Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор, кассета экспрессии, клетка продуцирующая флуоресцентный биосенсор, выделенный флуоресцентный биосенсор

Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор, кассета экспрессии, клетка продуцирующая флуоресцентный биосенсор, выделенный флуоресцентный биосенсор

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предлагаемое изобретение относится в основном к области биологии и химии и может быть использовано, в частности, при создании биосенсоров для детекции никотинамидадениндинуклеотида, сконструированных на основе флуоресцентных белков.

Флуоресцентные белки семейства GFP (Green Fluorescent Protein, GFP), включая собственно GFP из медузы Aequorea victoria (avGFP), его мутанты и гомологи, сегодня широко известны благодаря их интенсивному использованию в качестве флуоресцентных маркеров in vivo в биомедицинских исследованиях, что детально рассмотрено Lippincott-Schwartz и Patterson в (Science, 2003, 300(5616):87-91) и Chudakov et al. (J. Physiol Rev., 2010, Jul; 90(3):1103-63).

Флуоресцентные белки способны к флуоресценции при облучением светом подходящей длины волны. Флуоресцентные свойства этих белков обусловлены взаимодействием двух или более аминокислотных остатков, формирующих хромофор, а не флуоресценцией какого-либо одного аминокислотного остатка.

GFP гидромедузы Aequorea aequorea (синоним A. victoria) был описан Johnson et al. как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играет роль вторичного эммитера, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет (J. Cell Comp Physiol, 1962, 60:85-104). кДНК, кодирующая A. victoria GFP, была клонирована Prasher et al. (Gene, 1992, 111(2):229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP автокаталитически образовывать хромофор (Chalfie et al., Science 263, 1994, p.802). Эти сведения открыли широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологи в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.

GFP был использован в широком спектре приложений, включая исследование экспрессии генов и локализацию белков (Chalfie et al., Science 263, 1994, 802-805; Heim et al. in Proc. Nat. Acad. Sci., 1994, 91: 12501-12504) как инструмент для визуализации внутриклеточного распределения органелл (Rizzuto et al., Curr. Biology, 1995, 5: 635-642) для визуализации транспорта белков по секреторному пути (Kaether and Gerdes, FEBS Letters, 1995, 369: 267-271).

Проведены многочисленные исследования для улучшения свойств avGFP (Aequorea victoria GFP) и для получения вариантов GFP, пригодных и оптимизированных для различных исследовательских целей. Проведена оптимизация генетического кода avGFP (codon usage) для повышения уровня экспрессии в клетках млекопитающих ("гуманизированный" GFP, Haas, et al., Current Biology, 1996, 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research, 1996, 24: 4592-4593). Получены также различные мутанты GFP, в том числе "усиленный зеленый флуоресцентный белок" (EGFP), имеющий две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., Nature 373, 1995, р.663). Другие мутанты являются синим, голубым и желто-зеленым спектральными вариантами avGFP и содержат замены аминокислотных остатков, формирующих хромофор, и/или остатков, формирующих окружение хромофора.

В 1999 г. гомологи GFP были клонированы из небиолюминесцентных видов Anthozoa (Matz et al., Nature Biotechnol, 1999, 17: 969-973). Это открытие продемонстрировало, что эти белки не являются обязательно компонентом биолюминесцентной системы. GFP-подобные белки из Anthozoa обладают большим спектральным разнообразием и включают циановые, зеленые, желтые, красные флуоресцентные белки и фиолетово-синие нефлуоресцентные хромопротеины (CPs) (Matz et al., Bioessays, 2002, 24(10):953-959). В дальнейшем кДНК GFP-подобных белков были клонированы из ряда гидроидных медуз и из копепод (Shagin et al., Mol Biol Evol, 2004, 21(5):841-850). Сегодня семейство GFP-подобных белков включает сотни флуоресцентных и окрашенных гомологов GFP. Сходство этих белков с GFP варьирует от 80-90% до менее чем 25% идентичности аминокислотной последовательности.

