Двойное нацеливание нп mir-208 и mir 499 в лечении заболеваний сердца

Двойное нацеливание нп mir-208 и mir 499 в лечении заболеваний сердца

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет для предварительной заявки США № 61/149915, поданной 4 февраля 2009, которая приводится в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме.

ДОГОВОР О ПОДДЕРЖКЕ ПРАВИТЕЛЬСТВА

Настоящее изобретение создавалось при поддержке правительства в виде гранта номер HL53351-06, присужденного Национальными Институтами Здоровья. Правительство обладает определенными правами в изобретении.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

Содержание текстового файла, представленного при этом в электронном виде, приводится в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме: Копия в читаемом компьютером формате списка последовательностей (название файла: MIRG_013_01WO_SeqList_ST25.txt, запись данных: 1 февраля 2010, размер файла 5 килобайт).

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Изобретение относится к лечению расстройств сердца и скелетных мышц путем введения агентов, которые модулируют активность или экспрессию микроРНК (miРНК). В частности, изобретение относится к способу лечения или профилактики заболеваний сердца путем ингибирования экспрессии или активности как miR-208a/miR-208b, так и miR-499 в клетках сердца индивидуума, включая человека. Кроме того, изобретение относится к способу лечения или профилактики мышечно-скелетных нарушений путем увеличения экспрессии или активности как miR-208b, так и miR-499 в клетках скелетных мышц индивидуума.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Заболевание сердца и его проявления, к которым относятся заболевание коронарной артерии, инфаркт миокарда, застойная сердечная недостаточность и гипертрофия сердца, на сегодняшний день в Соединенных Штатах несомненно представляют наибольший риск для здоровья. Затраты на диагностику, лечение и поддержку пациентов, страдающих этими заболеваниями, обходятся в биллионы долларов. Два особенно тяжелых проявления заболевания сердца представляют собой инфаркт миокарда и гипертрофия сердца.

Инфаркт миокарда, широко известный как сердечный приступ, вызывается внезапной и длительной недостаточностью кровотока в ткани сердца, которая обычно является результатом сужения или окклюзии коронарной артерии. В отсутствие адекватного кровоснабжения ткань становится ишемичной, что приводит к гибели кардиомиоцитов (например, клеток сердечной мышцы) и сосудистых структур. Некротизированная вследствие гибели кардиомиоцитов ткань, как правило, замещается рубцовой тканью, которая не является сократимой, теряет способность выполнять функцию сердца и часто играет пагубную роль в работе сердца, вследствие расширения в процессе сердечного сокращения или вследствие увеличения размера и эффективного радиуса желудочка, например, становящегося гипертрофичным.

Гипертрофия сердца представляет собой приспособительную реакцию сердца практически на все формы заболевания сердца, к которым относятся формы, вызываемые гипертензией, механической нагрузкой, инфарктом миокарда, аритмиями сердца, эндокринными нарушениями и генетическими мутациями в генах сократительных белков сердца. Несмотря на то что гипертрофическая реакция исходно представляет собой компенсаторный механизм, который увеличивает сердечный выброс, длительная гипертрофия может приводить к дилатационной кардиомиопатии (DCM), сердечной недостаточности и внезапной смерти. В Соединенных Штатах ежегодно сердечная недостаточность диагностируется приблизительно у полумиллиона индивидуумов со смертностью, приближающейся к 50%.

Большое число сигнальных путей, особенно включающих искаженную передачу сигнала с участием кальция, приводит к гипертрофии сердца и патологическому ремоделированию (Heineke & Molkentin, 2006). Гипертрофическое разрастание в ответ на нагрузку вовлекает различные сигнальные пути и паттерны экспрессии генов, отличные от включаемых при физиологической гипертрофии, которая наблюдается в ответ на физическую нагрузку. Опосредованная нагрузкой гипертрофия миокарда представляет собой сложное явление, ассоциированное с большим числом пагубных последствий, с различными молекулярными и гистологическими характеристиками, приводящее к фиброзу, дилятации и декомпенсации сердца, что через стадию дегенерации и гибели кардиомиоцитов часто завершается сердечной недостаточностью. По существу, имелось сильное желание расшифровать лежащие в основе этого молекулярные механизмы и открыть новые терапевтические мишени для подавления пагубного разрастания сердца и в конечном счете недостаточности. Понимание этих механизмов важно для создания новых способов лечения гипертрофии сердца и сердечной недостаточности.

