Мутеины липокалина слезной жидкости, обладающие аффинностью к с-мет рецепторной тирозинкиназе человека и способы их получения

Мутеины липокалина слезной жидкости, обладающие аффинностью к с-мет рецепторной тирозинкиназе человека и способы их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

В данной заявке заявлен приоритет предварительной заявки США 61/024658, поданной 30 января 2008, содержание которой включено таким образом посредством ссылки во всей ее полноте для всех целей.

Настоящее изобретение относится к мутеину липокалина слезной жидкости человека (hTLc), обладающему обнаруживаемой способностью связывания с Met-рецепторной тирозинкиназой (c-Met), или ее доменом, или фрагментом. Такой мутеин содержит аминокислотные замены по меньшей мере в одном положении последовательности, соответствующем положениям последовательности 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 и 108 в hTLC. Изобретение также относится к соответствующим молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим такой мутеин, и к способу их получения. Кроме того, изобретение относится к способу продуцирования такого мутеина. Наконец, изобретение направлено на фармацевтическую композицию, содержащую такой липокалиновый мутеин, а также на различные применения мутеина.

Met-рецепторную тирозинкиназу (RTK) сначала идентифицировали как продукт человеческого онкогена Tpr-Met (Park et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA, Vol.84, стр.6379-6383, 1987). Лиганд для c-Met идентифицировали как фактор роста гепацитов (HGF). HGF первоначально идентифицировали как митоген для гепатоцитов при культивировании. HGF идентичен рассеивающему фактору (SF), произведенному из фибропласта фактору, который способствует рассеянию слоев эпителиальных клеток, а также генезису ветвящихся трубочек эпителия, выращенному в объемных культурах. HGF/SF является, таким образом, уникальным фактором роста, который вызывает множественные клеточные ответы, включая митогенез, клеточную подвижность и морфогенез.

HGF/SF и c-Met экспрессируются во многих тканях у взрослых. Белок с-Met экспрессируется, главным образом, в эпителиальных клетках, но также в эндотелиальных клетках, нервных клеток, гепатоцитах, гематопоэтических клетках, меланоцитах. Возможно, c-Met представляет собой один из наиболее важных мембранных рецепторов. Его активация играет ключевую роль в клеточной физиологии: митогенезе, мотогенезе, морфогенезе. Представляется, что HGF/SF продуцируется клетками мезенхимного происхождения.

Если HGF/SF активирует c-Met, то первыми белками, активируемыми по ходу транскрипции, являются Grb2 (белок 2, связывающийся с рецептором фактора роста) и Gab 1 (связывающий элемент 1, ассоциированный с белком 2, связывающимся с рецептором фактора роста). Grb2, в свою очередь, может активировать ряд киназных путей, включая путь от Ras до Raf до Мек и до МАРК (митоген-активированная протеинкиназа). Gab 1 активирует PI3K (фосфоинозитид-3-киназу), которая активирует STAT3 (преобразователь сигнала и активатор транскрипции). Активация c-Met также индуцирует активацию бета-катенина, ключевого компонента wnt-пути, который перемещается в ядро и участвует в регуляции транскрипции.

Путь HGF/c-Met играет важную роль в развитии рака. Во-первых, посредством активации ключевых онкогенных путей (Ras, PI3K/STAT3, бета-катенин), во-вторых, посредством пролиферации эндотелиальных клеток (неоангиогенез), в-третьих, посредством усиленного продуцирования протеазы и, следовательно, клеточной диссоциации, приводящей к метастазированию.

Различные новые терапевтические подходы, некоторые из них в фазе I или II клинических испытаний, нацелены на путь HGF/c-Met. Такие подходы включают анти-HGF моноклональные антитела, такие как гуманизированная форма AV299 от AVEO или полностью человеческое антитело, называемое антителом АМВ 102 от Amgen (AMGI 02). Другой подход представляет собой использование укороченных вариантов c-Met, которые действуют, как ловушки. Одним таким примером является укороченная версия, названная CGEN241, от COMPUGEN. Также для терапевтической цели используют ингибиторы протеинкиназы (небольшие молекулы), которые блокируют c-Met-индуцированные пути. Примеры таких небольших молекул ингибиторов протеинкиназы включают ARQI 97 от ARQULE, XL880 от EXELIXIS, SGX523 от SGX Pharmaceuticals, MP470 от SUPERGEN или PF2341066 от PFIZER.

