Способ генерирования активных антител к антигену устойчивости, антитела, полученные этим способом, и их применения

Способ генерирования активных антител к антигену устойчивости, антитела, полученные этим способом, и их применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новому подходу для создания исключительно моноклональных антител с терапевтической и/или диагностической целью. Более конкретно, задачей настоящего изобретения является создание антител, направленных против опухолевого антигена, отсутствующего на поверхности опухолевых клеток нативных опухолей и который может появиться после проведения противоопухолевого лечения этих нативных опухолей, антигена, который также возможно может быть вовлечен в устойчивость данных опухолей к этим противоопухолевым лечениям. Кроме того, данное изобретение включает такие антитела, а также применение этих антител в качестве лекарственного средства для профилактического и/или терапевтического лечения резистентных опухолей. И наконец, изобретение включает композиции, содержащие такие антитела, которые могут быть объединены с противораковыми агентами, и их применение для предупреждения и/или лечения некоторых типов рака.

Открытие антител и более конкретно разработка способов создания антител явились революцией в терапевтическом лечении или диагностике и, более конкретно, в относящейся к раку сфере. Действительно, впервые этот новый инструмент дал возможность осуществлять направленное лечение ввиду наличия распознавательной способности, присущей антителам. Одна из основных задач этих последних десятилетий состоит в разработке способов создания антител, независимо оттого, являются ли они в первой фазе поликлональными антителами, моноклональными антителами или даже фрагментами антител или аналогичными структурами.

На сегодняшний день специалистами в данной области техники разработаны несколько технологий, с помощью которых можно создавать антитела с терапевтической и/или диагностической целью.

Самые первые антитела представляют собой поликлональные антитела, т.е. гетерогенные популяции антител, содержащихся в сыворотках иммунизированных животных. Для их получения некоторых животных (мышей, крыс, кроликов, коз, …) иммунизируют путем инъекции заданного природного или синтетического антигена, в комбинации с одним или более адъювантами, такими как адъювант Фрейнда и гидроксид алюминия, направленными на стимуляцию и усиление иммунного ответа. Затем производят забор крови у животных и получают сыворотку или антисыворотку, содержащую как антитела, более или менее эффективно распознающие некоторые эпитопы данного антигена (поликлональные антитела), так и другие антитела животного. Очистку полученных антител выполняют, например аффинной хроматографией.

Первая разработка заключалась в создании моноклональных антител, которые могут быть получены из гибридом согласно методике, описанной KOHLER и MIELSTEIN (1975). Эта методика позволяет получить специфичные моноклональные антитела предетерминированного антигена и состоит в объединении клона лимфоцита В с миеломной (myelomatous) клеткой с получением клетки, называемой гибридомой. Эта гибридома характеризуется не только как иммортализованная, но также постоянно продуцирующая моноклональные и, следовательно, моноспецифичные антитела.

Также описаны другие методики, основанные на том же принципе, как например методика с использованием триомы или еще одна гибридомная методика, описанная KOZBOR и др. (1983).

Эти методики, первоначально примененные для создания мышиных антител, развивались, результатом чего стало создание гуманизированных или даже человеческих химерных антител. Все эти методики сегодня хорошо известны специалисту в данной области техники.

Человеческие антитела могут быть получены с использованием технологии генетически модифицированных мышей, так называемой "ксеномышиной" технологии, которая описана в патентах US 5814318 и US 5939598.

Кроме того, разработаны другие новые современные способы создания человеческих моноклональных антител и, более конкретно, фрагментов антител, как например методики, использующие банки или библиотеки фагов, как описано RIDDER и др. (1995), или так называемая технология "фагового дисплея", основанная на экстракции мРНК из директории (directory) человеческих клеток, происходящих из периферической крови, построении банка или библиотеки кДНК, содержащих последовательности вариабельных областей, и на вставке кДНК в фаги с целью продуцирования вариабельных областей антител в виде фрагментов, предпочтительно Fab-фрагментов.

Несмотря на то что эти способы различаются, все они имеют одну и ту же характерную особенность, т.е. иммунизацию известным антигеном или, в рамках объема библиотек или банков, скрининг этих банков с использованием того же известного и определенного антигена.