В последнее время микроРНК были вовлечены в большое число биологических процессов, к которым относятся среди прочего регуляция сроков развития, апоптоза, жирового метаболизма и дифференциации гематопоэтических клеток. МикроРНК (miРНК) представляют собой небольшие некодирующие белок РНК от около 18 до около 25 нуклеотидов в длину, которые происходят из отдельных генов miRNA, из интронов генов, кодирующих белок, или из полицистронных транскриптов, которые часто кодируют большое число близкородственных miRNA. См. обзор Carrington et al. (Science, Vol. 301(5631):336-338, 2003). MiRNA действуют в качестве репрессоров мРНК-мишеней путем усиления их деградации при полной комплементарности их последовательностей или путем ингибирования трансляции, если их последовательности содержат несоответствия.

MiRNA транскрибируются с помощью РНК-полимеразы II (pol II) или РНК-полимеразы III (pol III; см. статью Qi et al. (2006) Cellular & Molecular Immunology, Vol. 3:411-419) и происходят из исходных транскриптов, обозначаемых первичными транскриптами miRNA (pri-miRNA), размер которых обычно составляет несколько тысяч нуклеотидов. Pri-miRNA процессируются в ядре с помощью РНКазы Drosha до предшественников, имеющих форму шпильки, размером от около 70 до около 100 нуклеотидов (pre-miRNA). После переноса в цитоплазму pre-miRNA в виде шпильки дополнительно процессируется с помощью дайсера до получения двуцепочечной miRNA. Зрелая цепь miRNA затем встраивается в индуцированный РНК комплекс сайленсинга (RISC), где она ассоциируется со своими мРНК-мишенями за счет комплементарности пар оснований. В относительно редких случаях, при которых miRNA полностью спаривается с мРНК-мишенью, она активирует деградацию мРНК. Чаще miRNA образуют несовершенные гетеродуплексы с мРНК-мишенями, либо влияющие на стабильность мРНК, либо ингибирующие трансляцию мРНК.

Недавно авторы изобретения сообщили о специфичной для сердца микроРНК, miR-208a, которая кодируется интроном гена тяжелой цепи α-миозина (МНС) и необходима для активации экспрессии β-МНС в ответ на нагрузку на сердце и для подавления в сердце генов быстрых скелетных мышц (van Rooij et al., (2007) Science, Vol. 316: 575-579). Настоящее изобретение основано на этом открытии и предлагает новый терапевтический подход в лечении расстройств сердца и нарушений скелетных мышц.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано, в частности, на обнаружении того, что систематическое подавление как miR-208a, так и miR-499 в клетках сердца синергетически влияет на развитие гипертрофии сердца, повышенной сократимости и патологического ремоделирования сердца в ответ на нагрузку. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что период времени для регуляции экспрессии генов стресса, таких как β-МНС, критически падает при подавлении как miR-208a, так и miR-499 путем либо одновременного, либо последовательного введения ингибиторов miR-208a и miR-499. Такое двойное нацеливание оказывает незамедлительное воздействие на экспрессию генов стресса по сравнению с задержкой в несколько месяцев, необходимой для наблюдения подобных эффектов при подавлении только miR-208a. Соответственно, настоящее изобретение относится к новому терапевтическому подходу в лечении патологической гипертрофии сердца, сердечной недостаточности и инфаркта миокарда у нуждающегося в этом индивидуума, включая человека.

В одном из вариантов осуществления способ содержит введение индивидууму ингибитора miR-208a или miR-208b и ингибитора miR-499, причем после введения экспрессия или активность miR-208a или miR-208b и miR-499 в клетках сердца индивидуума снижается. В некоторых вариантах осуществления после введения ингибиторов экспрессия или активность miR-208a или miR-208b и miR-499 в клетках сердца индивидуума снижается больше чем на 60 процентов. К ингибиторам miR-208 и miR-499 относятся антагомиры или антисмысловые олигонуклеотиды. В одном из вариантов осуществления ингибиторы miRNA кодируются на векторе экспрессии.