Получены кристаллические структура avGFP дикого типа, GFP S65T мутанта и ряда гомологов GFP (Ormo et al. Science, 1996, 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Stmct Biol, 2000, 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Nati Acad Sci USA, 2001, 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb), 2003, 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem, 2003, 278: 44626-44631; Wilmann et al. J Biol Chem, 2005, 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry, 2005, 44, p.202; Quillin et al. Biochemistry, 2005, 44: 5774-5787). Было постулировано, что все члены семейства обладают общей 3D структурой (GFP-подобным доменом), представляющей собой так называемый "бочонок" из 11 бета-слоев, образующих компактную встречно-параллельную структуру, внутри которой располагается альфа-спираль, содержащая хромофор. Хромофор формируется внутри GFP-подобного домена путем окислительной циклизации трех консервативных аминокислотных остатков в центральном регионе альфа-спирали (Cody et al., Biochemistry, 1993, 32, p.1212). Положения аминокислотных остатков, формирующих хромофор, соответствует Ser65-Tyr66-Gly67 региону avGFP. Эти аминокислотные остатки легко могут быть идентифицированы у любого GFP-подобного белка путем выравнивания его последовательности с последовательностью avGFP.

Флуоресцентные белки представляют собой уникальное семейство структурно родственных белков, которые способны формировать хромофор автокаталитически без привлечения внешних субстратов или кофакторов. Под действием индуцирующего света хромофор производит флуоресценцию, легко детектируемую с помощью современного лабораторного оборудования (спектрофлуориметр, флуоресцентный микроскоп, флуоресцентно-активируемый клеточный сортер, планшетный флуориметр).

Процесс автокаталитического формирования хромофора белков с различными спектральными свойствами подробно описан в ряде статей и включает несколько химических реакций (Heim et. al. Proc Natl Acad Sci USA. 1994, 91:12501-12504; Ormo et al. Science 1996, 273:1392-1395; Yang et al. Nat Biotechnol. 1996, 14:1246-1251; Brejc et al. J. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94: 2306-2311; Palm et al. Nat Struct Biol. 1997, 4:361-365; Gurskaya et al., BMC Biochem. 2001, 2:6; Gross et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2000, 97:11990-11995; Wall et al. Nat Struct Biol. 2000, 7:1133-1138; Yarbrough et al., J. Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98:462-467; Pakhomov A.A. and Martynov V.I. Chem. Biol. 2008, 15, 755-764; Quillinet et al. Biochemistry. 2005, 44, p.5774; Yampolsky et al. Biochemistry, 2005, 44, p.5788; Shu et al. Biochemistry. 2006, 45, p.9639; Kikuchi et al. Biochemistry. 2008, 47, p.11573; Yampolsky et al., Biochemistry, 2009, 48 (33), p.8077).

GFP-подобные белки широко используют для создания генетически-кодируемых биосенсоров. Исследование внутриклеточных процессов с помощью таких генетически кодируемых биосенсоров становятся все более популярным, так как только такие сенсоры могут дать информацию об изменении исследуемого параметра непосредственно в живой системе. Такие биосенсоры востребованы как в фундаментальных исследованиях сигнальных путей организма, так и при тестировании токсических и лекарственных препаратов на модельных клеточных линиях или организмах. В сравнении с химическими и физическими методами регистрации биологически активных субстанций биосенсорами, требующими экзогенно добавляемых красителей, субстратов или кофакторов, генетически кодируемые нанобиосенсоры относятся к классу безреагентных и многоразовых сенсоров.

Биосенсоры на основе флуоресцентных белков представляют собой химерные белки, в состав которых входит сенсорный домен - белок, белковый домен или полипептид, чувствительный к изменению определенного параметра клетки, например изменению концентрации какого-либо иона или молекулы (ионов кальция, перекиси водорода, ионов водорода и т.д.). В качестве сигнальной части биосенсора используют GFP-подобные белки или их варианты, подвергнутые круговой пермутации (Suslova and Chudakov, Trends Biotechnol. 2005, 23(12), 605-13; Griesbeck, Curr Opin NeurobioL, 2004, v.14(5), p.636; Bunt and Wouters, Int Rev CytoL, 2004, v.237, p.205).

