Рекомбинантная клетка, продуцирующая 2-гидроксиизомасляную кислоту

Рекомбинантная клетка, продуцирующая 2-гидроксиизомасляную кислоту

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Объектом настоящего изобретения является клетка, которая была генетически модифицирована таким образом, что стала способна продуцировать большее количество 2-гидроксиизомасляной кислоты или большее количество полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, по сравнению с ее диким типом, отличающаяся тем, что образование 2-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, происходит через ацетоацетил-Коэнзим А в качестве промежуточного продукта и 3-гидроксибутирил-Коэнзим А в качестве прекурсора.

Уровень техники

Метакриловая кислота, ее сложные эфиры и полимеры находят широкое применение при производстве акриловых оконных стекол, продуктов, изготовляемых с применением пресс-формы для литья под давлением, покрытий и многих других продуктов.

Описано множество способов получения метакриловой кислоты. Однако, в основном, во всем мире коммерческое производство базируется на химическом способе, основанном на гидролизе сульфатов метакриламида, которые получают из соответствующих 2-гидроксинитрилов, причем около 1,6 кг серной кислоты необходимо для получения 1 кг метакриловой кислоты.

Химическое превращение 2-гидроксиизомасляной кислоты (2-HIB) в метакриловую кислоту с выходом до 96% описывается в US 3,666,805 и US 5,225,594.

Альтернативный способ получения метакриловой кислоты основывается на гидролизе 2-гидроксинитрилов до 2-гидроксиизомасляной кислоты, с применением нитрилгидролизующих ферментов. При этом речь идет о нитрилазе или комбинации из нитрил гидратазы и амидазы (A.Banerjee, R.Sharrna, U.С.Banerjee, 2002, "The nitrite-degrading enzymes: current status and future prospects", Appl. Microbiol. Biotechnol., 60: 33-44 и US 6,582,943). Серьезным недостатком этого способа является нестабильность нитрилов в нейтральной области рН, необходимой для эффективной нитрилгидролизующей ферментативной активности. Разложение нитрилов в реакционной смеси приводит к накоплению кетонов и цианидов, которые ингибируют нитрилгидролизующую ферментативную активность.

Общий недостаток обоих способов, т.е. доминирующего в настоящее время способа на основе сульфатов метакриламида и ферментативного нитрилгидролизующего способа, состоит в необходимости 2-гидроксинитрилов. Они могут быть получены только из вредных для окружающей среды реагентов, а именно кетонов и цианида.

Альтернативный способ получения 2-гидроксиизомасляной кислоты по ферментативному метаболическому пути, при котором разлагается трет-бутиловый спирт, раскрывается в СА 2,510,657.

Следующий ферментативный способ получения 2-гидроксиизмасляной кислоты раскрывается из РСТ/ЕР2007/052830. В этом способе прекурсор 3-гидроксибутирил-Коэнзим А (3-НВСоА) превращается в 2-гидроксиизомасляную кислоту с помощью мутазы. При практическом применении указанный способ обладает следующими недостатками: указанный способ является периодическим, реагент 3-гидроксиизомасляная кислота (3-НВ) добавляется экзогенно, и условия способа требуют присутствия инертного газа. Степень превращения составляет около 20%.

Поэтому существует необходимость в способе получения 2-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, которому не присущи описанные недостатки.

Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения 2-гидроксиизомасляной кислоты, который удовлетворяет потребность в прекурсорах 2-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, которые затем могут быть превращены в метакриловую кислоту, ее сложные эфиры и полимеры.

Описание изобретения

Неожиданно было обнаружено, что образование 2-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты через ацетоацетил-Коэнзим А в качестве промежуточного продукта и 3-гидроксибутирил-Коэнзим А в качестве прекурсора, вносит ценный вклад в решение задачи, поставленной в настоящем изобретении.

Термин "прекурсор", как он применяется здесь, означает химическое соединение, которое может быть превращено в целевой продукт по ферментативному пути посредством применения только одного фермента, в то время как термин "промежуточный продукт" означает химическое соединение, которое может быть превращено в целевой продукт по ферментативному пути посредством применения, по меньшей мере, двух ферментов, причем соединения с функциональной группой коэнзима А или без нее должны пониматься как эквивалентные „химические соединения", и, таким образом, формирующие сложный тиоэфир ферменты или расщепляющие сложный тиоэфир ферменты не рассматриваются.