Настоящее изобретение отличается от этих способов тем, что известный и определенный антиген более не используется, а используется непосредственно вся опухоль или ее часть. Более конкретно, настоящее изобретение относится к непосредственному применению лизата, и/или суспензии, и/или измельченного клеточного гомогената опухоли. При лечении рака наблюдали в течение нескольких лет, что некоторое количество пациентов, которые характеризовались полным и удовлетворительным ответом после первого терапевтического лечения, имели тенденцию к развитию рецидива. В более конкретном случае известно, что опухоли способны модифицировать свой генотип и/или свой фенотип, чтобы быть устойчивыми к разным видам применяемого к ним лечения.

Это явление имеет место как для таких типов лечений, как лучевая терапия и химиотерапия, так и для лечений моноклональными антителами.

Исторически, первые химиотерапевтические соединения для лечения рака стали объектом клинических испытаний в 1940-х годах. Это были главным образом агенты с коротким временем полувыведения, такие как кортикостероиды, антифолаты или даже винкаалкалоиды. Однако, даже если была достигнута полная ремиссия, то она как правило продолжалась в течение не более чем одного года, и систематически наблюдали рецидив, ассоциированный с устойчивостью к химиотерапевтическому соединению, использованному для данного лечения (Lehnert М., Eur. J. Cancer, 1996, 32А: 912-920).

В ответ на это явление было предложено проводить так называемые "комбинированные" лечения с использованием различных противоопухолевых соединений. Путем одновременного или последовательного применения разных соединений действительно были получены более хорошие результаты В самом деле, в случае применения разных противоопухолевых соединений, каждое из которых обладает цитотоксической активностью, но разными механизмами действия, опухолевая клетка, устойчивая к соединению, может все еще быть чувствительной по меньшей мере к одному из других используемых соединений.

Однако, несмотря на использование разных противоопухолевых соединений или агентов, устойчивость опухолей остается главной проблемой в рамках химиотерапевтических лечений. Применение комбинаций влечет за собой задержку возникновения явления устойчивости, но не приводит к его исчезновению. Устойчивость к химиотерапевтическим средствам, как при начальном лечении, так и появляющаяся после рецидива вслед за благоприятным начальным ответом, имеется практически во всех случаях так называемых "излечимых" видов рака.

В качестве примера можно упомянуть заявки на патент WO 2005/077385, WO 2004/026293 или даже еще WO 2004/110497, где хорошо проиллюстрирован такой поиск новых способов контроля явления устойчивости, причем все эти заявки основаны на принципе дополнительного введения, как правило, новой химической молекулы.

Продемонстрированы другие механизмы приобретения устойчивости в опухоли, первоначально чувствительной к лечению. Согласно наиболее широко признанному предположению подразумевается, что это явление устойчивости могло бы происходить из-за накопления спонтанных и случайным образом возникающих соматических мутаций в генотипе опухолевой клетки (Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and practice, Chabner & Lango editors, 1996, chapter 1).

Другое известное и описанное явление устойчивости, называемое "MDR" (множественная лекарственная устойчивость (multidrug resistance); также полирезистентность; также резистентность ко многим лекарствам), основано на способности опухолевой клетки к выживанию при летальных концентрациях большого количества фармакологически, химически или даже структурно различающихся цитотоксических соединений. Клетки, проявляющие "MDR", обладают способностью к снижению накопления внутри клеток цитотоксических соединений в результате выведения указанных соединений транспортными белками. Эти белки, называемые "переносчики лекарственных средств, обеспечивающие множественную лекарственную устойчивость" (multi-drug transporters), являются мембранными белками, способными выводить широкий ряд токсичных молекул из клетки. Эти "переносчики лекарственных средств, обеспечивающие множественную лекарственную устойчивость" принадлежат "суперсемейству АТФ-связывающих кассетных (ABC; ATP-binding cassette)" транспортных белков, которые используют энергию гидролиза АТФ для своей активности. Показано, что за эту "MDR" ответственны несколько механизмов. Наиболее известным и наиболее документированным геном, наделенным такой устойчивостью, связанной с механизмом выведения (expulsion mechanism), зависящим от АТФ, является ген MDR1.

