Улучшенная продукция белка в bacillus

Улучшенная продукция белка в bacillus

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к клеткам, которые были генетически модифицированы в целях изменения их способности экспрессировать и/или продуцировать представляющие интерес белки. В частности, настоящее изобретение относится к модифицированным клеткам-хозяевам грамположительных микроорганизмов, таких как Bacillus sp., которые способны сверхэкспрессировать ymaH. Настоящее изобретение охватывает полинуклеотидные конструкции и экспрессионные векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие YmaH, и модифицированные клетки-хозяева, содержащие указанные векторы. В частности, настоящее изобретение относится к композициям и к способам сверхэкспрессии YmaH для повышения уровня экспрессии и продуцирования представляющих интерес белков (например, протеаз) в Bacillus sp.

Предшествующий уровень техники

Генная инженерия позволяет модифицировать микроорганизмы, используемые в качестве биологических реакторов, клеточных «фабрик», а также для ферментации пищевых продуктов. В частности, микроорганизмы вида Bacillus продуцируют и секретируют большое количество ценных белков и метаболитов (Zukowski, «Production of commercially valuable products» In: Doi and McGlouglin (eds.) Biology of Bacilli: Applications to Industry, Butterworth-Heinemann, Stoneham. Mass pp 311-337 [1992]). Самыми широко используемыми в промышленности бациллами являются B. licheniformis, B. amyloliquefaciens и B. subtilis. Благодаря тому, что эти микроорганизмы имеют статус GRAS (generally recognized as safe) (обычно рассматриваемые как безопасные), штаммы этих видов Bacillus являются природными кандидатами на продуцирование белков, используемых в пищевой и фармацевтической промышленностях. Важными продуцируемыми ферментами являются α-амилазы, нейтральные протеазы и щелочные (или сериновые) протеазы. Однако несмотря на достижения в понимании продуцирования белков в клетках-хозяевах Bacillus, сохраняется потребность в усовершенствованных методах экспрессии и продуцирования этих белков микроорганизмами.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к клеткам, которые были генетически модифицированы в целях изменения их способности экспрессировать и/или продуцировать представляющие интерес белки. В частности, настоящее изобретение относится к модифицированным клеткам-хозяевам грамположительных микроорганизмов, таких как Bacillus sp., которые способны сверхэкспрессировать ymaH. Настоящее изобретение охватывает полинуклеотидные конструкции и экспрессионные векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие YmaH, и модифицированные клетки-хозяева, содержащие указанные конструкции и векторы. В частности, настоящее изобретение относится к композициям и к способам сверхэкспрессии YmaH для повышения уровня экспрессии и продуцирования представляющих интерес белков (например, протеаз) в Bacillus sp.

В одном варианте изобретения настоящее изобретение относится к выделенному химерному полинуклеотиду, который содержит полинуклеотидную последовательность, определяющую промотор SigA, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим белок YmaH.

В другом варианте настоящее изобретение относится к выделенному химерному полинуклеотиду, который содержит полинуклеотидную последовательность, определяющую промотор SigA, функционально связанный с полинуклеотидом, кодирующим белок YmaH, где указанный химерный полинуклеотид включает SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3.

В другом варианте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотидную конструкцию, содержащую полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH.

В другом варианте настоящее изобретение относится к вектору, содержащему полинуклеотидную конструкцию, содержащую полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где полинуклеотидная конструкция содержит SEQ ID NO:1, 2, 3 или 13.

В другом варианте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке Bacillus, которая содержит вектор, содержащий полинуклеотидную конструкцию, которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где модифицированная клетка способна продуцировать представляющий интерес белок.

В другом варианте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке-хозяину Bacillus, выбранной из группы, состоящей из B. licheniformis, B subtilis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. pumilus, B. thuringiensis, B. clausii и B. megaterium и содержащей вектор, который содержит полинуклеотидную конструкцию, содержащую полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где модифицированная клетка способна продуцировать представляющий интерес белок.

В другом варианте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке-хозяину Bacillus, содержащей вектор, содержащий полинуклеотидную конструкцию, которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где модифицированная клетка способна продуцировать представляющий интерес белок, который является гомологичным или гетерологичным для модифицированной клетки.