В другом варианте осуществления после введения ингибитора miR-208a или miR-208b и ингибитора miR-499 у индивидуума снижается ответ на нагрузку на сердце. К ответу на нагрузку на сердце относится гипертрофия кардиомиоцитов, фиброз сердца, пониженная экспрессия α-МНС и/или повышенная экспрессия β-МНС в клетках сердца указанного индивидуума. В некоторых вариантах осуществления снижение ответа на нагрузку на сердце наблюдается менее чем через два месяца после введения ингибиторов miR-208a/miR-208b и miR-499. В предпочтительном варианте осуществления снижение ответа на нагрузку на сердце наблюдается менее чем через одну неделю после введения ингибиторов.

В некоторых вариантах осуществления ингибитор miR-208a/miR-208b и ингибитор miR-499 вводятся последовательно. Введение двух ингибиторов может быть разделено интервалом, который может составлять порядка от минут до недель. В одном из вариантов осуществления ингибитор miR-208a/miR-208b и ингибитор miR-499 вводятся с интервалом по меньшей мере 24 часа. В другом варианте осуществления ингибитор miR-208a/miR-208b и ингибитор miR-499 вводятся совместно. Каждый из двух ингибиторов может быть введен в дозе от около 1 мг/кг до около 200 мг/кг.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения или профилактики нарушения скелетных мышц у индивидуума, нуждающегося в этом, содержащему введение индивидууму агониста miR-208 и агониста miR-499, где после введения в клетках скелетных мышц индивидуума экспрессия или активность miR-208 и miR-499 повышается. В одном из вариантов осуществления способ содержит введение индивидууму агониста miR-208b и агониста miR-499. Агонисты miРНК могут представлять собой полинуклеотиды, кодирующие зрелые последовательности miR-208a, miR-208b или miR-499. В некоторых вариантах осуществления такие полинуклеотиды функционально связаны с последовательностью промотора и доставляются в клетки индивидуума в векторе экспрессии.

Агонисты miRNA могут вводиться вместе или последовательно, разделенные определенным временным интервалом. В некоторых вариантах осуществления после введения индивидууму агонистов miR-499 и miR-208a или miR-208b в клетках скелетных мышц индивидуума снижается экспрессия одного или нескольких генов быстрых скелетных мышц. К одному или нескольким генам быстрых скелетных мышц могут относиться тропонин I2, тропонин Т3, легкая цепь миозина быстрых скелетных мышц и альфа-актин скелетных мышц.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. У животных с нокаутом miR-208 наблюдаются менее выраженная гипертрофия сердца и фиброз в ответ на сужение грудной аорты. А. Схематическая иллюстрация процедуры сужения грудной аорты (ТАВ) (слева). Гистологические срезы сердца мышей дикого типа и miR-208-/-, окрашенные после процедуры ТАВ или процедуры имитации трихромом по Массону (справа). Отсутствие miR-208 уменьшает гипертрофию и фиброз, наблюдаемые у мышей дикого типа, подвергнутых ТАВ в течение 21 дня. В. Относительные уровни экспрессии тяжелой цепи бета-миозина (β-МНС), предсердного натрийуретического фактора (ANF) и натрийуретического пептида мозга (BNP) в сердце животных дикого типа и miR-208-/- после процедуры имитации или ТАВ. С. Вестерн-анализ уровней белков α-МНС и β-МНС в сердце животных дикого типа и miR-208-/- после процедуры имитации или ТАВ. В качестве контроля нагрузки определяли GAPDH.

Фигура 2. Долговременный нокдаун miR-208 фенокопирует ингибирование ответа на нагрузку у животных с нокаутом miR-208. А. Последовательность синтетического олигонуклеотида, нацеленного на зрелую последовательность miR-208 (SEQ ID NO:16). Последовательность контроля несоответствий содержит четыре несоответствия оснований по сравнению с последовательностью anti-miR-208 (SEQ ID NO:17). В. Анализ ПЦР в режиме реального времени указывает на эффективный нокдаун miR-208 в сердце животных, обработанных олигонуклеотидом анти-miR-208. С. Относительные уровни экспрессии тяжелой цепи бета-миозина (β-МНС), предсердного натрийуретического фактора (ANF) и натрийуретического пептида мозга (BNP) в сердце животных, которые получили олигонуклеотид anti-miR-208 (анти 208) или контроль несоответствий (mm) после процедуры имитации или сужения грудной аорты (ТАВ). В то время как в ответ на ТАВ индуцируются маркеры стресса ANF и BNP, у животных, которые получали anti-miR-208, наблюдается сниженная индукция экспрессии βМНС.