Одновременно с этим явлением устойчивости, индуцированным химиотерапевтическим лечением, также описана индуцированная устойчивость после лечения моноклональными антителами. Эта устойчивость может быть связана с типом хозяина, с фармакологическими соображениями или, кроме этого, она может быть присущей самой опухоли.

Раньше, при первоначальном использовании антител, относящихся к мышиным антителам, в результате получали антительный ответ против указанных мышиных антител, так называемый НАМА (человеческий антимышиный антительный (human anti-mouse antibody))-ответ. Эта форма устойчивости, имеющая отношение к хозяину, частично урегулирована тем, что мышиные антитела перестали применять, а стали использовать человеческие или гуманизированные антитела.

В разных тестах с использованием таких человеческих или гуманизированных антител продемонстрированы новые явления, в результате которых опухоль может быть устойчива к иммунологическим лечениям. В основе этих новых механизмов главным образом лежат мутации, индуцированные в опухоли, конститутивная активация рецепторов с последующим их расщеплением (или шеддингом) или даже потерей экспрессии целевого антигена.

Как будет очевидно далее из Примера 1, исследования, проводимые заявителем, показывают, например, что при тройной терапии с использованием антител против IGF-1R (рецептора инсулиноподобного фактора роста 1 типа), EGFR (рецептора эпидермального фактора роста) и Her/2neu возможно достижение значительного снижения опухолевого роста А549-клеток у бестимусных голых мышей до полного исчезновения опухолей у 90% леченных животных. Несмотря на то что такая множественная терапия существенно более эффективна, чем монотерапия или битерапия, по-видимому опухоли, которые все-таки полностью регрессировали, постепенно появляются вновь, несмотря на продолжение лечения, т.е. они становятся устойчивыми к множественному лечению.

На основании этого наблюдения заявитель впервые предлагает непосредственное применение таких резистентных опухолей для создания антител, предпочтительно терапевтических и/или диагностических моноклональных антител, способных к распознаванию антигенов, экспрессия которых будет индуцирована на поверхности опухолевых клеток этой опухоли, устойчивой к противоопухолевому лечению, и которые не будут экспрессироваться на поверхности опухолевых клеток нативной (нелеченной) опухоли, эти антигены также могут быть вовлечены в устойчивость опухоли к противоопухолевому лечению.

Следовательно, согласно первому аспекту предметом настоящего изобретения является применение измельченного гомогената, и/или суспензии, и/или клеточного лизата из опухоли, устойчивой по меньшей мере к одному противоопухолевому соединению, для иммунизации и создания in vitro антитела или одного из его функциональных фрагментов, направленного против опухолевого антигена, экспрессируемого на поверхности опухолевых клеток указанной резистентной опухоли, при этом данный опухолевый антиген предпочтительно не экспрессируется на поверхности опухолевых клеток нативной опухоли, из которой происходит резистентная опухоль, и этот опухолевый антиген возможно вовлечен в устойчивость указанной опухоли к противоопухолевому соединению.

Под выражением "измельченный гомогенат" или "клеточный гомогенат" понимают смесь клеток и/или клеточных фрагментов, происходящих из опухолей (ксенотрансплантантов, ортотопических трансплантатов, сингенных трансплантатов, хирургических образцов от леченых пациентов, у которых имел место рецидив опухоли, или образцов из клеточных культур), полученную посредством механической диссоциации, например, с использованием ультразвуковой мельницы типа "Potter", мельницы типа Ultraturax® и т.д.

Под выражением "суспензия" или "клеточная суспензия" понимают суспензию клеток, полученных после культивирования in vitro с обработкой или без нее и отсоединенных от поддерживающей их среды с применением ферментативных растворов или неферментативных растворов для диссоциации.

Под выражением "лизат" или "клеточный лизат" понимают смесь клеток и/или клеточных фрагментов, происходящих из опухолей (ксенотрансплантантов, ортотопических трансплантатов, сингенных трансплантатов, хирургических образцов от леченных пациентов, у которых имел место рецидив опухоли, или образцов клеточных культур), полученную посредством ферментативного расщепления (enzymatic dissociation).

