин «пищевая добавка» означает пищевые продукты, обогащенные определенными питательными веществами. Термин «здоровое питание» означает оздоравливающие и полезные для здоровья пищевы