В другом варианте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке-хозяину Bacillus, содержащей вектор, содержащий полинуклеотидную конструкцию, которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где модифицированная клетка способна продуцировать представляющий интерес белок и где экспрессия указанного представляющего интерес белка инициируется промотором aprE.

В другом варианте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке-хозяину Bacillus, содержащей вектор, содержащий полинуклеотидную конструкцию, которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где модифицированная клетка способна продуцировать представляющий интерес белок, выбранный из амилаз, протеаз, ксиланаз, липаз, лакказ, фенолоксидаз, оксидаз, кутиназ, целлюлаз, гемицеллюлаз, эстераз, пероксидаз, каталаз, глюкозооксидаз, фитаз, пектиназ, глюкозидаз, изомераз, трансфераз, киназ, фосфотаз, галактозидаз и хитиназ, гормонов, цитокинов, факторов роста, рецепторов, вакцин и антител.

В другом варианте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке Bacillus, содержащей вектор, содержащий полинуклеотидную конструкцию, которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где модифицированная клетка способна продуцировать фермент.

В другом варианте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке Bacillus, содержащей вектор, содержащий полинуклеотидную конструкцию, которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где модифицированная клетка способна продуцировать протеазу.

В другом варианте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке Bacillus, содержащей вектор, содержащий полинуклеотидную конструкцию, которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где модифицированная клетка способна продуцировать по меньшей мере один субтилизин, выбранный из субтилизина 168, субтилизина BPN', субтилизина Карлсберга, субтилизина B. lentus, субтилизина B. clausii, субтилизина DY, субтилизина 147 и субтилизина 309 и их вариантов.

В другом варианте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке Bacillus, продуцирующей протеазу, которая способна сверхэкспрессировать ymaH, где модифицированная клетка содержит мутацию по меньшей мере в одном гене, выбранном из degU, degQ, degS, sco4, spollE, degQ и degR.

В другом варианте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке Bacillus, продуцирующей протеазу, которая способна сверхэкспрессировать ymaH, где модифицированная клетка содержит мутацию deg(Hy)32.