Однако по-прежнему желательно иметь дополнительные доступные соединения, которые связывают c-Met и которые можно, например, использовать для терапевтических целей.

Таким образом, целью изобретения является предложение мутеинов липокалина слезной жидкости человека, обладающих высоким сродством связывания с данной мишенью.

Данная цель достигается, например, с помощью мутеина липокалина слезной жидкости человека (hTIc), имеющего обнаруживаемую аффинность связывания с Met-рецепторной тирозинкиназой человека (c-Met), или ее доменом, или фрагментом, где такой мутеин содержит аминокислотную замену по меньшей мере в одном положении последовательности, соответствующем положениям последовательности hTLC 26-34, 56-58, 80з83, 104-106 и 108.

В родственном аспекте настоящего изобретения предлагается способ получения мутеина липокалина слезной жидкости человека, где мутеин связывает c-Met с обнаруживаемой аффинностью связывания. Данный способ включает:

(а) подвергание молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей липокалин слезной жидкости человека, мутагенезу по меньшей мере в одном кодоне в каком-либо из положений аминокислотной последовательности 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 и 108 линейной полипептидной последовательности нативного зрелого липокалина слезной жидкости человека, где по меньшей мере один из кодонов, кодирующий остатки цистеина в положениях последовательности 61 и 153 линейной полипептидной последовательности зрелого липокалина слезной жидкости человека, мутирован, чтобы кодировать любой другой аминокислотный остаток, таким образом получается совокупность нуклеиновых кислот, кодирующих мутеины липокалина слезной жидкости человека,

(б) экспрессирование одной или более молекул нуклеиновой кислоты мутеина, полученных в (а), в системе экспрессии, таким образом получается один или более чем один мутеин, и

(в) обогащение одного или более мутеинов, полученных на стадии (б) и имеющих обнаруживаемую аффинность связывания в отношении Met, путем селекции и/или изоляции.

В данном контексте следует отметить, что авторы изобретения неожиданно обнаружили, что удаление структурной дисульфидной связи (на уровне библиотеки соответствующих неподвергнутых воздействию нуклеиновых кислот) липокалина дикого типа из слезной жидкости, которую образуют остатки 61 и 153 цистеина (смотри Breustedt, et al. (2005), The 1.8-A crystal structure of human tear lipocalin reveals an extended branched cavity with capacity for multiple ligands. J. Biol. Chem. 280, 484-493), дает мутеины липокалина слезной жидкости, которые не только устойчиво сложены, но, кроме того, также способны связывать данный искусственный лиганд с аффинностью в низком пикомолярном интервале.

Термин "мутагенез" при использовании в данном описании изобретения означает, что экспериментальные условия выбраны так, что аминокислота, встречающаяся в природе в данном положении последовательности липокалина слезной жидкости человека (Swiss-Prot data bank entry P31025), может быть заменена по меньшей мере одной аминокислотой, которая не присутствует в данном конкретном положении в соответствующей природной полипептидной последовательности. Термин "мутагенез" также включает (дополнительную) модификацию длины сегментов последовательности путем делеции или вставки одной или более аминокислот. Таким образом, в рамки изобретения входит то, что, например, одна аминокислота в выбранном положении последовательности заменена отрезком из трех случайных мутаций, что приводит к вставке двух аминокислотных остатков по сравнению с длиной соответствующего сегмента белка дикого типа. Такую вставку делеции можно вводить независимо друг от друга в любой из пептидных сегментов, который может быть подвержен мутагенезу по изобретению. В одном типичном воплощении изобретения вставку нескольких мутаций можно вводить в петлю АВ выбранного липокалинового каркаса (смотри международную патентную заявку WO 2005/019256, которая включена в данное описание изобретения посредством ссылки во всей полноте). Термин "случайный мутагенез" означает, что в некотором положении последовательности отсутствует заданная единственная аминокислота (мутация), но что по меньшей мере две аминокислоты могут быть введены с определенной вероятностью в заданное положение последовательности во время мутагенеза.