Под выражением "резистентная опухоль" понимают опухоль, которая не отвечает или больше не отвечает на применяемое(ые) лечение(я). Как описано выше, такая устойчивость может наблюдаться или после лечения с применением химиотерапии, лучевой терапии, гормонотерапии, или даже в результате конкретного использования антител, эти виды лечения могут применяться по отдельности, либо также в виде комбинации. У истоков такой способности к устойчивости могут стоять различные механизмы, как известные, так и не известные в настоящее время. И наконец, такая устойчивость может выражаться в потере или снижении эффекта первоначально примененного лечения.

Несомненно, известные и описанные явления "ускользания", представляют собой часть явления устойчивости, которое стремятся контролировать с использованием данного изобретения

Под нативной опухолью (или исходной опухолью) в данном описании понимают обозначение опухоли, из которой происходит резистентная опухоль, при этом данная нативная опухоль не подвергалась никакому противоопухолевому лечению в противоположность резистентной опухоли.

Опухолевый антиген понимается в данном описании как относящийся, в частности, к антигенам, экспрессируемым на поверхности опухолевых клеток, независимо от того, происходят ли они из нативной опухоли или из резистентной опухоли, причем этот опухолевый антиген не экспрессируется на поверхности здоровых клеток. В общем случае эти опухолевые антигены представляют собой природные макромолекулы (которые можно синтезировать), с которыми антитело может специфично связываться. Опухолевым антигеном может быть, в частности, полипептид, полисахарид, углевод, нуклеиновая кислота, липид, гаптен или любое другое соединение, естественно присутствующее на поверхности опухолевой клетки.

И наконец, выражения "антитело" или "иммуноглобулин" используются в данном описании взаимозаменяемо в их самом широком смысле и включают моноклональные антитела (например, целые или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела, полиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность). Химерные или гуманизированные антитела также подпадают под это обозначение.

Более конкретно, такая молекула представляет собой гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелых цепи (Н) и две легких цепи (L), соединенные вместе дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области (или домена) тяжелой цепи (HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит LC-домен VH- и VL-области могут быть подразделены на гипервариабельные участки, называемые CDR (определяющие комплементарность участки; "complementary determining regions"), чередующиеся с более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, располагающихся от N-концевой аминокислоты до C-концевой аминокислоты в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая разные клетки иммунной системы (например эффекторные клетки) и первый компонент (C1q) системы стандартного комплемента.

Они могут также включать в себя определенные фрагменты антител (экспрессия будет описана более подробно), демонстрирующие желаемую аффинность и специфичность в отношении источника или типа иммуноглобулина (IgG, IgE, IgM, IgA и т.д.).

Как правило, для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, особенно мышиного происхождения, можно сделать ссылку на методики, описанные, в частности, в справочнике "Antibodies" (Hariow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp.726, 1988), или на методики получения из гибридом, описанные Kohler и Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975).

Среди антител, попытка создания которых решается настоящим изобретением, предпочтительны антитела, определенные выше, и так называемые "активные" антитела, т.е. обладающие противоопухолевой активностью, нацеленной на опухолевые клетки, устойчивые к терапии.

Среди антител, попытка создания которых решается настоящим изобретением, и в конкретном аспекте изобретения предпочтительны антитела, которые определены выше, и те, которые способны также к проявлению противоопухолевой активности, направленной против опухолевых клеток с агрессивным фенотипом, которые естественно (до лечения) экспрессируют антиген, против которого эти антитела направлены.

В первом воплощении применение по изобретению характеризуется тем, что указанную резистентную опухоль получают непосредственно путем биопсии и/или хирургии от пациента, который проходит или проходил терапевтическое лечение с использованием по меньшей мере указанного противоопухолевого соединения, способного индуцировать устойчивость, или устойчивость к которому данной опухоли установлена.

В этом воплощении адаптированное к каждому пациенту лечение можно рассматривать в том смысле, что в ответ на иммунизацию, осуществляемую с использованием всей резистентной опухоли или ее части, происходящей из реального пациента, вырабатываются антитела согласно изобретению. Таким образом, пациенту может быть предложена необходимая терапия ex vivo.