Фигура 3. Myh7b и miR-499 регулируются посредством miR-208. Нозерн-блот, показывающий экспрессию miR-499 в сердце мышей дикого типа (+/+), гетерозиготных по miR-208 (+/-) и мышей с нокаутом miR-208 (-/-). Существует прямая корреляция между экспрессией miR-208 и miR-499, а также Myh7b у мышей дикого типа и мутантов. В качестве контроля измеряли экспрессию GAPDH.

Фигура 4. Myh7b и miR-499 экспрессируются в сердечной и медленных скелетных мышцах. А. Нозерн-анализ указывает, что miR-499 экспрессируется в сердце и медленных скелетных мышцах (например, камбаловидной мышце). ОТ-ПЦР на Myh7b указывает, что miR-499 экспрессируется совместно со своим геном-хозяином. В. Анализ ПЦР в режиме реального времени на miR-499 на сердечной и четырех типах скелетных мышц (икроножной/подошвенной (GP), передней большеберцовой (ТА), длинном разгибателе пальцев (EDL) и камбаловидной) подтверждает, что miR-499 экспрессируется преимущественно в сердце и камбаловидной мышце. В ТА и EDL могут быть детектированы лишь незначительные уровни экспрессии miR-499. С. Гибридизация in situ указывает на то, что в процессе эмбриогенеза Myh7b экспрессируется специфически в сердце и сомитах.

Фигура 5. MiR-499 не влияет на экспрессию миозина. А. Анализ ОТ-ПЦР Myh7b показывает, что генетическая делеция miR-499 не влияет на экспрессию ее гена-хозяина Myh7b. GP-икроножная/подошвенная мышца; TA-передняя большеберцовая мышца; EDL-длинный разгибатель пальцев. В качестве контроля измеряли экспрессию GAPDH. В. Анализ вестерн-блот сердец животных дикого типа (WT), гетерозиготных (+/-) и с нокаутом (КО) miR-499 как на α-, так и β-МНС показывает, что делеция miR-499 не влияет на экспрессию того и другого гена на уровне белка. С. Пропилтиоурацил (PTU), который блокирует биогенез тиреоидных гормонов и является сильным индуктором β-МНС, продуцирует снижение α-МНС и повышение β-МНС как у животных дикого типа (WT), так и с нокаутом (КО) miR-499.

Фигура 6. Регуляция miR-499 с помощью in vivo нокдауна miR-208. A. Нозерн-анализ экспрессии miR-208 и miR-499 через три дня после инъекции в хвостовую вену указанного количества олигонуклеотида anti-miR-208 или физиологического раствора (Sal). B. Нозерн-анализ экспрессии miR-208 и miR-499 в ткани сердца животных, которым ввели либо одну дозу 80 мг/кг anti-miR-208, 2 дозы по 80 мг/кг anti-miR-208 за два последовательных дня, либо ошибочный контрольный олигонуклеотид (mm), через два месяца после обработки. С. Анализ ПЦР в режиме реального времени экспрессии miR-208, miR-499, miR-208b, α-MHC, Myh7b и β-МНС в ткани сердца через два месяца после обработки однократной дозой anti-miR-208, двумя дозами anti-miR-208 за два последовательных дня или двумя дозами олигонуклеотида с несоответствиями за два последовательных дня. D. Анализ вестерн-блот экспрессии β-МНС в ткани сердца через два месяца после обработки anti-miR-208 (однократной дозой 80 мг/кг или двумя последовательными дозами 80 мг/кг) или обработки контролем с несоответствиями (mm).