В другом варианте настоящее изобретение относится к модифицированной клетке Bacillus subtilis, продуцирующей протеазу, способной сверхэкспрессировать ymaH, где модифицированная клетка содержит мутацию по меньшей мере в одном гене, выбранном из degU, degQ, degS, sco4, spollE, degQ и degR.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения модифицированной клетки Bacillus, включающему: трансформацию клетки-хозяина Bacillus вектором, содержащим полинуклеотидную конструкцию, которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где клетка-хозяин Bacillus способна экспрессировать представляющий интерес белок; и выращивание модифицированной клетки Bacillus в условиях роста, благоприятствующих экспрессии представляющего интерес белка.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения модифицированной клетки Bacillus, включающему: трансформацию клетки-хозяина Bacillus вектором, содержащим полинуклеотидную конструкцию, которая находится на реплицирующейся плазмиде и которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где клетка-хозяин Bacillus способна экспрессировать представляющий интерес белок; и выращивание модифицированной клетки Bacillus в условиях роста, благоприятствующих экспрессии представляющего интерес белка.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения модифицированной клетки Bacillus, включающему: трансформацию клетки-хозяина Bacillus вектором, содержащим полинуклеотидную конструкцию, которая интегрирована в геном модифицированной клетки и которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где клетка-хозяин Bacillus способна экспрессировать представляющий интерес белок; и выращивание модифицированной клетки Bacillus в условиях роста, благоприятствующих экспрессии представляющего интерес белка.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу получения модифицированной клетки Bacillus, включающему: трансформацию клетки-хозяина Bacillus вектором, содержащим полинуклеотидную конструкцию, которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA и/или sigH, где клетка-хозяин Bacillus способна экспрессировать по меньшей мере один субтилизин; и выращивание модифицированной клетки Bacillus в условиях роста, благоприятствующих экспрессии субтилизина.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus, включающему культивирование модифицированной клетки Bacillus, способной сверхэкспрессировать ymaH, и выращивание модифицированной клетки Bacillus в условиях роста, благоприятствующих экспрессии представляющего интерес белка. В некоторых вариантах осуществления, представляющим интерес белком является фермент, например субтилизин. В некоторых вариантах осуществления клеткой Bacillus является клетка Bacillus subtilis.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus, включающему культивирование модифицированной клетки Bacillus, способной сверхэкспрессировать ymaH, выращивание модифицированной клетки в условиях роста, благоприятствующих экспрессии представляющего интерес белка, и выделение представляющего интерес белка. В некоторых вариантах осуществления, представляющим интерес белком является фермент, например субтилизин. В некоторых вариантах осуществления клеткой Bacillus является клетка Bacillus subtilis.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus в течение меньшего периода времени, чем в соответствующем предшественнике клетке-хозяине, где указанный способ включает культивирование модифицированной клетки Bacillus, способной сверхэкспрессировать ymaH; и выращивание модифицированной клетки Bacillus в условиях роста, благоприятствующих экспрессии представляющего интерес белка. В некоторых вариантах осуществления, представляющим интерес белком является фермент, например субтилизин. В некоторых вариантах осуществления клеткой Bacillus является клетка Bacillus subtilis.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу продуцирования представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus, где экспрессия представляющего интерес белка инициируется промотором aprE и где указанный способ включает культивирование модифицированной клетки Bacillus, способной сверхэкспрессировать ymaH; и выращивание модифицированной клетки в условиях роста, благоприятствующих экспрессии представляющего интерес белка. В некоторых вариантах осуществления, представляющим интерес белком является фермент, например субтилизин. В некоторых вариантах осуществления клеткой Bacillus является клетка Bacillus subtilis.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу усиления экспрессии представляющего интерес белка из Bacillus, включающему получение модифицированной клетки Bacillus с применением способа, который включает сверхэкспрессию ymaH в родительской клетке-хозяине Bacillus; выращивание полученной модифицированной клетки Bacillus в условиях, благоприятствующих клеточному росту, и экспрессию представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus, где экспрессия представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus усиливается по сравнению с экспрессией того же самого представляющего интерес белка в родительской клетке-хозяине. В некоторых вариантах осуществления, представляющим интерес белком является фермент, например субтилизин. В некоторых вариантах осуществления клеткой Bacillus является клетка Bacillus subtilis.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способам усиления экспрессии представляющего интерес белка из Bacillus, включающему получение модифицированной клетки Bacillus способом, который включает сверхэкспрессию ymaH в родительской клетке-хозяине Bacillus; выращивание полученной модифицированной клетки Bacillus в условиях, благоприятствующих клеточному росту, и экспрессию представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus, где экспрессия представляющего интерес белка в модифицированной клетке усиливается по сравнению с экспрессией того же самого представляющего интерес белка в родительской клетке-хозяине и где сверхэкспрессия включает трансформацию родительской клетки-хозяина Bacillus полинуклеотидной конструкцией, содержащей полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, где полинуклеотид функционально связан с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA или sigH. В некоторых вариантах осуществления, представляющим интерес белком является фермент, например субтилизин. В некоторых вариантах осуществления клеткой Bacillus является клетка Bacillus subtilis.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способам усиления экспрессии представляющего интерес белка из Bacillus, включающим получение модифицированной клетки Bacillus способом, включающим сверхэкспрессию ymaH в родительской клетке-хозяине Bacillus; выращивание модифицированной клетки Bacillus в условиях, благоприятствующих клеточному росту, и экспрессию представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus, где экспрессия представляющего интерес белка в модифицированной клетке усиливается по сравнению с экспрессией того же самого представляющего интерес белка в родительской клетке-хозяине и где сверхэкспрессия включает трансформацию клетки-хозяина Bacillus полинуклеотидной конструкцией, содержащей последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 1, 2, 3 и 13. В некоторых вариантах осуществления представляющим интерес белком является фермент, например субтилизин. В некоторых вариантах осуществления клеткой Bacillus является клетка Bacillus subtilis.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу усиления экспрессии представляющего интерес белка из Bacillus, включающему получение модифицированной клетки Bacillus способом, включающим сверхэкспрессию ymaH в клетке-хозяине Bacillus; выращивание полученной модифицированной клетки Bacillus в условиях, благоприятствующих клеточному росту, и экспрессию представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus, где экспрессия представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus усиливается по сравнению с экспрессией того же самого представляющего интерес белка в клетке-хозяине Bacillus и где сверхэкспрессия включает трансформацию клетки-хозяина Bacillus полинуклеотидной конструкцией, которая находится на плазмиде или интегрирована в геном модифицированной клетки и содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, где полинуклеотид функционально связан с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA или sigH. В некоторых вариантах осуществления представляющим интерес белком является фермент, например субтилизин. В некоторых вариантах осуществления клеткой Bacillus является клетка Bacillus subtilis.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу усиления экспрессии представляющего интерес белка из Bacillus, включающему получение модифицированной клетки Bacillus способом, включающим сверхэкспрессию ymaH в клетке-хозяине Bacillus дикого типа; выращивание модифицированной клетки Bacillus в условиях, благоприятствующих клеточному росту, и экспрессию представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus, где экспрессия представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus усиливается по сравнению с экспрессией того же самого представляющего интерес белка в клетке-хозяине дикого типа и где сверхэкспрессия включает трансформацию клетки-хозяина Bacillus дикого типа полинуклеотидной конструкцией, которая содержит полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, где полинуклеотид функционально связан с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA или sigH. В некоторых вариантах осуществления, представляющим интерес белком является фермент, например субтилизин. В некоторых вариантах осуществления клеткой Bacillus является клетка Bacillus subtilis.