Создание пермутированных GFP-подобных белков необходимо для увеличения подвижности хромофорного окружения и, следовательно, для большей лабильности спектральных свойств белка. Круговая пермутация флуоресцентных белков описана Topell S. и Glockshuber R. (Methods in Molecular Biology. 2002, 183, p.31). Например, для круговой пермутации avGFP в его первичную структуру вносится разрыв в область между 144 и 149 аминокислотами, нативные N- и С-концы оперативно совмещаются при помощи полипептидного линкера. Новые N- и С-концы находятся в непосредственной близости от хромофора и могут влиять на его микроокружение. Круговая пермутация производится на уровне нуклеиновой кислоты путем оперативного сшивания 3'- и 5'- концов нуклеотидной последовательности, кодирующей флуоресцентный белок, и внесения разрыва в последовательность между кодонами, кодирующими новые N- и С-концевые аминокислоты. Методы для получения таких конструкций хорошо известны специалистам в данной области.

В результате круговой пермутации кпФБ приобретается способность реагировать на конформационные перестройки в области новых N и С-концов изменением спектра флуоресценции (сенсоры с использованием обычных флуоресцентных белков оказались малочувствительными).

Эффективность биосенсоров на основе кпФБ, полученных из avGFP, была продемонстрирована на примере сенсора на ионы кальция (Nagai et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98(6), p.197) и пероксид водорода (Belousov et al., Nature Method. 2006, 4, p.281).

Одной из важнейших молекул в клетке, для детекции которой востребованы генетически-кодируемые биосенсоры, никотинамидадениндинуклеотид (фиг.1). По химической структуре эта молекула представляет собой динуклеотид. Она построена из амида никотиновой кислоты и аденина, соединенных между собой цепочкой, состоящей из двух остатков D-рибозы и двух остатков фосфорной кислоты. Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) - кофермент, присутствующий во всех живых клетках, входит в состав ферментов группы дегидрогеназ, катализирующих окислительно-восстановительные реакции; выполняет функцию переносчика электронов и водорода, которые принимает от окисляемых веществ. Восстановленная форма (НАДН) способна переносить их на другие вещества.

Окисленные и восстановленные формы никотинамидадениндинуклеотида обладают отличиями в спектрах поглощения (Березов и Коровкин. Биологическая химия. Издательство "Медицина", Москва, 1990). НАД+ имеет узкую полосу поглощения с максимумом при 260 нм благодаря наличию аденина в его структуре. У восстановленной формы этого кофермента появляется вторая полоса поглощения с максимумом при 340 нм, это обусловлено исчезновением одной двойной связи в никотинамидном комплексе кофермента при его восстановлении.

Никотинамидадениндинуклеотид участвует в регуляции многих важнейших процессов клетки, таких как регуляция внутриклеточного Са²⁺, регуляция экспрессии генов. Известно его участие в процессах старения и клеточной гибели. Важным клеточным параметром является соотношение концентрации окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотида (НАД+/НАДН). НАД+/НАДН индекс отражает окислительно-восстановительный и общий метаболический статус клетки. В цитоплазме значение этого параметра строго регулируется и может изменяться от 700 до 1, в то время как в митохондриях диапазон изменений составляет от 8 до 1 (Weihai Y. Frontiers in Bioscience. 2006, 11, 3129-3148).

В настоящее время существует несколько подходов для определения НАД+ и НАДН в клетках и тканях. В частности, используют энзиматические системы на основе ферментов, которые используют в качестве кофактора НАДН и НАД+ (Liu et al., Reviews in Fluorescence, 2006, 107-124). В качестве примера можно отметить систему на основе лактатдегидрогеназы, осуществляющей превращение пирувата в лактат. Показано, что изменение в системе соотношения пируват/лактат пропорционально изменению соотношения НАД+/НАДН. Кроме того, так как НАДН в отличие от НАД+ обладает флуоресценцией с максимумом при 460 нм, используя алкогольдегидрогеназу и этанол в качестве субстрата, можно наблюдать за изменением интенсивности флуоресценции в данной системе. Главный недостаток этих методов заключается в том, что их применение возможно лишь на биологических экстрактах.