Кодирующую последовательность липокалина слезной жидкости человека (Redl, В. et al. (1992) J. Biol, Chem. 267, 20282-20287) используют в качестве отправной точки для мутагенеза пептидных сегментов, выбранных в настоящем изобретении. В отношении мутагенеза указанных аминокислотных положений, специалист в данной области техники имеет в своем распоряжении различные общепринятые стандартные способы для сайт-направленного мутагенеза (Sambrook, J. et al. (1989), выше). Широко используемым способом является введение мутаций при помощи PCR (полимеразной цепной реакции), с использованием смесей синтетических олигонуклеотидов, которые несут композицию вырожденных оснований в желательных положениях последовательности. Например, использование кодона NNK или NNS (где M = аденин, гуанин или цитозин или тимин; K = гуанин или тимин; S = аденин или цитозин) позволяет включить все 20 аминокислот в дополнение к янтарному стоп-кодону в процессе мутагенеза, тогда как кодон WS ограничивает количество возможно включенных аминокислот до 12, так как он исключает аминокислоты Cys, lie, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val из введенных в выбранное положение полипептидной последовательности; использование кодона HMS (где M = аденин или цитозин), например, ограничивает количество возможных аминокислот до 11 в выбранном положении последовательности, так как он исключает аминокислоты Arg, Cys, Gly, lie, Leu, Met, Phe, Trp, Val из введенных в выбранное положению последовательности. В этом отношении следует отметить, что кодоны для других аминокислот (кроме обычных 20 встречающихся в природе аминокислот), таких как селеноцистеин или пирролизин, также могут быть включены в нуклеиновую кислоту мутеина. Также возможно, как описано в Wang, L., et al. (2001) Science 292, 498-500, или Wang, L., and Schultz, P.G. (2002) Chem. Comm. 1, 1-11, использовать "искусственные" кодоны, такие как UAG, которые обычно признают стоп-кодонами, для вставки других необычных аминокислот, например орто-метил-L-тирозина или пара-аминофенилаланина.

Использование нуклеотидных конструктивных блоков с пониженной специфичностью пар оснований, таких как, например, инозин, 8-оксо-2'-дезоксигуанозин или 6(2-дезокси-β-D-рибофуранозил)-3,4-дигидро-8Н-пириминдо-1,2-оксазин-7-он (Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603), является еще одной возможностью введения мутаций в выбранный сегмент последовательности.

Еще одной возможностью является так называемый триплет-мутагенез. В этом способе используются смеси разных нуклеотидных триплетов, каждый из которых кодирует одну аминокислоту, для включения в кодирующую последовательность (Virnekas В, Ge L, Pluckthun A, Schneider KC, Wellnhofer G, Moroney SE. 1994 Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res 22, 5600-5607).

Одна возможная методика ввода мутаций в выбранные участки соответствующих полипептидов основана на использовании четырех олигонуклеотидов, каждый из которых частично производят из одного из соответствующих сегментов последовательности, подлежащих мутированию. При синтезировании таких олигонуклеотидов специалист в данной области техники может использовать смеси нуклеиновокислотных конструктивных блоков для синтеза таких нуклеотидных триплетов, которые соответствуют аминокислотным положениям, подлежащим мутированию, так, что случайным образом возникают кодоны, кодирующие все природные аминокислоты, что, наконец, приводит к образованию библиотеки липокалиновых пептидов. Например, первый олигонуклеотид соответствует по своей последовательности - за исключением мутированных положений - кодирующей нити для пептидного сегмента, подлежащего мутированию, в наиболее M-концевом положении липокалинового полипептида. Соответственно, второй олигонуклеотид соответствует некодирующей нити для второго сегмента последовательности, следующего в полипептидной последовательности. Третий олигонуклеотид соответствует, в свою очередь, кодирующей нити соответствующего третьего сегмента последовательности. Наконец, четвертый олигонуклеотид соответствует некодирующей нити четвертого сегмента последовательности. Полимеразную цепную реакцию можно осуществлять с соответствующим первым и вторым олигонуклеотидом и отдельно, при необходимости, с соответствующим третьим и четвертым олигонуклеотидом.

Продукты амплификации обоих таких взаимодействий можно объединять различными известными способами в одну нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность от первого до четвертого сегментов последовательности, где мутации были введены в выбранные положении. Для этого оба продукта можно, например, подвергать новой полимеразной цепной реакции, используя фланкирующие олигонуклеотиды, а также одну или более медиаторные нуклеиновокислые молекулы, которые составляют последовательность между вторым и третьим сегментом последовательности. В выборе количества и расположения в последовательности олигонуклеотидов, используемой для мутагенеза, специалист в данной области техники имеет в своем распоряжении многочисленные альтернативы.

