Вакцина ассоциированная против вирусной диареи, ротавирусной и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная

Вакцина ассоциированная против вирусной диареи, ротавирусной и коронавирусной инфекций крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается получения и применения вакцины для профилактики пневмоэнтеритов крупного рогатого скота (КРС) и особенно у новорожденных телят.

В структуре заболеваний телят в ранний постнатальный период превалирующее место занимают нарушения функции пищеварительной системы, клинически проявляющиеся диареей, обуславливающей развитие выраженной дегидратации, токсемии, иммунодефицитов, нарушения обмена веществ.

Проблема сохранения новорожденных телят остается актуальной во всех странах мира. В России указанная патология регистрируется у 50-100%, а гибель, как правило, наступает на 2-5 или 7-10 сутки и может достигать 30-50% (1,2,3).

В этиопатогенезе массовых гастроэнтеритов новорожденных телят основная роль принадлежит ассоциации возбудителей, чаще всего ротавирусу, коронавирусу и возбудителю вирусной диареи (ВД) КРС. Специфическая профилактика этих заболеваний сложна, прежде всего, потому, что восприимчивые к ним новорожденные животные имеют недостаточно сформированную иммунную систему. Иммунитет у них в этот период обеспечивается, в основном, антителами, полученными с молозивом матери. Использование вакцин для активной иммунизации новорожденных телят, по-видимому, менее оправдано, так как заболевание у них возникает раньше, чем успевает сформироваться достаточный иммунный ответ после применения вакцины. Поэтому более целесообразна вакцинопрофилактика данных заболеваний через колострум иммунизированных стельных коров.

К настоящему времени известно несколько комбинированных вакцин различной валентности против гастроэнтеритов КРС. Однако их применение не всегда сопровождается положительным эффектом, главным образом, из-за несбалансированности антигенного состава и низкого титра специфических антител в крови стельных коров и в молозиве, выпаиваемом новорожденным телятам.

Важными условиями успешной борьбы с вышеуказанными заболеваниями являются их своевременная и правильная диагностика и проведение специфической профилактики, для которой применяются живые и инактивированные вакцины как в виде моно-, так и ассоциированных препаратов (1, 2, 3, 4).

Преимущество живых вакцин из-за технологичности в производстве и простоты при применении не вызывает сомнений. Однако иммунная реакция у животных при их введении не всегда стабильна и в ряде случаев вызывает осложнения после вакцинации:

вакцина может вызвать повышенную реактогенность, иммуносупрессию, а иногда и гибель до 2% животных при вакцинации в зависимости от условий содержания и наличия коинфекций, проблемы воспроизводства, длительную персистенцию и выделение вакцинного вируса во внешнюю среду. По этой причине они не нашли широкого применения.

Для специфической профилактики указанных заболеваний используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные.

Известна ассоциированная вакцина против вирусной диареи - болезни слизистых (ВД-БС), рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма VDV-Oregon-C24 V (CAPM V-293) вируса ВД-БС КРС, из штамма ТМ-91 (CAPM V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (CAPM 6233), 4804 (CAPM 6234) и 6304 (CAPM 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (5).

Известна ассоциированная вакцина против ИРТ, рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма IBR-BK-5-РТОВ-8 INRV №3760 вируса ИРТ КРС, из штамма ТМ-91 (CAPM V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (CAPM 6234) и 6304 (CAPM 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (6).

Известна ассоциированная вакцина против ПГ-3, рота- и коронавирусной инфекций и эшерихиоза КРС эмульсионная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма PI-3/T₁/11 V-30 вируса ПГ-3 КРС, из штамма ТМ-91 (CAPM V-279) ротавируса КРС, из штамма BCV-9 (CAPM V-280) коронавируса КРС и из штаммов 3935/1 (CAPM 6233), 4808 (CAPM 6234) и 6304 (CAPM 6235) бактерий Е. coli, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективных соотношениях (7).

Известна ассоциированная вакцина против ИРТ, ПГ-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной инфекции, рота- и коронавирусных заболеваний телят «КОМБОВАК», сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из 6 производственных штаммов вирусов: ИРТ, ПГ-3, ВД-БС, респираторно-синцитиальной инфекции, рота- и коронавирусных заболеваний КРС, - полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (8).