Методов регистрации изменений соотношения НАД+/НАДН в клетках в режиме реального времени до недавнего времени не было разработано. Недавно было предложено несколько вариантов биосенсоров на основе флуоресцентных белков для регистрации изменений соотношения НАД+/НАДН в клетках в режиме реального времени.

В качестве сенсорного домена в этих биосенсорах использован НАДН-связывающий бактериальный белок Rex (Brekasis and Paget, EMBO J. 2003 22, p.4856). Белок Rex является важным регулятором транскрипции компонентов дыхательной цепи в ответ на изменение внутриклеточного НАД+/НАДН индекса у грамположительных бактерий (Brekasis and Paget, EMBO J. 2003, 22, p.4856; Corda and Girolamo, Embo J. 2003, 22, 1953-8).

Белки Rex из представителей самых разных бактерий обладают значительной степенью сходства, около 30% их последовательности является строго консервативной. Для всех них постулирован одинаковый механизм функционирования (Krystle et al., Molecular Cell. 2010, 38, p.563).

Известна кристаллическая структура белка T-Rex (из Thermus thermophilus), а также некоторых других представителей семейства. T-Rex представляет собой димер, каждая субъединица состоит из двух доменов, связанных коротким линкером из пяти аминокислот. N-концевой домен (1-113 аминокислоты) связывает ДНК, главную роль в связывании ДНК играет альфа-3 петля, С-концевой домен (120-211 аминокислоты) отвечает за связывание нуклеотидов и представляет собой мотив Россмана (Wang et al., Molecular Microbiology. 2008, 69(2), p.466). Димерное состояние стабилизировано за счет альфа-спиралей С-концевого домена, в частности альфа-8 спирали, которая расположена в пространстве между двумя доменами, играет в этом важную роль. Молекулы НАДН связываются с каждым С-концевым доменом неподалеку от интерфейса, ответственного за формирование димера (Patschkowski et al., In Bacterial Stress Responses, G.Storz and R.Hengge-Aronis, eds., Washington, DC: ASM Press, 2000, p.61). Это приводит к конформационным изменениям, передающимся на подвижный линкер между доменами. В результате N-домены димера поворачиваются с образованием компактного закрытого состояния, неспособного более связывать ДНК (Wang et al., Molecular Microbiology 2008, 69(2), p.466).

Таким образом, гомодимерный Rex способен находиться в трех состояниях (Wang et al., Molecular Microbiology. 2008, 69(2), p.466). При низкой концентрации свободных нуклеотидов белок может пребывать в переходном состоянии - часть его молекул находится в свободном состоянии, а часть в слабом комплексе с ДНК. В условиях наличия кислорода, когда индекс НАД+/НАДН имеет высокое значение, Rex образует прочный комплекс с ДНК и молекулой НАД+, выступая в качестве репрессора транскрипции некоторых генов (cydABC, rexhemACD и других). Если НАД+/НАДН соотношение снижается в условиях недостатка кислорода, Rex связывает НАДН, что приводит к конформационным изменениям в структуре белка и последующему освобождению белка из комплекса с ДНК. Это активирует экспрессию генов, продукты которых позволяют клеткам выжить в условиях кислородного голодания.