Поэтому объектом настоящего изобретения является клетка, которая была генетически модифицирована таким образом, что стала способна продуцировать большее количество 2-гидроксиизомасляной кислоты или большее количество полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, по сравнению с ее диким типом, отличающаяся тем, что образование 2-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, происходит через ацето-ацетил-Коэнзим А в качестве промежуточного продукта и 3-гидроксибутирил-Коэнзим А в качестве прекурсора. Следующими объектами настоящего изобретения являются способ получения клетки по изобретению и способ получения 2-гидроксиизомаслянной кислоты с помощью клетки по изобретению, а также способ получения метакриловой кислоты.

Преимущество настоящего изобретения состоит в том, что 2-гидроксиизомасляная кислота или метакриловая кислота, соответственно, может быть получена как из возобновляемых видов сырья, например из углеводов и/или из глицерина, так и из сырья, получаемого из ископаемых видов топлива, такого как, например, метанол, и, таким образом, можно избежать проблем, связанных с непостоянной доступностью ископаемого сырья.

Следующее преимущество настоящего изобретения состоит в том, что согласно способу по изобретению можно получить метакриловую кислоту при меньшей термической нагрузке и, в общем, с меньшим числом стадий способа по изобретению.

Следующее преимущество настоящего изобретения состоит в возможности избежать многих токсичных или агрессивных веществ, которые накапливаются при обычном химическом способе получения 2-гидроксиизомасляной кислоты.

Далее изобретение описывается с помощью примерных вариантов выполнения изобретения, которые не предназначены для его ограничения.

Все указанные проценты (%), если иного не оговаривается, представляют собой массовые проценты.

Термин „2-гидроксиизомасляная кислота", как он применяется в настоящем документе, всегда обозначает соответствующую С₄-карбоновую кислоту в той форме, в которой она существует в зависимости от значения рН после продуцирования соответствующими микроорганизмами. Таким образом, данный термин всегда охватывает чистую кислотную форму (2-гидроксиизомасляная кислота), чистую основную форму (2-гидроксиизобутират), а также смеси из протонированной и депротонированной формы кислоты.

Термин „3-гидроксибутирил-Коэнзим А" охватывает как (R)-, так и (S)-стереоизомеры, причем (R)-стереоизомер особенно предпочтителен.

Фраза „таким образом, что стала способна продуцировать большее количество 2-гидроксиизомасляной кислоты или большее количество полигид-роксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, по сравнению с ее диким типом" относится также к случаю, когда дикий тип генетически модифицированной клетки вообще не способен продуцировать 2-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты, содержащие мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты или, по меньшей мере, никакие обнаруживаемые количества этих соединений, и только после генетической модификации могут продуцироваться обнаруживаемые количества этих компонентов.

Под "диким типом" клетки преимущественно понимается клетка, геном которой находится в том состоянии, в котором он возник естественным образом в процессе эволюции. Это понятие относится как ко всей клетке, так и к отдельным генам. Под понятие "дикий тип" поэтому не попадают, в частности, такие клетки и такие гены, генные последовательности которых были модифицированы человеком, по меньшей мере, частично, посредством рекомбинантных способов.

Из 2-гидроксиизомасляной кислоты можно затем получить метакриловую кислоту посредством щадящей реакции дегидратации. В случае полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксимасляной кислоты, могут быть выделены содержащиеся в клетках граны, наполненные этими полигидроксиалканоатами, и затем полимеры расщепляются с получением 2-гидроксиизомасляной кислоты, которая затем может быть дегидратирована с получением метакриловой кислоты.