Известна ассоциированная вакцина против вирусных пневмогастроэнтеритов КРС и телят, сорбированная инактивированная, содержащая в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штаммов В-25 и ТК-А вируса ИРТ КРС, из штаммов ВД-N и ВД-R вируса ВД-БС КРС, из штаммов В-19 и ПТК-45/86 вируса ПГ-3 КРС, из штаммов К-88 и РП-82 ротавируса КРС, из штаммов КВ-90 и К-22 коронавируса КРС и из штаммов PC-89 и PC-71 возбудителя респираторно-синцитиальной инфекции КРС, полученных в чувствительных биологических системах, и в качестве целевой добавки адъювант-сорбент ГОА в эффективных соотношениях (9).

Наиболее близким аналогом является вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят «Комбовак-К», которая изготавливается из штаммов трех вирусов: рота-, корона- и вирусной диареи, протективных антигенов эшерихий; соматических 09, 078, 0115; капсульных полисахаридных К 80, К 30; адгезивных антигенов 99, F-41, термостабильных и термолабильных инактивированных энтеротоксинов и предназначена для профилактики вызываемых ими заболеваний (10).

Недостатком известной комбинированной вакцины является относительно невысокий титр инфекционной активности входящих в ее состав вирусных суспензий, в результате чего в прививной дозе не обеспечивается необходимое количество протективных антигенов против указанных болезней.

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в получении ассоциированной вакцины против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС эмульсионной инактивированной, создающей эффективную защиту восприимчивых животных различных половозрастных групп по отношению к разным подтипам и основным антигенным вариантам эпизоотических штаммов возбудителей, циркулирующих в хозяйствах на территории РФ.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала высокоиммуногенных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин, эмульсионных инактивированных против инфекционных болезней КРС, сопровождающихся поражением органов дыхания и желудочно-кишечного тракта, а также в повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности ассоциированной вакцины и создании напряженного и длительного иммунитета у привитых животных.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины ассоциированной против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС эмульсионной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков.

Предлагаемая вакцина содержит в качестве активного вещества смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» (авторское наименование) вируса ВД КРС, из штамма «№101 ВНИИЗЖ» (авторское наименование) ротавируса КРС и из штамма «ВНИИЗЖ» (авторское наименование) коронавируса КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность в организме животного при введении ему целевого препарата, и в качестве целевой добавки масляный адъювант в эффективном соотношении. Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина, ассоциированная против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионная инактивированная.

2. Активное вещество в виде смеси авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, из штамма «№101 ВНИИЗЖ» (авторское наименование) ротавируса КРС и из штамма «ВНИИЗЖ» (авторское наименование) коронавируса КРС, полученных в культурах клеток животного происхождения в количествах, обеспечивающих протективную иммунную активность каждого антигена в организме животного при введении ему целевого препарата.

3. Целевые добавки.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина, ассоциированная против ВД, ротавирусной и коронавирусной инфекций КРС, эмульсионная инактивированная.

2. Активное вещество.

3. Целевые добавки.

По сравнению с вакциной-прототипом существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь авирулентных очищенных антигенных материалов из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (Таурус-2), в эффективном количестве.

3. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) не менее 6,65 lоg₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

4. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (RBT), в эффективном количестве.

5. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,65 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

6. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки сайги (ПС), в эффективном количестве.

7. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток ПС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,65 lоg₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

8. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

9. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ), в эффективном количестве.

10. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток СПЭВ с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 4,0 lоg₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

11. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2, в эффективном количестве.

12. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 4,0 lоg₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

13. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки (Vero), в эффективном количестве.

14. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 4,0 log2 до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

15. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки эмбриона макаки (Маrс-145), в эффективном количестве.

16. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма«№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Магс-145 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 4,0 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

17. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, в эффективном количестве.

18. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT, в эффективном количестве.

19. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток RBT с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в реакции гемагглютинации (РГА) не менее 8,0 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

20. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток почки теленка (MDBK), в эффективном количестве.

21. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток MDBK с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в РГА не менее 8,0 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

22. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре Таурус-2, в эффективном количестве.

23. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Таурус-2 с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в РГА не менее 8,0 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

24. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре Vero, в эффективном количестве.

25. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток Vero с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦЦ₅₀/см³ и активностью в РГА не менее 8,0 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

26. Из целевых добавок масляный адъювант.

27. Масляный адъювант в количестве 69,6 мас.%.

28. Из целевых добавок дополнительно адъювант сапонин.

29. Сапонин в количестве 0,4 мас.%.

30. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС и из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученных в перевиваемых культурах клеток млекопитающих и целевые добавки масляный адъювант и сапонин в соотношении, мас.%:

Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма«NАDL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, взятой из группы, содержащей культуру клеток Таурус-2, культуру клеток RBT и культуру клеток ПС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,65 lоg₂ до инактивации 10,0. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, взятой из группы, содержащей культуру клеток СПЭВ, культуру клеток Таурус-2, культуру клеток Vero и культуру клеток Маrс-145 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 4,0 log2 до инактивации 10,0. Авирулентный и очищенный антигенный материал из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, полученного в перевиваемой культуре клеток млекопитающих, взятой из группы, содержащей культуру клеток RBT, культуру клеток MDBK, культуру клеток Таурус-2 и культуру клеток Vero с инфекционной активностью не менее 5,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в РГА не менее 8,0 log2 до инактивации 10,0. Масляный адъювант, 69,6 Сапонин, 0,4. В результате проведенных исследований авторами установлено, что между антигенами, входящими в состав предлагаемой вакцины, отсутствует конкуренция. Авторами обнаружено также явление синергизма при соединении указанных антигенов в предлагаемой вакцине, что позволило снизить их количественное содержание в препарате при сохранении такой же напряженности и длительности иммунитета у вакцинированных животных, как и при использовании для иммунизации соответствующих монопрепаратов.

Источником для получения производственного штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС послужил референсный штамм «NADL» вируса ВД КРС, полученный ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.08.2004 г. из коллекции типовых культур АТСС (США).

Производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных биологических системах культивирования.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» адаптирован к перевиваемой культуре клеток млекопитающих, выбранной из группы, содержащей монослойную перевиваемую культуру клеток почки сайги (ПС), монослойную перевиваемую культуру клеток почки теленка (Таурус-2) и монослойную перевиваемую культуру клеток почки теленка (RBT), имеет стабильные биологические свойства, которые позволяют использовать его в качестве производственной расплодки для получения антигенного материала для вакцины против ВД КРС эмульсионной инактивированной.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС депонирован 4 августа 2009 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «NADL-ВНИИЗЖ» - ДЕП вируса диареи КРС (11).

По сравнению с исходным штаммом штамм «NADL-ВНИИЗЖ» имеет генетические и фенотипические особенности. В отличие от штамма «NADL» штамм «NADL-ВНИИЗЖ» репродуцируется в перевиваемых культурах клеток RBT, ПС и Таурус-2, обладает инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняет высокую антигенную и иммуногенную активность после инактивации.

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (11).

Морфологические признаки

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ВД КРС: сферический вирион диаметром 40-60 нм состоит из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии, содержащего позитивную одноцепочечную РНК.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «NADL-ВНИИЗЖ» относится к первому генотипу.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой.

Вирус реагирует с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных инактивированный вирус индуцирует образование вирусспецифических и вируснейтрализующих антител в организме морских свинок в титрах от 10,9 до 11,2 log₂ в ИФА и 7,0 log₂ в РМН, у кроликов - от 10,8 до 11,4 log₂ (ИФА) и от 6,0 до 7,1 log₂ (РМН), у телят и коров - от 10,2 до 10,7 log₂ (ИФА) и от 7,6±0,40 до 7,3±0,31 log₂ (РМН).

Генотаксономическая характеристика

Геном штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС представлен позитивной одноцепочечной РНК размером около 12500 нуклеотидов с единственной открытой рамкой считывания. Открытая рамка считывания начинается с 386 нуклеотида. Вся информация о протеинах содержится в одной рамке считывания.