Известны следующие варианты сенсоров для регистрации НАД+/НАДН на основе Rex белка и cpYFP-флуоресцентного белка, подвергнутого круговой пермутации:

- биосенсор FRex создан на основе белка B-Rex (Zhao et al., Cell Metab. 2011, 14(4):555-566). В состав биосенсора входит подвергнутый круговой пермутации флуоресцентный белок cpYFP, оперативно связанный с N-конца с одной полноразмерной субъединицей белка B-Rex, а с С-конца - с нуклеотид-связывающим доменом второй субъединицы B-Rex. Таким образом, сенсор состоит из трех белковых частей и представлен на фиг.2;

- биосенсор PEREDOX создан на основе белка T-Rex (Hung et al., Cell Metab. 2011, Oct 5; 14(4):545-554). В состав биосенсора входит подвергнутый круговой пермутации флуоресцентный белок cpYFP, оперативно встроенный между двух субъединиц белка T-Rex (фиг.2).

Также предложен вариант химерного белка PEREDOX-mCherry, в котором PEREDOX оперативно слит с красным флуоресцентным белком mCherry, флуоресценция которого служит для нормирования сигнала биосенсора.

Полученные сенсоры позволяют с высокой специфичностью регистрировать изменение соотношения НАД+/НАДН в клетках в режиме реального времени. Однако все указанные биосенсоры реагируют увеличением пика возбуждения флуоресценции на увеличение концентрации в среде восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида. Таким образом, эти биосенсоры оказываются применимы в случаях, когда в ходе биологического процесса происходит увеличение концентрации восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида, однако мало удобны для регистрации соотношения НАД+/НАДН в случаях, когда происходит окисление никотинамидадениндинуклеотида.

Кроме того, эти биосенсоры обладают значительным размером (более 560 аминокислот) и сложной мультидоменной структурой. Это может затруднять создание химерных белков на их основе для направления биосенсоров в определенные компартменты клетки.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка новых биосенсоров для регистрации НАД+/НАДН в клетках в режиме реального времени, особенно обладающих меньшей молекулярной массой и способных реагировать увеличением сигнала при увеличении концентрации окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида.

Поставленная задача решается предлагаемыми:

- выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей флуоресцентный биосенсор для измерения изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO:4, где указанный биосенсор реагирует увеличением сигнала при смещении соотношения НАД+/НАДН в сторону уменьшения концентрации НАДН;

- кассетой экспрессии, которая, будучи интегрированной в геном клетки или при введении в клетку в виде внехромосомного элемента, способна обеспечить экспрессию флуоресцентного биосенсора для измерения изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток и содержит нуклеиновую кислоту по п.1 под контролем регуляторных элементов, необходимых для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.

- клеткой, продуцирующей биосенсор, кодируемый нуклеиновой кислотой по п.1, содержащей кассету экспрессии по п.2 в виде внехромосомного элемента или элемента, интегрированного в геном этой клетки.

- выделенным флуоресцентным биосенсором для измерения изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток, кодируемым нуклеиновой кислотой по п.1, где указанный биосенсор реагирует увеличением сигнала при смещении соотношения НАД+/НАДН в строну уменьшения концентрации НАДН.

Предлагаемое изобретение обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих флуоресцентный биосенсор для регистрации изменения соотношения НАД+/НАДН, сигнал которого возрастает при смещении соотношения НАД+/НАДН в сторону увеличения в среде концентрации окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида НАД+ и соответственно уменьшается при увеличение в среде концентрации НАДН.

В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота предлагаемого изобретения кодирует флуоресцентный биосенсор для регистрации изменения соотношения НАД+/НАДН внутри клеток. В некоторых воплощениях указанный биосенсор реагирует увеличением сигнала при увеличении концентрации окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида (НАД+), то есть при сдвиге соотношения НАД+/НАДН в пользу НАД+.

В некоторых воплощениях биосенсор настоящего изобретения состоит из единственной молекулы белка T-Rex (SEQ ID NO:1), в который оперативно встроена молекула белка cpYFP (SEQ ID NO:2). В некоторых воплощениях биосенсор предлагаемого изобретения имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4 (T-Rex-116-117-cpYFP-7). В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота настоящего изобретения имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:12. Молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от представленных нуклеотидных последовательностей вследствие вырожденности генетического кода, также входят в рамки предлагаемого изобретения.

В других воплощениях также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту предлагаемого изобретения.