При этом согласно настоящему изобретению является предпочтительным, чтобы генетически модифицированная клетка была генетически модифицирована таким образом, что в течение определенного временного интервала, предпочтительно в течение 2 часов, еще более предпочтительно в течение 8 часов, и наиболее предпочтительно в течение 24 часов, она продуцирует, по меньшей мере, в два раза больше, особенно предпочтительно, по меньшей мере, в 10 раз больше, еще более предпочтительно, по меньшей мере, в 100 раз больше, еще более предпочтительно, по меньшей мере, в 1000 раз больше и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, в 10000 раз больше 2-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов, содержащих 2-гидроксиизомасляную кислоту, по сравнению с ее диким типом. При этом увеличение в продуцировании продукта можно определить, например, культивируя клетку по изобретению и клетку соответствующего дикого типа по отдельности, при одинаковых условиях (одинаковая клеточная плотность, одинаковая питательная среда, одинаковые условия культивирования), в течение определенного временного интервала, в подходящей питательной среде, и затем определяя количество целевого продукта (2-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов, содержащих 2-гидроксиизомасляную кислоту) либо в клеточном супернатанте, в случае 2-гидроксиизомасляной кислоты, или в клетках, в случае полигидроксиалканоатов, содержащих 2-гидроксиизомасляную кислоту.

Клетки по изобретению могут быть прокариотическими или эукариотическими. При этом речь может идти о клетках млекопитающих (как например, клетки человека), растительных клетках или о микроорганизмах, таких как дрожжи, грибы или бактерии, причем особенно предпочтительны микроорганизмы, и наиболее предпочтительны бактерии и дрожжи.

Среди бактерий, дрожжей или грибов особенно предпочтительными для применения являются бактерии, дрожжи или грибы, хранящиеся в немецком банке микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismn und Zeilkulturen GmbH), Брауншвейг, Германия, в виде штаммов бактерий, дрожжей или грибов. Подходящие согласно настоящему изобретению бактерии принадлежат видам, приведенным по адресу http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm,

подходящие согласно настоящему изобретению дрожжи принадлежат видам, приведенным по адресу

http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm,

и подходящие согласно настоящему изобретению грибы принадлежат видам, приведенным по адресу

http://www.dsmz.de/species/fungi.htm.

Согласно настоящему изобретению предпочтительными клетками являются клетки, происходящие из рода Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholdena, Clostridium и Cupriavidus, причем клетки, происходящие из рода Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacteiium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymomonas mobilis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha, особенно Ralstonia eutropha H16, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroi-des, Paracoccus versutus, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Acinetobacter calcoaceticus и Pichia pastoris, являются особенно предпочтительными.

Клетка по настоящему изобретению, которая способна продуцировать, по сравнению с ее диким типом, большее количество 2-гидроксиизомасляной кислоты или большее количество полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, через ацетоацетил-Коэнзим А в качестве промежуточного продукта и 3-гидроксибутирил-Коэнзим А в качестве прекурсора, обнаруживает активность фермента Е1, который катализирует превращение ацетоацетил-коэнзима А в 3-гидроксибутирил-коэнзим А.

В случае фермента Е1 речь преимущественно идет о ферменте, выбранном из группы, состоящей из:

3-гидроксиацил-СоА дегидрогеназы (ЕС 1.1.1.35),

ацетоацетил-Коэнзим А редуктазы (ЕС 1.1.1.36),

длинноцепочечной 3-гидроксиацил-СоА дегидрогеназы ((ЕС 1.1.1.211) и 3-гидроксибутирил-Коэнзим А-дегидрогеназы (ЕС 1.1.1.157).

Этот фермент предпочтительно закодирован генами, выбранными из группы, состоящей из phaB, phbB, fabG, phbN1 или phbB2, причем phaB и phbB особенно предпочтительны. Нуклеотидные последовательности этих генов могут быть получены, например, из „Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG-база данных), базы данных национального центра биотехнологической информации (NCBI) национальной медицинской библиотеки (Bethesda, MD, США) или из базы данных нуклеотидных последовательностей европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL, Гейдельберг, Германия и Кембридж, UK).

Преимущество клетки по настоящему изобретению может состоять в том, что клетка по настоящему изобретению, по сравнению с ее диким типом, обнаруживает повышенную активность фермента Е1, который катализирует превращение ацетоацетил-коэнзима А в 3-гидроксибутирил-коэнзим А.

Под фразой „повышенная активность фермента", применяемой выше в отношении фермента Е1 и далее в отношении ферментов Е2 и т.д., предпочтительно нужно понимать повышенную внутриклеточную активность.