Во втором воплощении применение по изобретению характеризуется тем, что указанную резистентную опухоль индуцируют посредством трансплантации опухолевой линии и/или всей человеческой опухоли или ее части животному и затем посредством лечения этого животного путем введения, чаще всего посредством инъекции, по меньшей мере одного противоопухолевого соединения, устойчивость к которому желательно индуцировать или установить.

Более конкретно, по меньшей мере одно указанное противоопухолевое соединение выбрано из химиотерапевтических агентов, таких как химические молекулы, или даже из терапевтических антител, или даже из агентов лучевой терапии.

В общем случае во всем настоящем описании термины "противоопухолевый агент" или "противораковый терапевтический агент" предназначены для обозначения вещества, которое, когда его вводят пациенту, лечит рак или предотвращает развитие рака у пациента.

В качестве неограничивающего примера таких агентов могут быть упомянуты так называемые "цитотоксические" агенты, такие как "алкилирующие" агенты, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы митоза, ингибиторы функционирования хроматина, антиангиогенезные агенты, антиэстрогены, антиандрогены или иммуномодуляторы.

Подобные агенты упоминаются, например, в справочнике ВИДАЛЬ 2006 года издания на странице, посвященной соединениям, относящимся к онкологии и гематологии, в графе "Цитотоксические средства"; эти цитотоксические соединения, упомянутые посредством ссылки в этом документе, упомянуты в данном описании как предпочтительные цитотоксические агенты.

Термин "алкилирующие агенты" относится к любому веществу, которое может образовывать ковалентную связь или алкилировать любую молекулу, предпочтительно нуклеиновую кислоту (например ДНК), в клетке. В качестве примеров таких алкилирующих агентов могут быть упомянуты азотистые аналоги иприта, такие как мехлоретамин, хлорамбуцил, мелфалан, хлоргидрат, пипоброман, преднимустин, фосфат динатрия или эстрамустин; оксазафосфорины, такие как циклофосфамид, альтретамин, трофосфамид, сульфофосфамид или ифосфамид; азиридины или этиленимины, такие как тиотепа, триэтиленамин или альтретамин; нитрозомочевины, такие как кармустин, стрептозоцин, фотемустин или ломустин, алкилсульфонаты, такие как бусульфан, треосульфан или импросульфан; триазены, такие как дакарбазин; или даже комплексы платины, такие как цисплатин, оксалиплатин или карбоплатин.

Термин "антиметаболиты" относится к веществам, которые блокируют рост и/или метаболизм клетки путем воздействия на некоторые виды активности, в особенности на синтез ДНК. Примерами антиметаболитов являются метотрексат, 5-фторурацил, флоксуридин, 5-фтордезоксиуридин, капецитабин, цитарабин, флударабин, цитозинарабинозид, 6-меркаптопурин (6-МР), 6-тиогуанин (6-TG), хлордезоксиаденозин, 5-азацитидин, гемцитабин, кладрибин, дезоксикоформицин и пентостатин.

Термин "противоопухолевые антибиотики" относится к соединениям, которые могут препятствовать синтезу или ингибировать синтез ДНК, РНК и/или белка. Примеры таких противоопухолевых антибиотиков включают доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, валрубицин, митоксантрон, дактиномицин, митрамицин, пликамицин, митомицин С, блеомицин и прокарбазин.

"Ингибиторы митоза" препятствуют нормальному прохождению клеточного цикла и митоза. В общем случае, ингибиторы микротрубочек или "таксоиды", такие как паклитаксел и доцетаксел, способны ингибировать митоз. Также способны ингибировать митоз винкаалкалоиды, такие как винбластин, винкристин, виндезин и винорелбин.

Термин "ингибиторы функционирования хроматина" или "ингибиторы топоизомераз" относится к веществам, которые ингибируют нормальное функционирование моделирующих хроматин белков, таких как топоизомеразы I и II. Примеры таких ингибиторов включают, для топоизомеразы I, - камптотецин, а также его производные, такие как иринотекан или топотекан, и для топоизомеразы II, - этопозид, фосфат этипозида и тенипозид.