Выделено и охарактеризовано 10 протеинов: 4 структурных и 6 неструктурных. Одноцепочечная РНК связана с капсидным протеином р14/С, окруженным наружными гликопротеинами (gр25/Е1, gр53/Е2, gр48/Е0), и липидной оболочкой.

Наружный гликопротеин gр53/Е2 индуцирует в организме животных выработку вируснейтрализующих антител в высоких титрах. Протеин gр48/Е0 способен индуцировать у инфицированных животных высокий уровень антител, но с низкой вируснейтрализирующей активностью. У инфицированных животных антитела к gр25/Е1 вырабатываются в низких титрах.

Методом ОТ-ПЦР был амплифицирован участок генома вируса диареи КРС, включающий 149 н.о. 5'-нетранслируемой области.

В результате проведенных исследований было установлено, что штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС является близкородственным референтному штамму «NADL», от которого отличается на анализируемом участке одним нуклеотидом.

Такие единичные замены в структуре белка, предположительно, привели к существенным изменениям в антигенных свойствах вируса.

Биотехнологическая характеристика

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС репродуцируется в перевиваемых культурах клеток почки теленка (MDBK, Таурус-2, ПТ, RBT), перевиваемой линии культуры клеток ПС, перевиваемой линии культуры клеток слизистой кишечника КРС (FBI) и внутривидовой гибридной перевиваемой линии культуры клеток почки эмбриона свиньи со спленоцитами свиньи (А₄С₂).

Результаты адаптации вируса ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» к культурам клеток Таурус-2, RBT и ПС представлены в таблицах 1,2,3. Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Физические свойства

Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы находится в диапазоне 1,12-1,13 г/см³, коэффициент седиментации вирионной РНК составляет 138S.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС наиболее устойчив при рН 7,4. Вирус хорошо сохраняется в нативном виде при 4°С, минус 20°С и минус 40°С. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, трипсину, кислому значению рН (3,0) и дезоксихалату натрия; при 37°С погибает через 5 дней.

Инактивированный вирус ВД КРС штамма «NADL-ВНИИЗЖ» устойчив при хранении при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированной вакцины.

Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижают вирулентность и иммуногенность вируса.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток Таурус-2, RBT, ПС в течение 10 серийных пассажей.

Патогенность - не патогенен для морских свинок, кроликов и белых мышей.

Вирулентность - выражена. Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и посторонними вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно монослойные культуры клеток Таурус-2, RBT и ПС, выращенные в 1,5 дм³ матрасах или вращающихся сосудах объемом 3 дм³. Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации вируса ВД штамма «NADL-ВНИИЗЖ» используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,15%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36÷37°С в течение 24 часов при значении рН 7,6-7,8 с периодическим перемешиванием суспензии (каждые 5-6 часов по 3-5 минут). По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в антигенный материал тиосульфата натрия. Для этого в охлажденную до 2÷8°С суспензию антигена добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины используют антигенный материал из штамма «NADL-ВНИИЗЖ» вируса ВД КРС с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 6,65 log₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

Исходный вирус для получения штамма «№101 ВНИИЗЖ» выделен из патологического материала телят, павших на территории Украины.

Производственный штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС получен путем многократных последовательных пассажей в чувствительных биологических системах (MDBK, Vero, Mark-145). Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, государственного учреждения «Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (ВГНКИ) 12 марта 2001 года под регистрационным шифром «№101 ВНИИЗЖ-ДЕП».

Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (12).

Морфологические свойства

Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС относится к семейству Reoviridae, роду Rotavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ротавирусной инфекции КРС:

сферическая форма диаметром 65-75 нм, имеющая вид «колеса». Вирион состоит из сердцевины, внутреннего и наружного капсида. Сердцевина диаметром 40-45 нм имеет гексагональную форму и состоит из 3-х белков (VP1,VP2 и VP3) и РНК. Внутренний капсид (диаметр 15-20 нм) имеет икосаэдрическую форму и построен из 260 морфологических единиц, каждая из которых представлена белком VP6. Наружный капсид представлен белком VP7. На поверхности наружного капсида расположены «шипики», представленные димером белка VP4.