Следующие комментарии относительно повышения ферментативной активности в клетках относятся как к повышению активности фермента Е1, так и к повышению активности всех в последующем упоминаемых ферментов, активность которых, при необходимости, может быть повышена.

По существу, повышение ферментативной активности может достигаться посредством того, что повышается число копий генной последовательности или генных последовательностей, которые кодируют фермент, посредством применения сильного промотора, посредством изменения частоты использования кодона, посредством увеличения различными путями периода полураспада мРНК или фермента, посредством модификации регуляции экспрессии гена или посредством применения гена или аллели, кодирующих соответствующий фермент с повышенной активностью, и, при необходимости, посредством комбинирования всех этих действий.

Генетически модифицированные клетки по настоящему изобретению получают, например, трансформацией, трансдукцией, конъюгацией или комбинацией этих способов, применяя вектор, который содержит желаемый ген, аллель этого гена или его части, и промотор, который способствует экспрессии этого гена. Гетерологическая экспрессия достигается, в частности, интеграцией гена или аллелей в хромосому клетки или в экстрахромосомно реплицирующийся вектор.

Обзор возможностей повышения активности ферментов в клетках, на примере пируват-карбоксилазы, рассматривается в источнике DE-A-10031999, который включен в настоящий документ посредством ссылки и объем раскрытия которого относительно возможностей повышения активности ферментов в клетках является частью настоящего изобретения.

Экспрессия вышеназванных ферментов или генов и всех упоминаемых далее ферментов или генов может быть обнаружена с помощью одно- и двумерного фракционирования белков в геле и последующей оптической идентификации концентрации белка в геле с помощью соответствующего программного обеспечения для оценки. Если повышение ферментативной активности базируется исключительно на повышении экспрессии соответствующего гена, то количественное определение указанного повышения ферментативной активности может проводиться простым сравнением одно- или двумерного фракционирования белков клетки дикого типа и генетически модифицированной клетки. Обычный способ получения белковых гелей для коринеформных бактерий и идентификации указанных белков описывается у Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001). Концентрацию белков можно проанализировать подобным образом с помощью Вестерн-Блот гибридизации со специфическими для анализируемого белка антителами (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, США, 1989) и последующей оптической оценки, с применением соответствующего программного обеспечения для определения концентрации (Lohaus und Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Ange-wandte Chemie 111: 2630-2647). Активность ДНК-связывающих белков может также быть определена с помощью анализа на замедление подвижности ДНК в геле (также упоминается как торможение в геле) (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155). Действие, оказываемое ДНК-связывающими белками на экспрессию других генов, может быть обнаружено различными хорошо описанными способами анализа репортерных генов (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, США, 1989). Внутриклеточные ферментативные активности могут быть определены различными описанными способами (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3): 816-823). Если в приведенном далее описании изобретения никакие конкретные способы определения активности определенного фермента не указываются, то определение повышения ферментативной активности, а также определение понижения ферментативной активности происходит преимущественно посредством способов, описанных у Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) и Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001).

Если повышению ферментативной активности сопутствует мутация эндогенного гена, то такие мутации могут быть достигнуты либо ненаправленно с помощью классических способов, таких как, например, основанных на ультрафиолетовом облучении или вызывающих мутацию мутагенных веществ, либо целенаправленно, с помощью генно-инженерных способов, таких как делеция(ии), инсерция(ии) и/или нуклеотидное замещение(ия). Посредством таких мутаций получают модифицированные клетки. Особенно предпочтительные мутантные ферменты представляют собой, в частности, также такие ферменты, которые больше не ингибируются по типу обратной связи или ингибируются в меньшей степени по сравнению с ферментом дикого типа.