Термин "антиангиогенезные агенты" относится к любому лекарственному средству, соединению, веществу или агенту, которые ингибируют рост кровяных сосудов. Примеры антиангиогенезных агентов включают, без какого-либо ограничения, разоксин (razoxin), маримастат, батимастат, приномастат, таномастат, иломастат, CGS-27023A, галофугинон, COL-3, неовастат, BMS-275291, талидомид, CDC 501, DMXAA, L-651582, скваламин, эндостатин, SU5416, SU6668, альфа-интерферон, EMD121974, интерлейкин-12, IM862, ангиостатин и витаксин.

Термин "антиэстрогены" или "антиэстрогенные агенты" относится к любому веществу, которое ослабляет, антагонизирует или ингибирует действие эстрогенов. Примерами таких агентов являются тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен, иодоксифен (lodoxyfene), анастрозол, летрозол и эксеместан.

Термин "антиандрогены" или "антиандрогенные агенты" относится к любому веществу, которое ослабляет, антагонизирует или ингибирует действие андрогена. Примерами антиандрогенов являются флутамид, нилутамид, бикалутамид, спиронолактон, ципротерона ацетат, финастерид и цимитидин.

Иммуномодуляторами являются вещества, которые стимулируют иммунную систему. Примеры таких иммуномодуляторов включают интерферон, интерлейкины, такие как алдеслейкин, ОСТ-43, денилейкин дифлитокс или интерлейкин-2, факторы некроза опухолей, такие как тазонермин, или другие типы иммуномодуляторов, такие как лентинан, сизофиран, роквинимекс, пидотимод, пегадемаза, тимопентин, поли-I:C (полиинозиновая полицитидиловая кислота) или левамизол в комбинации с 5-фторурацилом.

Более подробную информацию специалист в данной области техники может найти в справочнике под редакцией Association Francaise des Enseignants de Chimie Therapeutique с названием "Traite de chimie therapeutique, Vol.6, Medicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des cancers, edition TEC & DOC, 2003".

В качестве противоопухолевых агентов также могут быть упомянуты агенты лучевой терапии, гормонотерапии или терапевтические агенты, направляемые небольшими молекулами, например ингибиторами тирозинкиназ. И наконец, согласно предпочтительному воплощению антитела представляют собой часть противоопухолевых агентов, которые могут быть использованы согласно изобретению. Более конкретно, в качестве неограничивающего примера можно упомянуть следующие антитела: антитела против EGFR, такие как цетуксимаб (С225 или эрбитакс), матузумаб, huR3, HuMax-EGFR или панитумаб; антитела против VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста), такие как бевацизумаб (авастин) или 2С3; антитела против IGF-1R, такие как 7С10, h7C10, hEM164, АВХ-IGF-1R, Мао (моноклональное антитело (также mAb)) 39, 1Н7 или 4G11; антитела против HER2, такие как трастузумаб (герцептин) или пертузумаб, антитела против CD20 (лейкоцитарный антиген 20), такие как коммеритуксимаб (commentuximab), ибритумомаб или тоситумомаб; антитела против CD33, такие как гемтузумаб или линтузумаб; антитела против CD22, такие как эпратузумаб, антитела против CD52, такие как алемтузумаб; антитела против ЕрСАМ (молекула адгезии эпительальных клеток), такие как эдреколомаб, Ch 17-1А или IGN-101; антитела против СТР21 или 16, такие как Xactin; антитела против ДНК-Ag, такие как ¹³¹I-Cotara TNT-1 (¹³¹I-котара - агент 1 терапии некроза опухолей); антитела против MUC1 (муцин-1), такие как пентумомаб или R1150; антитела против MUC18, такие как АВХ-МА1; антитела против GD3, такие как митумомаб; антитела против СЕА (карциноэмбриональный антиген), такие как CeaVac или лабетузумаб; антитела против СА125, такие как OvaRex; антитела против HLA (главный комплекс гистосовместимости)-DR, такие как аполизумаб; антитела против CTLA4 (цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4), такие как MDX-010; антитела против PSMA (мембранный антиген предстательной железы), такие как MDX-070, ¹¹¹In и ⁹⁰Y-J591, ¹⁷⁷Lu J591, J591-DM1; антитела, направленные против антигена Льюиса (anti-Lewis Y antibodies), такие как IGN311; антиангиогенезные антитела, такие как AS1405 и ⁹⁰YmuBd; антитела против Trail-R1 (TNF-related apoptosis-induced ligand receptor 1; рецептор 1 родственного фактору некроза опухоли апоптозиндуцирующего лиганда), такие как TRAIL R1mAb или TRAIL R2mAb; или даже любое антитело, направленное против тирозинкиназного рецептора, отличного от упомянутых выше, или RON (recepteur d'origine nantais) рецептора, сМЕТ-рецептора, CXCR 2 (рецепторов хемокинов типа С-Х-С), CXCR4, рецепторов эфринового типа и т.д., подобно терапиям направленного действия с использованием небольших химических молекул, таких как ингибиторы тирозинкиназ.