Антигенные свойства

Антиген ротавируса КРС штамма «№101 ВНИИЗЖ» индуцирует в организме иммунизированных морских свинок и кроликов образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции диффузионной преципитации (РДП) в разведениях от 1:16 до 1:64. В ИФА сыворотки положительно реагировали в разведениях от 1:128 до 1:2048, в реакции связывания комплемента (РСК) от 1:40 до 1:160.

В сыворотках крови глубокостельных коров через 10 дней после второй вакцинации антитела к ротавирусу КРС в ИФА выявляли в титрах от 8,2 до 10,8 log₂, в молозиве от вакцинированных коров титры антител к ротавирусу в ИФА составляли 8,8-14,0 log₂. Скармливание такого молозива обеспечивает высокий уровень колостральных антител (7,0-8,5 log₂) в организме телят.

Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС обладает широким антигенным спектром и доминантностью. Средний показатель двустороннего антигенного родства (R%) используемого штамма в реакции нейтрализации (РН) с 12 эталонным и эпизоотическими штаммами ротавируса КРС составил 56,3%.

Генотаксономическая характеристика

Геном ротавируса КРС состоит из 11 фрагментом 2-спиральной РНК. Ротавирусу КРС присуща значительная вариабельность вирулентности и антигенности. Известны 3 серотипа возбудителя и, кроме того, у КРС выявлены AT к 3-серотипам ротавируса человека. Кроме существования 3-х серотипов вируса не исключается возможность циркуляции атипичных ротавирусов.

Биотехнологические характеристики

Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС адаптирован к культурам клеток MDBK, СПЭВ, КСТ, Vero и Маrс-145 и репродуцируется в них в течение 18-48 часов при 37°С со степенью накопления от 10⁶ до 10⁸ вирусных частиц/см³. Результаты исследований по адаптации штамма «№101 ВНИИЗЖ» к указанным культурам клеток представлены в таблице 4.

Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в указанных культурах на протяжении 20 пассажей (срок наблюдения).

Физические свойства

Плавучая плотность полных вирионов ротавируса КРС в градиенте хлористого цезия составляет 1,36 г/см³, а однокапсидных частиц 1,38 г/см³. Коэффициент седиментации полных частиц составляет 500-530 S, а однородных частиц 380÷400 S.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС устойчив к хлороформу, фреону, эфиру, кислой (рН 4,0) и щелочной (рН 8,0) средам. Возбудитель устойчив к воздействию трипсина.

Инактивированный антиген ротавируса КРС штамма «№101 ВНИИЗЖ» устойчив в процессе хранения при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированных вакцинных препаратов. Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированных вакцинных препаратов, препарата для гипериммунизации доноров диагностических сывороток и антительных лечебных препаратов.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в перевиваемых культурах клеток на протяжении 20 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - не патогенен для морских свинок, кроликов и белых мышей.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Штамм «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно культуры клеток СПЭВ.

При необходимости для получения антигенного материала из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС можно использовать культуры клеток Таурус-2, Vero и Маrс-145.

Полученный вируссодержащий материал освобождают от клеточного детрита и других балластных примесей низкоскоростным центрифугированием или любым другим известным методом.

Для инактивации ротавируса используют АЭЭИ, который вносят в очищенную вируссодержащую суспензию до концентрации 0,15%. Инактивацию вируса проводят при температуре 36-37°С в течение 24 часов. По окончании инактивации АЭЭИ нейтрализуют внесением в суспензию антигена тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Для изготовления эмульсионной формы предлагаемой вакцины используют антигенный материал из штамма «№101 ВНИИЗЖ» ротавируса КРС, полученного в культуре клеток СПЭВ, или Таурус-2, или Vero или Магс-145 с инфекционной активностью не менее 6,0 lg ТЦД₅₀/см³ и активностью в ИФА не менее 4,0 lоg₂ до инактивации, в количестве 10,0 мас.%.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения производственного штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС, выделен из фекалий новорожденного теленка с нарушением функции желудочно-кишечного тракта. Производственный штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС адаптирован к культурам клеток MDBK, Таурус-1, КСТ и Vero.