Если повышению ферментативной активности сопутствует повышение синтеза фермента, то к этому случаю относится, например, увеличение числа копий соответствующих генов или мутирование промоторной или регуляторной областей или сайта связывания рибосом, расположенного против хода транскрипции структурного гена. Тем же самым образом действуют экспрессионные кассеты, которые встраиваются против хода транскрипции структурного гена. Кроме того, посредством индуцируемых промоторов можно повышать экспрессию в любой произвольный момент времени. Более того, так называемые "Энхансеры" могут быть включены в ген, кодирующий фермент, в качестве регуляторных последовательностей, которые благодаря повышенному взаимодействию между РНК-полимеразой и ДНК также вызывают повышение экспрессии гена. Экспрессия также улучшается с помощью мер по увеличению продолжительности жизни мРНК. Кроме того, ферментативная активность также усиливается посредством предотвращения расщепления ферментного белка. В этом случае, гены или генные конструкции либо находятся в плазмидах с разным числом копий, либо интегрируются в хромосому и амплифицируются там. Альтернативно, сверхэкспрессия рассматриваемых генов может, кроме того, достигаться путем изменения состава среды и методики культивации. Специалисты в данной области техники находят руководства к действию, среди прочего, у Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), у Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bionechnology 6, 428-430 (1988)), у Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), в ЕР-А-0472869, в US 4,601,893, у Schwarzer und Punier (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), у Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), у LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), в WO-A-96/15246, у Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993), в JP-A-10-229891, у Jensen und Hammer (Biotechnology and Bi-oengineering 58, 191-195 (1998)) и в известных учебниках по генетике и молекулярной биологии. Вышеописанные действия, так же как и мутации, приводят к генетически модифицированным клеткам.

Для повышения экспрессии соответствующих генов применяются, например, эписомальные плазмиды. Подходящие плазмиды и вектора представляют собой, в принципе, все варианты конструкций, доступные для этой цели специалисту в данной области техники. Такие плазмиды и вектора поставляются, например, фирмами Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech или Gibco BRL. Другие предпочтительные плазмиды и вектора могут быть обнаружены, например, у: Glover, D.М. (1985), DNA cloning: a practical approach, Vol.I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodriguez, R.L. und Denhardt, D.Т (eds) (1988), Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D.V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol. 185, 3-7; Sam-brook, J.; Fritsch, E.F. und Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Затем плазмидный вектор, содержащий ген, который должен быть амплифицирован, переносится путем конъюгации или трансформации в желаемый штамм. Способ конъюгации описывается, например, у Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994). Способы трансформации описываются, например, у Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican und Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) и Tauch et al., FEMS Microbiology Let-ters 123: 343-347 (1994). После гомологической рекомбинации посредством "кроссоверного" события, полученный штамм содержит уже, по меньшей мере, две копии соответствующего гена.

Под применяемой выше и при дальнейшем описании изобретения фразой „повышенная по сравнению с ее диким типом активность фермента Е_х" всегда предпочтительно понимается активность соответствующего фермента Е_х, которая повысилась в, по меньшей мере, 2 раза, предпочтительно в, по меньшей мере, 10 раз, более предпочтительно в, по меньшей мере, 100 раз, особенно предпочтительно в, по меньшей мере, 1000 раз и наиболее предпочтительно в, по меньшей мере, 10000. Кроме того, клетка по изобретению, обнаруживающая „повышенную активность фермента Е_х по сравнению с ее диким типом", в более частном случае также охватывает клетку, дикий тип которой не обнаруживает активность указанного фермента Е_х или, по меньшей мере, подтверждаемую активность указанного фермента Е_х, и подтверждаемая активность указанного фермента Е_х обнаруживается только после повышения указанной ферментативной активности, например, посредством сверхэкспрессии. В этой связи термин „Сверхэкспрессия" или фраза „повышение экспрессии", применяемые далее, охватывают как случай, когда немодифицированная клетка, например клетка дикого типа, не обнаруживает экспрессию, или, по меньшей мере, подтверждаемую экспрессию, и подтверждаемый синтез фермента Е_х индуцируется лишь посредством рекомбинантных способов.

Под применяемой далее фразой „пониженная активность фермента Е_х" предпочтительно понимается активность фермента, которая была понижена до значения, составляющего, по меньшей мере, 0.5 от первоначального, более предпочтительно, по меньшей мере, 0.1, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 0.01, особенно предпочтительно, по меньшей мере, 0.001 и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 0.0001. Фраза „пониженная активность" также охватывает случай отсутствия подтверждаемой активности („нулевая активность"). Понижение активности определенного фермента может достигаться, например, путем целенаправленной мутации, путем добавления конкурентных или неконкурентных ингибиторов, или другими известными специалисту в данной области техники способами понижения активности конкретного фермента.