Молекулы нуклеиновых кислот, определенные выше, можно соединять посредством лигирования с отсутствующими 5'- и 3'-последовательностями нуклеиновой кислоты, кодирующей липокалиновый полипептид и/или вектор, и можно клонировать в известный организм-хозяин. Для сшивания и клонирования доступно множество общепринятых способов (Sambrook, J. et al. (1989), выше). Например, распознаваемые последовательности для рестрикционных эндонуклеаз, также присутствующих в последовательности клонирующего вектора, можно сконструированы в последовательности синтетических олигонуклеотидов. Таким образом, после амплификации соответствующего продукта PCR и ферментного расщепления, полученный фрагмент можно легко клонировать, используя соответствующие распознаваемые последовательности.

Более длинные сегменты последовательности в гене, кодирующем белок, выбранный для мутагенеза, также можно подвергать случайному мутагенезу известными способами, например посредством полимеразной цепной реакции в условиях повышенной частоты появления ошибок, при помощи химического мутагенеза, или используя бактериальные штаммы мутаторов. Такие способы также можно использовать для дополнительной оптимизации целевой аффинности или специфичности липокалинового мутеина. Мутации, вероятно происходящие за пределами сегментов экспериментального мутагенеза, часто допустимы или даже могут оказываться полезными, например, если они способствуют улучшенной эффективности фолдинга или стабильности фолдинга липокалинового мутеина,

Термин "липокалин слезной жидкости человека" при использовании в данном описании изобретения относится к зрелому липокалину слезной жидкости человека, который депонирован в банке данных SWISS-PROT под учетным номером Р31025 и аминокислотная последовательность которого указана в SEQ ID NO: 36 в данном описании изобретения.

В одном воплощении изобретения способ образования мутеина липокалина слезной жидкости человека включает мутацию по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16 или 17 кодонов в любом из положений аминокислотной последовательности 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 и 108 линейной полипептидной последовательности зрелого липокалина слезной жидкости человека. В другом воплощении мутированы все 18 кодонов в положениях аминокислотной последовательности 26,27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 56, 57, 58, 80, 83, 104, 105, 106 и 108 линейной полипептидной последовательности зрелого липокалин слезной жидкости человека. Таким образом, Met-связывающий мутеин по изобретению может содержать мутацию в любой из положений 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17 или 18 аминокислотной последовательности 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 и 108 линейной полипептидной последовательности зрелого липокалина слезной жидкости человека. Однако специалисту в данной области техники понятно что, то проведение в некотором положении последовательности мутагенеза необязательно означает, что выбранная возможная аминокислотная замена будет действительно иметь место в мутеине по изобретению. Из-за обратных мутаций или структурно-функционального соотношения аминокислотный остаток последовательности дикого типа липокалина слезной жидкости также может сохраняться в мутеине по изобретению.

В другом аспекте настоящее изобретение включает способ получения мутеина липокалина слезной жидкости человека, где мутеин связывает c-Met как данный искусственный лиганд липокалина слезной жидкости человека с обнаруживаемой связывающей способностью, включающий:

(а) подвергание молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей липокалин слезной жидкости человека, мутагенезу в по меньшей мере одном кодоне любой из положений аминокислотной последовательности 34, 80 и 104 линейной полипептидной последовательности зрелого липокалина слезной жидкости человека, таким образом получение совокупности нуклеиновых кислот, кодирующих мутеины липокалина слезной жидкости человека,

(б) экспрессирование одной или более молекул нуклеиновой кислоты мутеина, полученных в (а), в системе экспрессии, получение таким образом одного или более мутеинов, и

(в) обогащение одного или более мутеинов, полученных в стадии (б) и имеющих обнаруживаемую аффинность связывания с c-Met в качестве данного искусственного лиганда липокалина слезной жидкости человека, посредством селекции и/или выделения.

В одном воплощении вышеизложенного способа дополнительно по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14 или 15 кодонов в любом из положений аминокислотной последовательности 26-33, 56-58, 83, 105-106 и 108 линейной полипептидной последовательности зрелого липокалина слезной жидкости человека мутированы.

В еще одном воплощении изобретения способы по изобретению включают мутацию обоих кодонов, кодирующих цистеин в положениях 61 и 153 в линейной полипептидной последовательности зрелого липокалина слезной жидкости человека. Оба положения могут, например, быть мутированы, чтобы кодировать остаток серина.

В другом воплощении изобретения, которое описано в данном описании изобретения, кодоны, кодирующие положении аминокислотной последовательности 111 и/или 114 линейной полипептидной последовательности зрелого липокалина слезной жидкости человека, мутированы для кодирования, например пролина в положении 111 и триптофана в положении 114.