Фигура 7. Двойное нацеливание на miR-208 и miR-499. А. Нозерн-анализ miR-208, miR-208b и miR-499 в ткани сердца животных дикого типа и с нокаутом miR-499 указывает на сильную индукцию miR-208b в ответ на PTU. MiR-208b экспрессируется совместно с β-МНС и указывает на ее экспрессию. У животных с нокаутом miR-499 индукция miR-208b сопоставима с индукцией у животных дикого типа. Тем не менее, нокдаун miR-208 у животных с нокаутом miR-499 супрессирует индукцию экспрессии miR-208b с помощью PTU. B. Анализ ПЦР в режиме реального времени miR-208, α-MHC и β-МНС в ткани сердца животных дикого типа, животных с нокаутом miR-208, животных с нокаутом miR-499 и животных с нокаутом miR-499, обработанных с помощью anti-miR-208 при наличии и в отсутствие PTU.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сердечная и скелетные мышцы отвечают на большое число патофизиологических стимулов, таких как нагрузка, передача сигнала тироидных гормонов и повреждение, путем модуляции экспрессии изоформ миозина, которые регулируют эффективность сокращения.

Соотношение изоформ α- и β-МНС в сердце взрослого индивидуума представляет собой определяющий фактор сократимости сердца. У β-МНС, основной изоформы миозина в сердце взрослого индивидуума, наблюдается относительно низкая активность АТФазы, тогда как α-MHC обладает высокой активностью АТФазы. В ответ на большое число патологических стимулов, таких как инфаркт миокарда, гипертензия и другие расстройства, экспрессия β-МНС возрастает, тогда как экспрессия α-MHC падает с последующим снижением активности АТФазы миофибрилл и сниженной скоростью сокращения мышечных волокон сердца, что приводит в конечном счете к нарушению сократительной функции. Удивительно, что небольшие изменения в содержании α-MHC в сердце могут значительно влиять на функцию сердца.

Недавно авторы изобретения сообщили о специфичной для сердца miRNA miR-208a, которая кодируется интроном гена тяжелой цепи α-миозина и необходима для активации экспрессии β-МНС в ответ на нагрузку на сердце и для репрессии генов быстрых скелетных мышц в сердце (см. одновременно находящуюся на рассмотрении заявку WO 2008/016924, которая приводится в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме).

Авторы изобретения недавно также обнаружили, что miR-208a также необходима для экспрессии в сердце близкородственной miRNA miR-499, которая кодируется интроном гена Myh7b (см. одновременно находящуюся на рассмотрении заявку РСТ/US08/71837, которая приводится в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме). Экспрессия Myh7b и miR-499 в сердце, а также в медленных скелетных мышцах контролируется фактором транскрипции MEF2, сигнал-зависимым регулятором экспрессии генов поперечно-полосатых мышц. Усиленной экспрессии miR-499 или miR-208 достаточно, чтобы опосредовать превращение миофибрилл из быстрых в медленные in vivo. MiR-208 и miR-499 могут отрицательно регулировать экспрессию Thrap1, корегулятора рецептора тиреоидных гормонов, и членов семейства PUR факторов транскрипции, которые в свою очередь отрицательно регулируют экспрессию β-МНС в сердечной и скелетных мышцах. Sox6 действует в качестве репрессора типоспецифических генов медленных волокон. Нокдаун экспрессии Sox6 в мышечных трубочках дикого типа приводит к существенному повышению экспрессии β-МНС. Анализ промотора β-МНС выявил консенсусную последовательность Sox, что указывает на то, что Sox6 имеет решающее значение в дифференциации типа волокон фетальной скелетной мускулатуры и регуляции β-МНС в сердце. Эти находки раскрывают типичный механизм регуляции, в котором гены Myh регулируют паттерны экспрессии генов поперечно-полосатых мышц, кодируя регуляторные miRNA, которые определяют сократимость и способность отвечать на сигнал (van Rooij et al. (2009) Developmental Cell, Vol. 17: 662-673).

Настоящее изобретение основано, в частности, на обнаружении того, что подавление и miR-208, и miR-499 в клетках сердца создает синергетический эффект в супрессии ответа на нагрузку на сердце. Ингибирование экспрессии miR-208a в клетках сердца приводит к снижению индуцированной нагрузкой экспрессии β-МНС. Тем не менее, этот эффект не проявляется до двух месяцев после введения ингибитора miR-208. Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что ингибирование и miR-208a, и miR-499 приводит к супрессии экспрессии β-МНС, индуцированной нагрузкой, почти сразу же после введения, таким образом, ускоряя эффект при ответе на нагрузку на сердце. Соответственно, в свете этих находок описываются стратегии воздействия на экспрессию генов скелетных и сердечной мышц путем модуляции экспрессии miR-208a и miR-499 либо одновременно, либо последовательно для лечения и профилактики заболеваний сердца.