Несомненно, этот список никоим образом не является ограничивающим, и его целью является просто упоминание об антителах, используемых или разработанных на сегодняшний день.

Согласно конкретному воплощению изобретения подразумевается, что указанная резистентная опухоль является устойчивой к различным видам лечения или противоопухолевым агентам, при этом последние могут иметь разнообразную природу.

Более конкретно, применение по изобретению характеризуется тем, что указанное по меньшей мере одно противоопухолевое соединение состоит по меньшей мере из двух, предпочтительно по меньшей мере из трех соединений различной природы, и/или имеющих разные механизмы действия, и/или направленных на разные белки.

Под разным механизмом действия понимают, например, то, что противоопухолевые агенты будут воздействовать на разные биологические функции клетки, такие как ангиогенез, синтез ДНК или даже митоз.

Более конкретно, направленное действие на разные белки относится к случаю, когда противоопухолевые агенты являются антителами, способными связываться с белками или рецепторами разной природы.

Совершенно очевидно, что можно рассматривать либо комбинирование только антител друг с другом или только химиотерапевтических агентов друг с другом, либо комбинирование обоих этих семейств соединений друг с другом или с лучевой терапией, гормонотерапевтическими лечениями или терапиями направленного действия, использующими небольшие химические молекулы, как описано выше.

Также предпочтительно, хотя необязательно, чтобы у всех противоопухолевых соединений был бы разный механизм действия или они бы действовали на разные мишени.

Согласно второму аспекту задачей настоящего изобретения является способ создания in vitro антитела или одного из его функциональных фрагментов, направленного против опухолевого антигена, экспрессируемого на поверхности опухоли, устойчивой по меньшей мере к одному противоопухолевому соединению, причем указанный опухолевый антиген предпочтительно не экспрессируется на поверхности опухолевых клеток соответствующей нативной (нелеченной) опухоли, и указанный опухолевый антиген возможно вовлечен в устойчивость указанной опухоли, устойчивой к противоопухолевому лечению, способ, включающий стадию, состоящую из иммунизации животных непосредственно измельченным гомогенатом, и/или суспензией, и/или клеточным лизатом из указанной резистентной опухоли, и стадию, состоящую из отбора антител, распознающих резистентную опухоль, а не нативную опухоль, из которой происходит резистентная опухоль.

Согласно конкретному аспекту этого способа по изобретению описан способ создания in vitro антитела или одного из его функциональных фрагментов, направленного против опухолевого антигена, экспрессируемого на поверхности резистентной опухоли, возможно вовлеченного в устойчивость указанной резистентной опухоли, включающий иммунизацию животных непосредственно измельченным гомогенатом, и/или суспензией, и/или клеточным лизатом из указанной опухоли, устойчивой по меньшей мере к одному противоопухолевому соединению (противоопухолевому соединению, устойчивость к которому данной опухоли была установлена или устойчивость к которому желательно индуцировать), либо после толеризации животных измельченным гомогенатом, и/или суспензией, и/или клеточным лизатом из нативной опухоли (опухоли, не подвергавшейся какому-либо лечению), либо без толеризации. Целью этой толеризации, которую проводят с использованием иммуносупрессивного агента типа циклофосфамида, является подавление иммунного ответа, направленного против всех поверхностных антигенов, присутствующих до проведения противоопухолевого лечения(ий), применяемого к животному или человеку с целью индукции устойчивости или в рамках терапии, касающейся людей. Таким образом, иммунный ответ после введения, особенно посредством инъекции, препаратов из резистентных опухолей будет сфокусирован на структурах поверхностей, индуцированных лечением и потенциально вовлеченных в установление устойчивости опухоли. Эффективность толеризации оценивают на основании последующего исчезновения сывороточного титра, устанавливаемого после иммунизации животных опухолевыми клетками из нативной опухоли.