Предпочтительно, чтобы для клетки по настоящему изобретению, которая, по сравнению с ее диким типом, способна продуцировать большее количество 2-гидроксиизомасляной кислоты или большее количество полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, через ацетоацетил-Коэнзим А в качестве промежуточного продукта и 3-гидроксибутирил-Коэнзим А в качестве прекурсора, в качестве источника углерода могли служить углеводы, глицерин, масла и жиры, диоксид углерода, карбоновые кислоты или метанол.

Кроме того, предпочтительно, чтобы клетка по настоящему изобретению, которая способна продуцировать 2-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты, содержащие мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, через ацетоацетил-Коэнзим А в качестве промежуточного продукта и 3-гидроксибутирил-Коэнзим А в качестве прекурсора, обнаруживала, в дополнение к активности фермента E₁, активность фермента Е₂, причем предпочтительно повышенную по сравнению с ее диким типом активность фермента Е₂, который катализирует превращение молекул ацетил-Коэнзима А в ацетоацетил-Коэнзим А.

В случае фермента Е₂ речь предпочтительно идет о ацетил-СоА С-ацетилтрансферазе (EC-Number 2.3.1.9). Этот фермент предпочтительно кодируется генами, выбранными из группы, состоящей из acat1, acat2, loc484063, loc489421, mgc69098, mgc81403, mgc81256, mgc83664, kat-1, erg10, ygeF, atoB, fadAx, phbA-1, phbA-2, atoB-2, pcaF, pcaF-2, phb-A, bktB, phaA, tioL, thIA, fadA, paaJ, phbAf, pimB, mmgA, yhfS, thi, vraB, th1, mvaC, thiL, paaJ, fadA3, fadA4, fadA5, fadA6, cgl12392, catF, sc8f4.03, thiL1, thiL2, acaB1, acaB2, асаВЗ или асаВ4, причем предпочтительными являются cat1, acat2, atoB, thIA, thIB, phaA и phbA, особенно предпочтительными являются phaA и phbA.

Нуклеотидные последовательности этих генов могут быть получены, например, из „Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (KEGG-база данных), базы данных национального центра биотехнологической информации (NCBI) национальной медицинской библиотеки (Bethesda, MD, США) или из базы данных нуклеотидных последовательностей европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL, Гейдельберг, Германия или Кембридж, UK).

Клетка по настоящему изобретению предпочтительно обнаруживает, по меньшей мере, одну активность фермента Е₃, предпочтительно повышенную по сравнению с ее диким типом активность фермента Е₃, который катализирует превращение 3-гидроксибутирил-Коэнзима А в 2-гидроксиизобутирил-Коэнзим А. В случае фермента Е₃ речь преимущественно идет о гидроксил-изобутирил-СоА мутазе, о изобутирил-СоА мутазе (ЕС 5.4.99.13) или о метилмалонил-СоА мутазе (ЕС 5.4.99.2), в каждом случае предпочтительно о коэнзим В12-зависимой мутазе.

Фермент Е₃ может быть выделен предпочтительно из микроорганизмов Aquincola tertiaricarbonis L108, DSM18028, DSM18512, Metilibium petroleiphilum PM1, Metilibium sp.R8, Xanthobacter autotrophicus Py2, Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029), Nocardioides sp.JS614, Marinobacter algicola DG893, Sinorhizobium medicae WSM419, Roseovarius sp.217, Pyrococcus furiosus DSM 3638, и, в частности, представляет собой коэнзим В12-зависимую мутазу, описанную в РСТ/ЕР2007/052830, а также один из ферментов, по меньшей мере, одна часть последовательностей которых на аминокислотном уровне идентична аминокислотной последовательности малой или большей субъединицы мутазы, описанной в РСТ/ЕР2007/052830 (номер доступа DQ436457.1 и DQ436456.1), на, по меньшей мере, 60%, предпочтительно на, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно на, по меньшей мере, 95%, и особенно предпочтительно на, по меньшей мере, 99%, как было определено с помощью алгоритма blastp, где ограничение на вероятность случайного совпадения равно 10, длина слова равна 3, применяется матрица blosum62, штраф за открытие вставки равен 11, и штраф за продолжение вставки равен 1, и применяется условная установка формы структурного расчета.