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС депонирован 12 марта 2001 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, государственного учреждения «Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (ВГНКИ) под регистрационным наименованием «ВНИИЗЖ-ДЕП».

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС характеризуется следующими признаками и свойствами (13).

Морфологические признаки

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС относится к семейству Coronaviridae, роду Coronavirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя коронавирусной инфекции КРС: сферический или плеоморфный вирион диаметром 80-100 нм состоит из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой имеются булавовидные выступы длиной 18-24 нм, образующие подобие солнечной короны. В составе вирионов обнаружены три структурных белка: пепломерный гликопротеин Е2 (180-200 кД), нуклеокапсидный фосфопротеин N (50-60 кД) и матриксный гликопротеин Е1 (23-30 кД).

Антигенные свойства

Антиген коронавируса КРС штамма «ВНИИЗЖ» индуцирует в организме морских свинок и кроликов образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции торможения гемагглютинации (РТГА). В сыворотках крови вакцинированных кроликов уровень антител колеблется от 5,4±0,25 до 7,25±0,47 log₂ (в среднем 6,32±0,39 log₂), а в сыворотках крови иммунизированных морских свинок - от 5,4±0,38 до 8,2±0,8 log₂ (в среднем 6,1±0,49 log₂).

В сыворотках крови проб, отобранных за 10÷15 дней до отела, дважды вакцинированных коров выявляются антитела в РТГА в титрах от 7,9±0,35 до 8,9±0,47 log₂.

Своевременное скармливание такого молозива обеспечивает высокий уровень колостральных антител (до 8,0 log₂) в организме новорожденных телят.

Генотаксономическая характеристика

Геном вируса представлен однонитевой, фрагментированной РНК.

Биотехнологические характеристики

Коронавирус КРС штамма «ВНИИЗЖ» репродуцируется в культурах клеток почек теленка (MDBK, Таурус-1), коронарных сосудов теленка (КСТ) и в гетерологичной культуре клеток почек обезьяны (Vero). При 37°С в течение 3-4 суток инкубирования вирус накапливается в количестве до 10⁸ вирусных частиц/см³ (данные электронномикроскопического исследования). Результаты исследований по адаптации коронавируса КРС штамма «ВНИИЗЖ» к культурам клеток RBT, MDBK, Таурус-2 и Vero представлены в таблице 5.

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС обладает способностью в культуре клеток MDBK репродуцироваться с такой же степенью накопления при 34°С. Срок репродукции при этой температуре увеличивается почти на сутки, однако позволяет получать двойной урожай вируса путем смены поддерживающей среды. «Слив» обладает высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью.

Физические свойства

Плавучая плотность вирионов в градиенте сахарозы составляет 1,15÷1,18 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС проявляет максимальную устойчивость в диапазоне рН 6,0÷7,2. Кислая (рН 3,0) и щелочная (рН 11,0) среды оказывает на вирус инактивирующее действие. Возбудитель устойчив к воздействию трипсина. Вирус разрушается жирорастворителями: хлороформом, метиленхлоридом, эфиром, твином и тритоном Х-100. Инактивированный антиген коронавируса КРС штамма «ВНИИЗЖ» устойчив в процессе хранения при 4°С как в нативном состоянии, так и в составе инактивированных вакцин.

Дополнительные признаки и свойства

Антигенная активность - обладает антигенностью в составе инактивированной вакцины и препарата для гипериммунизации доноров диагностических и лечебных сывороток.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Стабильность - сохраняет исходные биологические (антигенные) свойства при пассировании в культуре клеток MDBK в течение 30 пассажей (срок наблюдения).

Патогенность - не патогенен для морских свинок кроликов и белых мышей.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Штамм «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами.

Для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС в качестве чувствительной биологической системы используют преимущественно культуру клеток RBT и Таурус-2.

При необходимости для получения антигенного материала из штамма «ВНИИЗЖ» коронавируса КРС можно использовать культуры клеток MDBK и Vero.

Полученный вируссодержащий материал очищают от балластных примесей центрифугированием ил