MiR-208a локализована в интроне гена α-МНС. Точное расположение интрона зависит от конкретного вида и конкретного транскрипта. Например, у людей miR-208a кодируется в 28-м интроне гена α-МНС, тогда как у мышей она кодируется в 29-м интроне. Кодирующие pre-miRNA последовательности miR-208a человека, мыши, крысы и собаки представлены ниже в виде SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 соответственно. Последовательность зрелой miR-208a представлена в SEQ ID NO:5. Подобно α-МНС, miR-208a экспрессируется исключительно в сердце.

Pre-miR-208a человека (SEQ ID NO:1)

ACGGGCGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GATGCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A

Pre-miR-208a мыши (SEQ ID NO:2)

ACGGGTGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GACTCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A

Pre-miR-208a крысы (SEQ ID NO:3)

ACGGGTGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GACTCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A

Pre-miR-208a собаки (SEQ ID NO:4)

ACGCATGAGC TTTTGGCTCG GGTTATACCT GATGCTCACG TATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A

Зрелая miR-208a (SEQ ID NO:5)

AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU

Анализ геномной локализации гена miR-499 показал, что он должен содержаться в 20-м интроне гена Myh7b, гомолога гена α-МНС. Кодирующие pre-miRNA последовательности miR-499 мыши, крысы, человека, собаки, опоссума, курицы и X. tropicalis представлены в SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12 соответственно. SEQ ID NO:13 представляет собой структуру стебель-петля последовательности предшественника мыши, и SEQ ID NO:14 представляет собой последовательность зрелой miR-499. Ген Myh7b консервативен у позвоночных и экспрессируется лишь в сердце и медленных скелетных мышцах (например, камбаловидной мышце).

Pre-miR-499 мыши (SEQ ID NO:6)

TCCCTGTGTC TTGGGTGGGC AGCTGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAGCT CCTCTGCATG TGAACATCAC AGCAAG

Pre-miR-499 крысы (SEQ ID NO:7)

TCCCTGTCTT GGGTGGGCAG CTGTTAAGAC TTGCAGTGAT GTTTAGCTCC TCTCCATGTG AACATCACAG CAAG

Pre-miR-499 человека (SEQ ID NO:8)

CCCCTGTGCC TTGGGCGGGC GGCTGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAACT CCTCTCCACG TGAACATCAC AGCAAG

Pre-miR-499 собаки (SEQ ID NO:9)

CCCTTGCACC CTGGGCGGGC GGCCGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAACT CCTCTCCACG TGAACATCAC AGCAAG

Pre-miR-499 опоссума (SEQ ID NO:10)

CCCCTGCCTC CCCGGCGGGC AGCTGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAATT CTTCTCTATG TGAACATCAC AACAAG

Pre-miR-499 курицы (SEQ ID NO:11)

GGAGCGGCAG TTAAGACTTG TAGTGATGTT TAGATAATGT ATTACATGGA CATCACTTTA AG

Pre-miR-499 X. tropicalis (SEQ ID NO:12)

GTCTTAGCGA GGCAGTTAAG ACTTGCAGTG ATGTTTAGTT AAAATCTTTT CATGAACATC ACTTTAAG

Структура стебель-петля мыши последовательности pre-miR-499 (SEQ ID NO:13)

GGGUGGGCAG CUGUUAAGAC UUGCAGUGAU GUUUAGCUCC UCUGCAUGUG AACAUCACAG CAAGUCUGUG CUGCUGCCU

Зрелая miR-499 (SEQ ID NO:14)

UUAAGACUUG CAGUGAUGUU U

Авторы изобретения также обнаружили, что геном содержит вторую версию miR208a, обозначаемую miR-208b, которая локализована в гене β-МНС в интроне 31 и, подобно β-МНС, miRNA-208b экспрессируется лишь в сердце и медленных скелетных мышцах (например, камбаловидной мышце). К генам, регулируемым посредством miR-208b, относятся, например, Sp3, миостатин, PURбета, THRAP1 и гены белков быстрых скелетных мышц. Последовательность этой miRNA в значительной степени перекрывается с miR-208а с гомологией 100% в «затравочном регионе», регионе, который определяет мРНК-мишени определенной miRNA. Таким образом, miR-208b может существенно влиять на сократимость сердечной и скелетных мышц у людей. Последовательность pre-miR-208b консервативна между некоторыми видами млекопитающих (например, человеком, мышью, крысой и собакой). Ниже представлена последовательность pre-miR-208b, а также последовательность зрелой miR-208b:

pre-miR-208b (SEQ ID NO:18)