Другое воплощение способов по изобретению включает мутагенез кодона, кодирующего цистеин в положении 101 линейной полипептидной последовательности зрелого липокалина слезной жидкости человека, так, чтобы данный кодон кодировал любую другую аминокислоту. В одном воплощении мутированный кодон, кодирующий положению 101, кодирует серин. Таким образом, в некоторых воплощениях или два, или все три цистеиновых кодона в положении 61, 101 и 153 заменен кодоном другой аминокислоты.

Согласно способу по изобретению мутеин получают, начиная с нуклеиновой кислоты, кодирующей липокалин слезной жидкости человека. Такую нуклеиновую кислоту подвергают мутагенезу и помещают в подходящий бактериальный или эукариотический организм-хозяин посредством техники рекомбинанирования ДНК. Получение библиотеки нуклеиновых кислот для липокалина слезной жидкости может быть выполнено с использованием любого подходящего способа, который известен в данной области техники, для получения липокалиновых мутеинов с антитело-подобными свойствами, то есть мутеинов, которые обладают аффинностью в отношении данной мишени. Примеры таких комбинаторных способов подробно описаны в международных патентных заявках WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462 WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, WO 2006/56464, или в международной патентной заявке РСТ/ЕР2007/057971, описание которой, например, посредством ссылки, полностью включено в данное описание изобретения. После экспрессии нуклеиновокислотных последовательностей, которые были подвергнуты мутагенезу в подходящем хозяине, из полученной библиотеки можно выбрать клоны, несущие генетическую информацию для совокупности соответствующих липокалиновых мутеинов, которые связывают данную мишень. Для селекции данных клонов может использовать хорошо известные методы, такие как фаговый дисплей (рассмотрен в Kay, B.K. et al. (1996) выше; Lowman, H.B. (1997) выше или Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) выше), скрининг колоний (рассмотрен в Pini, A. et al. (2002) Comb. Chem. High Throughtput Screen. 5, 503-510), рибосомный дисплей (рассмотрен в Amstutz, P. et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405) или мРНК дисплей, как сообщалось в Wilson, D.S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755, или способы, конкретно описанные в WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, WO 2006/56464, или в международной патентной заявке РСТ/ЕР 2007/057971, описание которой, например, полностью включено посредством ссылки в данное описание изобретения.

В соответствии с данным описанием, стадия (в) способа получения c-Met-связывающего мутеина липокалина слезной жидкости дополнительно включает в другом воплощении вышеуказанных способов:

(1) получение c-Met, или его домена, или фрагмента в качестве данного лиганда,

(2) приведение совокупности мутеинов в контакт с указанным лигандом с целью обеспечения образования комплексов между указанным лигандом и мутеинами, обладающими связывающей аффинностью в отношении указанного лиганда, и

(3) удаление мутеинов, не имеющих или имеющих несущественную связывающую аффинность.

Для образования c-Met-связывающих мутеинов липокалина слезной жидкости любую часть (например, фрагмент или один домен) внеклеточных доменов Met-рецепторной тирозинкиназы человека (c-Met) или целые внеклеточные домены (которые содержат N-концевые аминокислотные остатки 1 метионин-треонин 932 зрелого целого рецептора (SWISS Prot: P08581) можно приводить в контакт с мутеинами (совокупностью), которые были получены в результате экспрессии библиотеки (ранее не подверженных воздействию) нуклеиновых кислот, которые кодируют эти мутеины. Можно использовать имеющиеся в продаже внеклеточные домены, которые, например, предлагают в виде остатков 1-932, слитых с Fc-областью человеческого IgG посредством полипептидного линкера, например (R&D Systems, USA, номер в каталоге 358-МТ). Дополнительные примеры фрагментов c-Met, которые можно использовать для получения мутеинов, описанных здесь, включают, без ограничения ими, фрагмент, состоящий из остатков Met 25-567, как описано в Stamos et al., The EMBO Journal Vol.23, No. 12, 2004, стр.2325-2335, которые содержат семь доменов Sema, или более крупные фрагменты, которые содержат остатки 25-567. Фрагменты, связывающие домен SEMA, можно использовать, если мутеины по изобретению предназначены для конкурирования со связыванием HGF с доменами Sema. Такие мутеины могут (но не обязательно должны, смотри примеры) являться антагонистами HGF. Также можно использовать фрагменты, такие как фрагмент, содержащий остатки 568-932, если следует избежать связывания с доменами Sema. Скрининг также можно осуществлять, используя фрагменты или другие домены, такие как домен PSI (плексин-семафорин-интегрин) или lgG-подобные домены c-Met. Также можно использовать для целей скрининга, например, гомолог обыкновенных шимпанзе (pan troglodytes, 99%-ная идентичность человеческому c-Met), гомолог макак (тасаса mulatta, 98%-ная идентичность), ортолог собаки (cam's familiaris, 88%-ная идентичность), ортолог мыши (SWISS Prot: AI A597, 87%-ная идентичность) или ортолог крысы (rattus norvegicus, 86%-ная идентичность) вместо (внеклеточных доменов) c-Met человека. Такой подход можно, например, использовать, если желательны мутеины, обладающие перекрестной реакционной способностью между человеком и мышиным или крысиным ортологом (или, например, внеклеточными доменами). Как ясно из вышесказанного, можно получать в настоящем изобретении мутеины липокалина слезной жидкости, которые могут обладать антагонистическим действием в отношении HGF. Альтернативно, мутеины могут иметь соответствующий неантагонистический характер связывания (в этом отношении смотри Примеры).