В другом варианте настоящее изобретение относится к способу усиления экспрессии представляющего интерес белка из Bacillus, включающему получение модифицированной клетки Bacillus способом, включающим сверхэкспрессию ymaH в измененной клетке-хозяине Bacillus; выращивание модифицированной клетки Bacillus в условиях, благоприятствующих клеточному росту, и экспрессию представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus, где экспрессия представляющего интерес белка в модифицированной клетке Bacillus усиливается по сравнению с экспрессией того же самого представляющего интерес белка в измененной клетке-хозяине и где сверхэкспрессия включает трансформацию измененной клетки-хозяина Bacillus полинуклеотидной конструкцией, содержащей полинуклеотид, кодирующий белок YmaH, где полинуклеотид функционально связан с полинуклеотидной последовательностью промотора sigA или sigH. В некоторых вариантах осуществления, представляющим интерес белком является фермент, например субтилизин. В некоторых вариантах осуществления клеткой Bacillus является клетка Bacillus subtilis.

Краткое описание графического материала

На фигуре 1 (A-E) показана локализация праймеров, используемых для получения полинуклеотидных конструкций согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения. На панелях B-E указано положение праймеров, используемых для получения конструкций SigH, SigA1, SigA2 и SigA3, соответственно, по отношению к хромосомной последовательности Bacillus оперона miaA Bacillus subtilis (1865428-1867019 пар нуклеотидов штамма 168 Bacillus subtilis; NCBI рег. № NC000964), который показан на панели A. Пары праймеров P4 - P5 и P6 - P7 являются гибридными праймерами, которые на своем 5'-конце содержат «хвост» из пар оснований, которые гомологичны непосредственно амплифицированной последовательности и комплементарны друг другу. Комплементарные хвосты этих гибридных праймеров позволяют присоединить амплифицированную ДНК промотора Sigma A к амплифицированной YmaH-кодирующей ДНК с получением химерных полинуклеотидов, содержащих промоторную последовательность Sigma A, смежную с YmaH-кодирующей последовательностью, при этом большая часть miaA-кодирующей последовательности делетирована или вообще отсутствует.

На фигуре 2 показана полинуклеотидная последовательность части генома B. subtilis, которая включает последовательность, определяющую промотор sigA, присоединенный к концу последовательности, кодирующей белок YmaH. Эта последовательность схематично представлена на фигуре 1 панели А. Показано начало последовательности, кодирующей белок miaA, а полноразмерная miaA-кодирующая последовательность представлена жирным шрифтом; кроме того, показано начало последовательности, кодирующей белок YmaH, а полноразмерная YmaH-кодирующая последовательность представлена жирным шрифтом и подчеркнута.