Кроме того, предлагаемое изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту предлагаемого изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. А также обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты предлагаемого изобретения. В других воплощениях обеспечиваются функциональные флуоресцентные биосенсоры предлагаемого изобретения, которые кодируются нуклеиновыми кислотами, указанными выше. Кроме того, обеспечиваются набор, содержащий нуклеиновые кислоты, и/или векторы, и/или экспрессионные кассеты, включающие указанные нуклеиновые кислоты предлагаемого изобретения.

Краткое описание фигур

На фигуре 1 представлена химическая структура восстановленной (НАДН) и окисленной (НАД+) форм никотинамидадениндинуклеотида и их взаимный переход.

На фигуре 2 проиллюстрирована структура известных биосенсоров FRex и PEREDOX и биосенсоров T-Rex-116-117-cpYFP и T-Rex-79-80-cpYFP предлагаемого изобретения.

На фигуре 3 представлена схема сопряженной ферментативной системы.

На фигуре 4 показаны спектры возбуждения и эмиссии T-Rex-79-80-cpYFP-34.

На фигуре 5 показан спектр возбуждения T-Rex-116-117-cpYFP-7.

Фигура 6 иллюстрирует динамику изменения спектра пробы, содержащей T-Rex-116-117-cpYFP-7 на добавление НАДН.

Осуществление изобретения

Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик предлагаемого изобретения ниже представлено детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие в равной степени эффективные воплощения.

Как указано выше, предлагаемое изобретение направлено на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют биосенсор для регистрации изменения соотношения НАД+/НАДН, сигнал которого возрастает при смещении соотношения НАД+/НАДН в сторону уменьшения концентрации НАДН и увеличения концентрации НАД+.

Нуклеиновые кислоты предлагаемого изобретения получены с помощью рекомбинантных технологий. В предпочтительных воплощениях нуклеиновые кислоты предлагаемого изобретения кодируют белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4. Также обеспечиваются векторы и кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту предлагаемого изобретения. Кроме того, обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты предлагаемого изобретения.

Указанные нуклеиновые кислоты применяются во многих различных приложениях и методах, в частности, для мониторинга изменений концентрации окисленной и восстановленной форм никотинамидадениндинуклеотида внутри клеток. Наконец, обеспечиваются наборы для их использования в таких методах и приложениях.

Определения

Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам предлагаемого изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения.

Как здесь используется, термин "флуоресцентный белок" означает белок, относящийся к семейству GFP-подобных белков, который обладает способностью к флуоресценции; например он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство флуоресцентного белка представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора, образующегося путем автокаталитической циклизации трех или более аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Как таковые флуоресцентные белки предлагаемого изобретения не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин. Термин «флуоресцентный белок» относится также к флуоресцентным белкам GFP-семейства, подвергнутым круговой пермутации.

Как здесь используется, термин "avGFP" относится к зеленому флуоресцентному белку из медузы Aequorea victoria, включая варианты avGFP, известные из уровня техники, сконструированные для обеспечения большей интенсивности флуоресценции или флуоресценции в других цветовых областях. Последовательность дикого типа avGFP была раскрыта Prasheretal. (Gene. 1992, 111: 229-33).

Как здесь используется, термин "флуоресцентный белок, подвергнутый круговой пермутации", или "кпФБ", относится к белку, полученному из флуоресцентного белка (например из avGFP) с помощью генно-инженерной модификации нуклеиновой кислоты, в результате которой С- и N-концы исходного флуоресцентного белка оказываются оперативно слиты, а новые С- и N-концы формируются вблизи хромофора. Круговая пермутация не влияет на формирование «бочонка» GFP-подобного домена и формирование активного (способного к флуоресценции) хромофора. Круговая пермутация приводит к тому, что кпФБ приобретает способность менять спектральные характеристики при конформационных изменениях белковых доменов или полипептидов, оперативно слитых с его С- и N-концами.

Как здесь используется, термин «cpYFP» относится к кпФБ на основе avGFP, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO:2.