В одном воплощении способа по изобретению селекцию на стадии (в) выполняют в конкурентных условиях. Конкурентные условия при использовании в данном описании изобретения означают, что селекция мутеинов может включать по меньшей мере одну стадию, на которой мутеины и данный искусственный лиганд липокалина слезной жидкости человека (мишень) приводят в контакт в присутствии дополнительного лиганда, такого как HGF, который конкурирует со связыванием мутеинов с мишенью. Такой дополнительный лиганд может представлять собой физиологический лиганд c-Met, такой как HGF, или любой другой нефизиологический лиганд c-Met, такой как анти-c-Met антитело, или небольшую молекулу ингибитора протеин-тирозинкиназы, который связывает по меньшей мере перекрывающийся или частично перекрывающийся эпитоп с эпитопом, распознаваемым мутеинами по изобретению, и таким образом препятствует связыванию мутеинов с мишенью. Альтернативно, такой дополнительный лиганд может конкурировать со связыванием мутеинов путем образования комплекса с эпитопом, отличным от сайта связывания мутеинов с c-Met, посредством аллостерических эффектов.

Воплощение метода фагового дисплея (рассмотрен в Kay, B, K. et al. (1996), выше; Lowman, Н. В. (1997) выше или Rodi, D, J., and Makowski, L. (1999), выше) с использованием умеренного фага М13 приведено в качестве примера способа селекции, который может быть использован в настоящем изобретении. Другим воплощением метода фагового дисплея, которое может быть использовано для селекции мутеинов по изобретению (смотри экспериментальный раздел), является гиперфаговый фаговый метод, который описан Broders et al. (Broders et al. (2003) "Hyperphage. Improving antibody presentation in phage display." Methods MoL Biol. 205: 295-302). Также можно использовать другой умеренный фаг, такой как f1, или литический фаг, такой как Т7. Для типичного метода селекции продуцируют фагмиды М13, что обеспечивает возможность экспрессии мутированной липокалиновой нуклеиновокислотной последовательности в виде слитого белка с сигнальной последовательностью на N-конце, предпочтительно сигнальной последовательностью OmpA, и с капсидным белком pill фага М13 или его фрагментами, способными включаться в капсид фага на С-конце. C-концевой фрагмент ΔpIII фагового капсидного белка, содержащий аминокислоты 217-406 последовательности дикого типа, предпочтительно используют для продуцирования слитых белков. Особенно предпочтительным в одном воплощении является С-концевой фрагмент pIII, в котором остаток цистеина в положении 201 отсутствует или заменен другой аминокислотой.

Таким образом, еще одно воплощение способов по изобретению включает функциональное слияние нуклеиновой кислоты, кодирующей совокупность мутеинов липокалина слезной жидкости человека и полученной в результате мутагенеза на 3'-конце, с геном, кодирующим оболочечный белок pill филаментного бактериофага семейства М13 или фрагмент этого оболочечного белка, чтобы выбрать по меньшей мере один мутеин для связывания c-Met.

Слитый белок может содержать дополнительные компоненты, такие как маркер аффинности, который делает возможной иммобилизацию, обнаружение и/или очистку слитого белка или его частей. Кроме того, стоп-кодон может быть помещен между участками последовательности, кодирующей липокалин или его мутеины, и геном фагового капсида или его фрагментами, где стоп-кодон, предпочтительно янтарный стоп-кодон, по меньшей мере частично транслируется в аминокислоту в ходе трансляции в подходящем супрессорном штамме.