В предпочтительном варианте выполнения клетки по изобретению, способной продуцировать 2-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты, содержащие мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, через ацетоацетил-Коэнзим А в качестве промежуточного продукта и 3-гидроксибутирил-Коэнзим А в качестве прекурсора, клетка по настоящему изобретению в форме ее дикого типа обнаруживает активность фермента Е4, предпочтительно пониженную по сравнению с ее диким типом активность, по меньшей мере, одного фермента Е4, который катализирует превращение 3-гидроксибутирил-Коэнзима А в полигидроксибутират.

В случае фермента Е4 речь преимущественно идет о полигидроксиалканоат синтазе, особенно предпочтительно о полигидроксибутират синтазе. Этот фермент кодируется преимущественно генами phbC и phaC, причем ген phaC особенно предпочтителен.

В следующем предпочтительном варианте выполнения клетки по изобретению, способной продуцировать 2-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты, содержащие мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, через ацетоацетил-Коэнзим А в качестве промежуточного продукта и 3-гидроксибутирил-Коэнзим А в качестве прекурсора, клетка по настоящему изобретению в форме ее дикого типа обнаруживает активность фермента Es, предпочтительно пониженную по сравнению с ее диким типом активность фермента Ев, который катализирует превращение 3-гидроксибутирил-Коэнзима А в кротонил-Коэнзим А.

В случае фермента Еа речь идет преимущественно о кротоназе (ЕС-номер 4.2.1.55) или о (ЗК)-3-Гидроксибутаноил-СоА дегидратазе (ЕС-номер 4.2.1.17). Этот фермент кодируется преимущественно генами, выбранными из группы, состоящей из crt, crt1, crt2, fadB, paaF, причем crt, а также соответствующий ген из Clostridien, являются предпочтительными, причем ген crt из Clostridium acetobutilicum особенно предпочтителен.

Еще в одном предпочтительном варианте клетки по изобретению, способные продуцировать 2-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты, содержащие мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, через ацетоацетил-Коэнзим А в качестве промежуточного продукта и 3-гидроксибутирил-Коэнзим А в качестве прекурсора, клетка по настоящему изобретению в форме ее дикого типа обнаруживает активность фермента Ее, предпочтительно пониженную по сравнению с ее диким типом активность фермента Ее, который катализирует превращение R-3-гидроксибутирил-Коэнзима А в S-3-гидроксибутирил-Коэнзим А.

Под ферментом Ее преимущественно понимается 3-гидроксибутирил-СоА эпимераза (ЕС 5.1.2.3). Этот фермент кодируется преимущественно генами, выбранными из группы, состоящей из fadB, fadB1, fadB2, fadJ, fabJ-1, faoA, yfcX, причем fadB, fadJ и yfcX предпочтительны, и fadB и fadJ особенно предпочтительны.

Кроме того, клетка по изобретению, способная продуцировать 2-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты, содержащие мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, через ацетоацетил-Коэнзим А в качестве промежуточного продукта и 3-гидроксибутирил-Коэнзим А в качестве прекурсора, предпочтительно обнаруживает пониженную по сравнению с ее диким типом активность, по меньшей мере, одного фермента Е7, для которого субстратом служит 3-гидроксибутирил-Коэнзим А.

Вклад в решение поставленных выше задач вносит способ получения 2-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, содержащий следующие стадии:

a) контакт клетки по изобретению с питательной средой, содержащей источник углерода, в условиях, при которых из источника углерода образуется 2-гидроксиизомасляная кислота или полигидроксиалканоаты, содержащие мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, а также, при необходимости

b) очистка 2-гидроксимасляной кислоты от питательной среды или полигидроксиалканоатов, содержащих мономерные структурные единицы 2-гидроксиизомасляной кислоты, от клеток.