Затем производят отбор образцов селезенок мышей, иммунизированных согласно вышеупомянутому способу, и производят слияние спленоцитов с миеломными клетками в соответствии со стандартным способом, известным специалисту в данной области техники.

Скрининг гибридом, полученных после этого клеточного слияния, будет проведен посредством "дифференциальной иммуногистохимии" на предметных стеклах, приготовленных заранее и несущих срезы (нелеченных) "нативных опухолей" или срезы резистентных опухолей (леченных как одним, так и многими противоопухолевыми агентами). С целью продуцирования антител и тестирования их на предмет их противоопухолевой активности будут отобраны, клонированы и заморожены только гибридомы, продуцирующие антитела, распознающие резистентную опухоль, но не нативные опухоли. Целиком этот способ будет схематически изображен впоследствии на Фиг.2 и 3. Следует отметить, что такой подход также может быть предложен для поиска и выявления внутриклеточных молекул, вовлеченных в устойчивость.

Определенные выше антитела по настоящему изобретению предпочтительно представляют собой специфичные, в особенности мышиные, химерные или гуманизированные моноклональные антитела, которые могут быть получены согласно стандартным способам, хорошо известным специалисту в данной области техники.

В общем случае для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, особенно мышиного происхождения, можно сослаться на методики, описанные, в частности, в справочнике "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp.726, 1988) или на методику получения из гибридом, описанную Kohler и Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975).

В качестве антител по настоящему изобретению также включены химерные или гуманизированные антитела.

Химерное антитело предназначено для обозначения антитела, которое содержит природную вариабельную область (легкой цепи и тяжелой цепи), происходящую из антитела заданного вида, в ассоциации с константными областями легкой цепи и тяжелой цепи антитела, гетерологичного указанному заданному виду (мыши, лошади, кролики, собаки, коровы, курицы и т.д.).

Антитела или их фрагменты химерного типа по изобретению могут быть получены путем использования методик генетической рекомбинации. Например, химерное антитело может быть получено посредством клонирования рекомбинантной ДНК, включающей в себя промотор и последовательность, кодирующую вариабельную область не человеческого, особенно мышиного, моноклонального антитела по изобретению, и последовательность, кодирующую константную область человеческого антитела. Химерное антитело по изобретению, кодируемое таким рекомбинантным геном, будет представлять собой, например человеко-мышиную конструкцию, причем специфичность этого антитела будет определяться вариабельной областью, происходящей из мышиной ДНК, а его изотипы - константной областью, происходящей из человеческой ДНК. В отношении способов получения химерных антител можно сослаться, например на документ Verhoeyn и др. (BioEssays, 8: 74, 1988), Morrison и др. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 82: 6851-6855, 1984) или патент США 4816567.

Гуманизированное антитело предназначено для обозначения антитела, которое содержит CDR-участки, происходящие из антитела не человеческого происхождения, причем другие части молекулы данного антитела происходят из одного (или более чем одного) человеческого антитела. К тому же, некоторые из остатков сегментов остова (skeleton) (называемых FR) могут быть заменены с целью сохранения аффинности связывания (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988, Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988).

Гуманизированные антитела по изобретению или их фрагменты могут быть получены с использованием методик, известных специалисту в данной области техники (таких как, например, описанные в документах Singer et al., J. Immun. 150: 2844-2857, 1992, Mountain et al., Biotechnol Genet. Eng Rev., 10. 1-142, 1992; или Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992).

Специалисту в данной области техники также известны и другие методики получения гуманизированных антител, такие как, например, методика "CDR-привития" ("CDR Grafting"), описанная PDL (Public Documentation License), являющаяся предметом изобретения патентов ЕР 0451261, ЕР 0682040, ЕР 0939127, ЕР 0566647 или еще US 5530101, US 6180370, US 5585089 и US 5693761. Также можно упомянуть патенты US 5639641 или еще US 6054297, US 5886152 и US