На фигуре 3 (A-B), панели A, представлен график протеолитической активности субтилизина, продуцированного контрольными клетками-хозяевами Bacillus (42pBS) и модифицированными клетками-хозяевами Bacillus, которые сверхэкспрессируют ymaH (42SigA1 и 42SigH). На панели B проиллюстрирована активность субтилизина, продуцированного контрольными клетками-хозяевами Bacillus (41pBS) и модифицированными клетками-хозяевами Bacillus, которые сверхэкспрессируют ymaH (41SigH). Протеолитическая активность была определена как увеличение оптической плотности на 405 нм, обусловленное гидролизом и высвобождением п-нитроанилина. Уровень ферментативной активности является показателем эффективности сверхэкспрессии ymaH в отношении продуцирования субтилизина клетками-хозяевами Bacillus.

На фигуре 4 указан уровень продуцирования субтилизина контрольными клетками-хозяевами Bacillus 42pBS19 и модифицированными клетками-хозяевами Bacillus 42SigH и 42SigA1, которые сверхэкспрессируют ymaH.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к клеткам, которые были генетически модифицированы в целях изменения их способности экспрессировать и/или продуцировать представляющие интерес белки. В частности, настоящее изобретение относится к модифицированным клеткам-хозяевам, которые представляют собой грамположительные микроорганизмы, такие как Bacillus sp., способные сверхэкспрессировать ymaH. Настоящее изобретение относится к полинуклеотидным конструкциям и экспрессионным векторам, содержащим полинуклеотидные последовательности, кодирующие YmaH, и к модифицированным клеткам-хозяевам, содержащим указанные полинуклеотидные конструкции и экспрессионные векторы. В частности, настоящее изобретение относится к композициям и к способам сверхэкспрессии YmaH для повышения уровня экспрессии и продуцирования представляющих интерес белков (например, протеаз) в Bacillus sp.

Если это не оговорено особо, то настоящее изобретение осуществляют стандартными методами, известными специалистам и обычно применяемыми в молекулярной биологии, микробиологии, в очистке белков, в конструировании белков, в секвенировании белков и ДНК и в технике рекомбинантных ДНК. Эти методы известны специалистам и описаны во многих общих руководствах и в научной литературе. Все выше- и нижеупомянутые патенты, патентные заявки, статьи и публикации во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Если это не оговорено особо, то все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют значения, в основном понятные среднему специалисту в области, к которой относится изобретение. Специалистам хорошо известны и доступны различные научные словари, в которых дается определение используемых в настоящем документе терминов. Хотя для осуществления настоящего изобретения, как в теории, так и на практике, могут быть применены любые методы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе методам и материалам, однако предпочтительными являются некоторые методы и материалы, описанные в настоящей заявке. В соответствии с этим термины, описанные непосредственно ниже, более подробно и во всей своей полноте определены путем ссылки на описание настоящего изобретения. При этом следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретно описанными в настоящем документе методами, протоколами и реагентами, которые могут варьироваться в зависимости от цели их применения.

В настоящем описании формы единственного числа включают формы множественного числа, если это явно не противоречит контексту изобретения. Если это не оговорено особо, то нуклеиновые кислоты записываются слева направо в направлении 5' → 3', а аминокислотные последовательности записываются слева направо в направлении от амино- до карбокси-конца, соответственно.

Все патенты, патентные заявки и другие публикации, включающие все цитируемые в настоящем документе последовательности, точно вводятся в настоящее описание посредством ссылки так, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка были конкретно и отдельно включены в данное описание посредством ссылки. Все документы, цитируемые в соответствующем разделе настоящей заявки, вводятся в настоящее описание посредством ссылки. Однако цитирование какого-либо документа не должно обязательно означать, что этот документ относится к прототипу настоящего изобретения.