В качестве источника углерода могут применяться углеводы [как например, моносахариды (например, глюкоза, фруктоза, галактоза, арабиноза, ксилоза), олигосахариды (например, мальтоза, сахароза, лактоза), и полисахариды (например, крахмал, гидролизованный крахмал, целлюлоза, гидролизованная целлюлоза, гемицеллюлоза, гидролизованная гемицеллюлоза)], также как и продукты их реакции, такие как, например, сахарные спирты и полигидроксикислоты;

диоксид углерода;

органические моно-, ди- и трикарбоновые кислоты, необязательно содержащие одну или более, например 1, 2, 3 или 4, гидроксильные группы, например, уксусная кислота, винная кислота, итаконовая кислота, янтарная кислота, пропионовая кислота, молочная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, 2,5-фурандикарбоновая кислота, глутаровая кислота, левулиновая кислота, глюконовая кислота, аконитовая кислота, янтарная кислота и диами-нопимелиновая кислота, лимонная кислота;

липиды;

масла или жиры, такие как, например, рапсовое масло, соевое масло, пальмовое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло;

насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты с предпочтительно 10-22 атомами углерода, например, у-линоленовая кислота, дигомо-γ-линоленовая кислота, арахидоновая кислота, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота, линолевая кислота, эйкозапентаеновая кислота и докозагексаеновая кислота;

углеводороды, как например метан;

спирты, например, с 1-22 атомами углерода, например бутанол, метанол, этанол;

диолы с предпочтительно 3-8 атомами углерода, например, пропандиол и бутандиол;

многоатомные спирты (также упоминаемые как высшие спирты) с тремя или более, например 3, 4, 5 или 6, ОН-группами, например, глицерин, сорбитол, маннитол, ксилитол и арабинитол;

кетоны с, предпочтительно, 1-10 атомами углерода, и при необходимости 1 или более гидроксильными группами, например, ацетон и ацетоин;

лактоны, например, γ-бутиролактон, циклодекстрины, биополимеры, например, полигидроксиацетат, сложные полиэфиры, например, полилактид, полисахариды, полиизопреноиды, полиамиды;

ароматические соединения, например, ароматические амины, ванилин и индиго;

белки, например ферменты, такие как амилазы, пектиназы, кислые, гибридные или нейтральные целлюлазы, эстеразы, такие как липазы, панкреазы, протеазы, ксиланазы, и оксидоредуктазы, такие как, лакказа, ката-лаза и пероксидаза, глюканазы, фитазы; каротиноиды, например, ликопин, β-каротин, астаксантин, зеаксантин и кантаксантин;

протеиногенные и непротеиногенные аминокислоты, например, лизин, глютамат, метионин, фенилаланин, аспарагиновая кислота, триптофан и треонин;

пуриновые и пиримидиновые основания;

нуклеозиды и нуклеотиды, например, никотинамидадениндинуклеотид (NAD) и аденозин-5'-монофосфат (AMP);

а также прекурсоры и производные вышеупомянутых соединений, например, соли упомянутых кислот.

Эти вещества могут применяться как по отдельности, так и в виде смеси. Особенно предпочтительным является применение углеводов, в частности, моносахаридов, олигосахаридов или полисахаридов, как это описано в US 6136576, например, C₅-сахаров или глицерина.

Метанол является предпочтительно применяемым спиртом, так как его можно получить из множества различных источников, таких как, например, биогаз, биомасса, природный газ или уголь.

Источники углерода могут применяться в различных формах (чистые или в виде раствора/суспензии) и в виде различных композиций (очищенные или в виде сырья) после различных стадий обработки (например, сок сахарного тростника, сироп, патока, тростниковый сахар, белый сахарный песок; кукурузное зерно, мука, крахмал, декстрин, глюкоза), перед или после обработки (обработка паром, предварительная обработка кислотой, предварительная ферментативная обработка).

Предпочтительно, в альтернативном варианте выполнения настоящего изобретения, в качестве источника углерода применяется СО₂ или СО, в частности, синтез-газ. Применяемыми в этом случае клетками по изобретению являются клетки ацетогенов, как например, виды рода Acetobacteri-ит, такие как, A. woodii и Clostridium aceticum. Более конкретно, применяемыми клетками являются клетки ацетогенов, выбранных из группы, состоящей из Thermoanaerobacter kivui, Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium notera, Clostridium aceticum, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium acetobutylicum, Moorella thermoacetica, Eubacterium limosum, Peptostreptococcus productus, Clostridium ljungdahlii и Clostridium carboxidivorans. Особенно подходящими в этом отношении