Например, фазмидный вектор pTLPC27, в настоящее время также называемый рТ1 с27, который описан в международной патентной заявке РСТ/ЕР 2007/057971, может быть использован для получения фагмидной библиотеки, кодирующей мутеины липокалина слезной жидкости человека. Молекулы нуклеиновых кислот по изобретению, кодирующие мутеины липокалина слезной жидкости, могут быть вставлены в вектор с использованием двух сайтов рестрикции BstXI. После сшивания подходящий хозяйский штамм, такой как Е.coli XLI-Blue, трансформируют полученной смесью нуклеиновых кислот с получением большого количества независимых клонов. При желании может быть получен соответствующей вектор для получения гиперфагмидной библиотеки. Альтернативно, любой другой подходящий фагмидный вектор, такой как, например, вектор pTLPC59, который используют в Примерах настоящей заявки (смотри Пример 1 и Фиг.1), также можно использовать для получения фагмидной библиотеки. Вектор pTLPC59 идентичен вектору pTLc27 за исключением того, что библиотечную генную конструкцию для фагового дисплея помещают под контроль lac p/о вместо tet p/о и генетически сливают в полноразмерный ген III фага VCSM13.

Полученная библиотека может быть затем суперинфицирована в жидкостной культуре подходящим М13-хелперным фагом или гипрефагом для продуцирования функциональных фагмид. Рекомбинантная фагмида экспонирует липокалиновый мутеин на своей поверхности в виде слитого белка с оболочкой белка pIII или его фрагментом, в то время как N-концевая сигнальная последовательность слитого белка обычно отщепляется. В то же время, она также несет одну или более копий нативного капсидного белка pill, поставляемого хелперным фагом, и, таким образом, способна инфицировать реципиента в общем случае бактериальным штаммом, несущим F- или F'-плазмиду. В случае гиперфагового дисплея гиперфагмиды экспонируют липокалиновые мутеины на своей поверхности в виде слитого белка с инфицирующим оболочечным белком pIII, но не нативным капсидным белком. Во время или после инфицирования хелперным фагом или гиперфагом можно индуцировать экспрессию гена слитого белка между липокалиновым мутеином и капсидным белком pIII, например путем добавления ангидротетрациклина. Условия индицирования выбирают так, чтобы существенная фракция полученных фагмид экспонировала по меньшей мере один липокалиновый мутеин на своей поверхности. В случае гиперфагового дисплея условия индуцирования приводят к популяции гиперфагмид, несущих от трех до пяти слитых белков, состоящих из липокалинового мутеина и капсидного белка pIII. Известны различные способы выделения фагмид, такие как осаждение полиэтиленгликолем. Выделение обычно происходит после инкубационного периода 6-8 часов.

Выделенные фазмиды затем можно подвергать селекции путем инкубирования с желательной мишенью (то есть внеклеточными доменами c-Met или его частями или фрагментами), где мишень представлена в форме, обеспечивающей по меньшей мере временную иммобилизацию тех фагмид, которые несут мутеины с желательной связывающей активностью, в виде слитых белков на их оболочке. Среди различных воплощений, известных специалисту в данной области техники, мишень можно, например, конъюгировать с белком-носителем, таким как сывороточный альбумин, и связывать посредством такого белка-носителя с поверхностью, связывающей белок, например полистиролом. Для такой иммобилизации мишени можно предпочтительно использовать микротитрационные планшеты, подходящие для методов ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), или так называемые "иммуноадгезивы". Альтернативно можно использовать конъюгаты мишени с другими связывающими группами, такими как биотин. Затем мишень можно иммобилизовать на поверхности, которая избирательно связывает данную группу, например на микротитрационных планшетах или парамагнитных частицах, покрытые стрептавидином, нейтравидином или авидином. Если мишень слита с Fc-областью иммуноглобулина, иммобилизацию также можно осуществлять на поверхностях, например микротитрационных планшетах или парамагнитных частицах, которые покрыты белком А или белком G.