Как здесь используется, термин "выделенный" или «изолированный» означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях. Как здесь используется, термин "мутант" или "производное" относятся к белку, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены, и/или замещены, и/или удалены (делегированы), и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков предлагаемого изобретения. Как здесь используется, термин "мутант" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "мутант" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.

Как здесь используется, "гомология" - это термин, использующийся для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.

Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности "по существу сходны" или "по существу такие же, как референсная последовательность", если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют по крайней мере 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 85% идентичности, по крайней мере, 90% идентичности, по крайней мере, 95% идентичности или по крайней мере, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, также по существу сходны.

Процент идентичности последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный Altschul et al., (J. Mol. Biol., 1990, 215, p.403). Для целей настоящего изобретения сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами, может быть использовано для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями.

Как здесь используется, термин "подобные белки" или "по существу сходные белки" относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности, идентичные по крайней мере на 85%, как правило идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%). Длина гомологичных аминокислотных последовательностей у «подобных белков» при этом может составлять, по крайней мере, 100 аминокислотных остатков, чаще, по крайней мере, 200 аминокислотных остатков или 300 аминокислотных остатков.

В некоторых воплощениях термин "подобные белки" или "по существу сходные белки" относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности целого белка, идентичные по крайней мере на 85%, как правило, идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%).

Как здесь используется, термин "функциональный" означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин "функциональный", используемый для описания биосенсора предлагаемого изобретения, означает, что он меняет спектральные характеристики при изменении соотношения НАД+/НАДН в среде.

Как здесь используется, термин «среда» по отношению к биосенсору означает любую среду, в которой этот биосенсор может функционировать. Для выделенного белка это может быть любой буферный раствор, в котором этот сенсор сохраняет функциональность. Для белка, экспрессированного в клетке, это цитоплазма или клеточный компартмент, в котором биосенсор локализован.

Как здесь используется, "биохимические свойства" относятся к белковому фолдингу (сворачиванию) и скорости созревания, скорости восстановления после реакции с тестируемой субстанцией, времени полужизни, способности к агрегации, способности к олигомеризации, рН и температурной стабильности и другим подобным свойствам.

Как здесь используется, "флуоресцентные свойства" или "спектральные свойства" относятся к коэффициенту молярной экстинкции при подходящей длине волны, к квантовому выходу флуоресценции, форме спектра возбуждения флуоресценции или спектра испускания, длине волны, соответствующей максимуму возбуждения флуоресценции, и длине волны, соответствующей максимуму испускания, отношению амплитуды возбуждения флуоресценции при двух разных длинах волн, отношению амплитуды испускания при двух разных длинах волн, времени жизни возбужденного состояния и анизотропии оптических свойств. Измеряемая разница может быть определена как количество любого количественного флуоресцентного свойства, например интенсивность флуоресценции при определенной длине волны, или интегральная флуоресценция на всем спектре испускания.

Как здесь используется, "агрегация" относится к склонности или способности экспрессированного белка формировать нерастворимый осадок (агрегаты). "Агрегация" должна быть отличаема от "олигомеризации". В частности, мутанты с уменьшенной способностью к агрегации, например с увеличенной растворимостью, не обязательно имеют уменьшенную способность к олигомеризации.

Как здесь используется, "олигомеризация" относится к склонности или способности экспрессированного белка формировать комплексы (олигомеры) в результате специфического взаимодействия двух или более полипептидов. Указанное специфическое взаимодействие наблюдается в специальных условиях, например в физиологических условиях, и относительно стабильно в этих условиях. Ссылка на "способность" белков олигомеризоваться означает, что белки могут формировать димеры, триммеры, тетрамеры или подобные комплексы в специальных условиях. Как правило, флуоресцентные белки обладают способностью к олигомеризации в физиологических условиях. Флуоресцентные белки могут также олигомеризоваться при других, например, рН, нежели рН при физиологических условиях. Условия, при которых флуоресцентные белки формируют олигомеры или проявляют склонность к олигомеризации, могут быть определены с помощью хорошо известных методов, таких как гель-фильтрация, или иным способом, известным в данной области.