В указанные числовые интервалы входят все входящие в него значения, включая его границы. При этом, предусматривается, что каждый максимальный числовой предел, указанный в настоящем описании, может включать каждый меньший числовой предел так, как если бы такой меньший числовой предел был точно определен в настоящей заявке. Каждый минимальный числовой предел, указанный в настоящем описании, может включать больший числовой предел так, как если бы такой больший числовой предел был точно определен в настоящей заявке. Каждый числовой интервал, указанный в описании настоящей заявки, включает каждый более узкий числовой интервал, который входит в такой более широкий числовой интервал так, как если бы все указанные более узкие числовые интервалы были точно определены в описании настоящей заявки.

Сущность изобретения не ограничивается различными приведенными в настоящем документе аспектами или вариантами осуществления изобретения, которые целиком могут быть включены в настоящее описание посредством ссылки. В соответствии с этим, как указывается выше, описанные ниже термины более подробно определены посредством ссылки на все описание в целом.

В настоящем документе термины «выделенный» и «очищенный» относятся к нуклеиновой кислоте или к аминокислоте (или к другому компоненту), которые были отделены по меньшей мере от одного компонента, с которым они связаны в своем природном окружении.

Термины «химерный полинуклеотид», «химерная полинуклеотидная конструкция» и «гетерологичная конструкция нуклеиновой кислоты» означают полинуклеотид, который состоит из частей различных генов, включая регуляторные элементы. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления химерная полинуклеотидная конструкция включает белок-кодирующую область, функционально связанную с промотором, который не является нативным промотором. В некоторых вариантах осуществления химерный полинуклеотид означает полинуклеотидную последовательность, которая включает полинуклеотидную последовательность, определяющую промотор и функционально связанную с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей белок. В некоторых вариантах осуществления, промотор и кодирующие полинуклеотиды являются смежными.

Термин «определяющий», если он употребляется при описании промотора, относится к полинуклеотидной последовательности, содержащей промоторные элементы, обеспечивающие транскрипцию.

В настоящем документе термин «промотор» означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая инициирует/осуществляет транскрипцию расположенного ниже гена. Обычно такой промотор является подходящим для той клетки-хозяина, в которой осуществляется экспрессия гена. Промотор, вместе с другими последовательностями нуклеиновой кислоты, регулирующими транскрипцию и трансляцию (также называемыми «регуляторными последовательностями»), является необходимым для экспрессии данного гена. В общих чертах, последовательностями регуляции транскрипции и трансляции являются, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, сайты связывания с рибосомой, последовательности инициации и терминации транскрипции, последовательности инициации и терминации трансляции, вышерасположенные последовательности элементов, расположенных выше промотора (UP-элементы), и последовательности энхансеров или активаторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, промотор также включает транскрипционную лидерную последовательность.

В настоящем документе термины «промотор Sigma A» и «промотор SigA» означают полинуклеотидную последовательность, содержащую коровые промоторные последовательности, которые включают последовательности, непосредственно распознаваемые соответствующим фактором σ^А. Промотор SigA входит в последовательность, которая обычно расположена выше miaA-кодирующей области.

В настоящем документе термины «промотор Sigma H» и «промотор SigH» означают полинуклеотидную последовательность, содержащую коровые промоторные последовательности, которые включают последовательности, непосредственно распознаваемые соответствующим фактором σ^H. Промотор SigH входит в последовательность, которая обычно расположена выше ymaH-кодирующей области (Britton et al. J. Bacteriol. 184:4881-4890 [2002]). Коровый промотор включает промоторные последовательности, содержащие последовательности, непосредственно распознаваемые соответствующим фактором σ, и спейсерную последовательность, расположенную между последовательностями, непосредственно распознаваемыми соответствующим фактором σ.

В настоящем документе термин «промотор aprE» означает полинуклеотидную промоторную последовательность, которая обычно инициирует экспрессию субтилизина в B. subtilis (Ferrari et al., J Bacteriol. 170:289-295 [1988]). Что касается промотора aprE, то в настоящем документе термин «промотор aprE» означает промотор aprE дикого типа и его мутанты. В некоторых вариантах осуществления изобретения промотор aprE включает нуклеотидные последовательности, необходимые для регуляции транскрипции, осуществляемой под действием DegU, ScoC, AbrB и любого другого регулятора такого промотора, и/или транскрипционную лидерную последовательность AprE (Hambraeus et al., Microbiology 148:1795-1803 [2002]).