Неспецифические фагмид-связывающие сайты, имеющиеся на поверхностях, могут быть насыщены блокирующими растворами, как известно для методов ELISA. Обычно затем фагмиды приводят в контакт с мишенью, иммобилизованной на поверхности в присутствии физиологического буфера. Несвязанные фагмиды удаляют многократными промываниями. Фагмидные частицы, остающиеся на поверхности, затем элюируют. Для элюирования возможны несколько способов. Например, фагмиды можно элюировать путем добавления протеаз или в присутствии кислот, оснований, детергентов или хаотропных солей или в умеренно денатурирующих условиях. Предпочтительным способом является элюирование с использованием буферов с рН 2,2, где элюат затем нейтрализуют. Альтернативно, можно добавлять раствор свободной мишени (то есть внеклеточные домены c-Met или его части или фрагменты) с целью конкурирования с иммобилизованной мишенью за связывание с фагмидами, или мишень-специфичные фагмиды можно элюировать посредством конкурирования с иммуноглобулинами или природными лигандными белками, которые специфически связываются с интересующей мишенью.

Затем клетки Е. coli инфицируют элюированными фагмидами. Альтернативно, нуклеиновые кислоты можно экстрагировать из элюированных фагмид и использовать для анализа последовательности, амплификации или трансформации клеток другим образом. Начиная с клонов Е.coli, полученных таким образом, свежие фагмиды или гиперфагмиды опять получают посредством суперинфицирования фагами-помощниками М13 или гиперфагами согласно способу, описанному выше, и фагмиды, амплифицированные таким образом, снова подвергают селекции на иммобилизованной мишени. Многократные циклы селекции часто необходимы для получения фагмид с мутеинами по изобретению в достаточно обогащенной форме. Количество циклов селекции предпочтительно выбирают так, чтобы в последующем функциональном анализе по меньшей мере 0,1% исследованных клонов продуцировали мутеины с обнаруживаемой аффинностью в отношении данной мишени. В зависимости от размера, то есть сложности используемой библиотеки, для этого обычно требуется 2-8 циклов.

Для функционального анализа выбранных мутеинов штамм Е.coli можно затем инфицировать фагмидами, полученными в циклах селекции, и выделять соответствующую двухнитевую фазмидную ДНК. Начиная с этой фазмидной ДНК, или также с однонитевой ДНК, экстрагированной из фагмид, последовательности нуклеиновых кислот выбранных мутеинов по изобретению можно определить способами, известными в данной области техники, и на основании этого можно установить аминокислотные последовательности. Мутированную область или последовательность целого мутеина липокалина слезной жидкости можно субклонировать на другом векторе экспрессии и экспрессировать в подходящем организме-хозяине. Например, вектор рТ1 с26, описанный в международной патентной заявке РСТ/ЕР 2007/057971, можно использовать для экспрессии в штаммах Е.coli, таких как Е.coli TGI. Таким образом продуцированные мутеины липокалина слезной жидкости можно очищать различными биохимическими методами. Мутеины липокалина слезной жидкости, продуцируемые, например, рТ1 с26, несут аффинный пептид Strep-tag® II (Schmidt et al., выше) на своем С-конце и, следовательно, предпочтительно могут быть очищены стрептавидин-аффинной хроматографией.

Также селекцию можно выполнять другими способами. Многие соответствующие воплощения известны специалисту в данной области техники или описаны в литературе. Кроме того, можно использовать комбинацию способов. Например, клоны, селектированные или по меньшей мере обогащенные посредством "фагового дисплея", можно дополнительно подвергать "скринингу колоний". Преимуществом этого способа является то, что отдельные клоны можно непосредственно выделять с учетом получения мутеина липокалина слезной жидкости с обнаруживаемой связывающей способностью в отношении c-Met или, например, внеклеточного домена c-Met.

В дополнение к использованию Е.coli в качестве организма-хозяина в методе "фагового дисплея" или в методе "скрининга колоний", для этой цели можно использовать другие бактериальные штаммы, дрожжи или также клетки насекомого или клетки млекопитающего. В дополнение к селекции мутеина липокалина слезной жидкости из случайной (ранее не подверженной воздействию) библиотеки, как описано выше, также можно использовать эволютивные методы, включающие ограниченный мутагенез, для оптимизирования мутеина, который уже обладает некоторой связывающей активностью в отношении мишени с учетом аффинности или специфичности в отношении мишени после повторенных циклов скрининга.

Когда выбран мутеин с аффинностью к c-Met, или его домену, или фрагменту, такой мутеин можно дополнительно подвергнуть другому мутагенезу, чтобы выбрать затем варианты с еще более высокой аффинностью или варианты с улучшенными свойствами, такими как более высокая термостабильност