Ссылка на нуклеотидную последовательность, "кодирующую" полипептид, означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин также включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.

Термин "оперативно связанный", «оперативно встроенный» или ему подобные при описании структуры биосенсора или химерных белков на его основе относится к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях основные функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов. Например, белок T-Rex, входящий в состав биосенсора предлагаемого изобретения, сохраняет способность связывать никотинамидадениндинуклеотид, а кпБФ - способность к флуоресценции. В случае когда биосенсор предлагаемого изобретения сшит с представляющим интерес сигналом внутриклеточной локализации, химерный белок сохраняет способность реагировать на изменение соотношения НАД+/НАДН, но локализуется в определенном клеточном компартменте. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, нуклеотидные последовательности, кодирующие химерный белок, включающий "оперативно связанные" компоненты (белки, полипептиды, линкерные последовательности, белковые домены и т.д.), состоят из фрагментов, кодирующих указанные компоненты, где эти фрагменты ковалентно связаны таким образом, что в ходе трансляции и транскрипции нуклеотидной последовательности продуцируется полноразмерный химерный белок. Иными словами, фрагменты соединены таким образом, что в местах их соединения отсутствуют "сбойки" рамки считывания и стоп-кодоны.

Как здесь используется, термин «НАД+/НАДН» означает соотношение концентраций окисленной (НАД+) и восстановленной (НАДН) форм никотинамидадениндинуклеотида в среде. Формула никотинамидадениндинуклеотида представлена на фиг.1. Как здесь используется, термин «сигнал биосенсора» означает детектируемое изменение спектральной характеристики биосенсора в ответ на изменение соотношения НАД+/НАДН.

Молекулы нуклеиновых кислот

Предлагаемое изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентный биосенсор для регистрации изменения соотношения НАД+/НАДН, сигнал которого возрастает при увеличении в среде концентрации окисленной формы никотинамидадениндинуклеотида. Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты - это молекула ДНК, такая как геномная ДНК или кДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК.

Как здесь используется, термин "кДНК" относится к нуклеиновым кислотам, которые обладают размещением элементов последовательности, найденным в нативных зрелых видах мРНК, где элементы последовательности - это экзоны и 5' и 3' некодирующие области.

Структура биосенсора схематически изображена на фиг.2. Биосенсор представляет собой химерный белок, состоящий из единственной двухдоменной субъединицы белка T-Rex из Thermus aquaticus (SEQ ID NO:1), в которую оперативно встроен подвергнутый круговой пермутации белок cpYFP (SEQ ID NO:2). В предпочтительных воплощениях cpYFP оперативно встроен между 70 и 120 аминокислотами белка T-Rex, например между 79 и 80 аминокислотами или между 116 и 117 аминокислотами. В предпочтительных воплощениях последовательность cpYFP оперативно соединена с последовательностями фрагментов T-Rex с помощью аминокислотных линкерных последовательностей 1 и 2, как показано на фиг.2. В предпочтительных воплощениях линкерная последовательность 1 состоит из трех аминокислот (например, оперативно связанных аминокислот S, А и G), а линкерная последовательность 2 состоит из двух аминокислот (например, оперативно связанных аминокислот G и Т).

Методы получения таких химерных белков хорошо известны профессионалам в данной области. Например, части нуклеиновой кислоты, кодирующие различные элементы (например, фрагменты аминокислотной последовательности T-Rex с 1 по 116 аминокислоты и с 117 по 211 аминокислоты, линкерные последовательности, белок cpYFP), могут быть встроены в определенном порядке в полилинкер вектора таким образом, что между различными частями не будет стоп-кодонов в рамке считывания и не будет сбоек рамки считывания. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть собрана из фрагментов с помощью ДНК-лигазы или ПЦР с праймерами, содержащими части, комплементарные концевым последовательностям соединяемых фрагмен