В некоторых альтернативных вариантах осуществления изобретения промотор aprE не включает все нуклеотидные последовательности, необходимые для регуляции транскрипции, осуществляемой под действием DegU, ScoC, AbrB и других регуляторов, и/или не включает транскрипционную лидерную последовательность aprE.

Термины «регуляторный сегмент», «регуляторная последовательность» и «последовательность регуляции экспрессии» означают полинуклеотидную последовательность ДНК, функционально связанную с полинуклеотидной последовательностью ДНК, которая кодирует аминокислотную последовательность полипептидной цепи, в результате чего осуществляется экспрессия кодируемой аминокислотной последовательности. Регуляторная последовательность может ингибировать, подавлять или стимулировать экспрессию функционально связанной полинуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислоту. В некоторых осуществления изобретения регуляторная последовательность содержит промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей регулятор транскрипции YmaH. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный промотор является гетерологичным по отношению к гену ymaH (например, указанным промотором является промотор, который непосредственно не участвует в инициации экспрессии белка YmaH). Так, например, в некоторых вариантах осуществления, указанным промотором является промотор Sigma A, функционально связанный с ДНК, кодирующей белок YmaH. В некоторых других вариантах осуществления указанным промотором является промотор, который непосредственно инициирует экспрессию белка YmaH и который функционально связан с ДНК, кодирующей YmaH, поскольку такая ДНК является природной для данных хозяев.

В настоящем документе термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» являются взаимозаменяемыми и означают полимерную форму нуклеотидов любой длины. Эти термины включают, но не ограничиваются ими, одноцепочечную ДНК, двухцепочечную ДНК, геномную ДНК, кДНК, или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически модифицированные, биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются гены, генные фрагменты, хромосомные фрагменты, EST, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК, имеющая любую последовательность, выделенная РНК, имеющая любую последовательность, нуклеиновокислотные зонды и праймеры. Следует отметить, что из-за вырожденности генетического кода может продуцироваться множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих данный белок.

В настоящем документе термин «ген» означает хромосомный сегмент ДНК, участвующий в продуцировании полипептидной цепи, которая может включать, а может и не включать, области, расположенные до и после кодирующих областей (например, 5'-нетранслируемые (5'-UTR) или лидерные последовательности и 3'-нетранслируемые (3'-UTR) трейлерные последовательности, а также промежуточные последовательности (интроны), расположенные между отдельными кодирующими сегментами (экзонами)). В некоторых вариантах осуществления изобретения ген кодирует коммерчески доступные и важные с промышленной точки зрения белки или пептиды, такие как ферменты, включая, но не ограничиваясь ими, протеазы, целлюлазы, карбогидразы, такие как амилазы и глюкоамилазы, целлюлазы, оксидазы, изомеразы, трансферазы, киназы, фосфатазы и липазы. В некоторых других вариантах осуществления изобретения указанный ген кодирует белки, кодируемые опероном, в котором присутствует miaA (например, miaA или ymaH). Однако следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным ферментом или белком. В некоторых других вариантах осуществления, указанный ген кодирует другие белки или пептиды, такие как факторы роста, цитокины, лиганды, рецепторы и ингибиторы, а также вакцины и антитела. В некоторых вариантах осуществления представляющим интерес геном является природный ген, а в других вариантах осуществления таким геном является мутированный ген или синтетический ген.

В настоящем документе термин «синтетический» относится к полинуклеотидной молекуле, продуцируемой in vitro методами химического или ферментативного синтеза. Этот термин включает, но не ограничивается ими, варианты нуклеиновых кислот, полученные с использованием оптимальных кодонов, встречающихся в организмах-хозяевах, таких как, но не ограничивающихся ими, Bacillus sp.

В настоящем документе термин «полимеразная цепная реакция» («ПЦР») относится к методам, описанным в патентах США №№