TTTCTGATCC GAATATAAGA CGAACAAAAG GTTTGTCTGA GGG

Зрелая miR-208b (SEQ ID NO:19)

AUAAGACGAA CAAAAGGUUU GU

Понятно, что при использовании последовательностей РНК, описанных в настоящем документе, в вариантах осуществления, где требуются дезоксирибонуклеотиды, тимидиновый остаток замещается на уридиновый остаток. Аналогично в вариантах осуществления, где необходимы рибонуклеотиды, в последовательностях ДНК, описанных в настоящем документе, уридиновый остаток замещается на тимидиновый остаток.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения патологической гипертрофии сердца, инфаркта миокарда или сердечной недостаточности у индивидуума, нуждающегося в этом, включая человека, путем нацеливания экспрессии и/или активности одной из двух или обеих miR-208 (например, miR-208а и/или miR-208b или, другими словами, miR-208а/miR-208b) и miR-499 в клетках сердца индивидуума. В некоторых вариантах осуществления для снижения экспрессии или активности miR-208а/miR-208b и miR-499 в клетках сердца индивидуума индивидууму вводят ингибитор miR-208а/miR-208b и ингибитор miR-499.

В другом варианте осуществления индивидуум, нуждающийся в этом, может иметь риск развития патологической гипертрофии сердца, сердечной недостаточности или инфаркта миокарда. У такого индивидуума могут наблюдаться один или несколько факторов риска, к которым относятся, но ими не ограничиваясь, длительная устойчивая неконтролируемая гипертензия, некорректируемое заболевание клапанов, хроническая стенокардия, недавно перенесенный инфаркт миокарда, наследственная предрасположенность к заболеванию сердца или патологической гипертрофии. У индивидуума, находящегося в группе риска, может быть установлена генетическая предрасположенность к гипертрофии сердца, или он может иметь семейный анамнез гипертрофии сердца.

Предпочтительно, чтобы введение индивидууму как ингибитора miR-208а/miR-208b, так и ингибитора miR-499 приводило к смягчению у индивидуума одного или нескольких симптомов гипертрофии сердца, сердечной недостаточности или инфаркта миокарда или к задержке превращения гипертрофии сердца в сердечную недостаточность. Одним или несколькими улучшенными симптомами могут быть, например, увеличенная способность к физической нагрузке, увеличенный объем сердечного выброса, пониженное конечное диастолическое давление левого желудочка, пониженное заклинивающее давление легочных капилляров, увеличенный сердечный выброс, увеличенный сердечный индекс, пониженное давление в легочных артериях, пониженные конечные систолический и диастолический объемы левого желудочка, уменьшенный фиброз сердца, уменьшенное отложение коллагена в сердечной мышце, сниженная нагрузка на стенку левого и правого желудочка, сниженное напряжение стенки, улучшенное качество жизни и сниженные показатели заболеваемости или смертности вследствие заболевания.

В одном из вариантов осуществления изобретения у индивидуума после введения ингибиторов miR-208 (например, miR-208а и/или miR-208b) и miR-499 снижается ответ на нагрузку на сердце. К ответу на нагрузку на сердце относятся в числе прочего гипертрофия кардиомиоцитов, фиброз сердца, пониженная экспрессия α-МНС в клетках сердца и/или повышенная экспрессия β-МНС в клетках сердца. Введение индивидууму как ингибитора miR-208а/miR-208b, так и ингибитора miR-499 приводит к ускоренному эффекту при ответе на нагрузку на сердце по сравнению с введением какого-либо одного ингибитора. Например, уменьшение ответа на нагрузку на сердце происходит меньше чем через восемь недель, меньше чем через шесть недель, меньше чем через четыре недели, меньше чем через три недели, меньше чем через две недели, меньше чем через одну неделю, меньше чем через пять дней, меньше чем через три дня или меньше чем через один день после введения ингибиторов. В другом варианте осуществления уменьшение ответа на нагрузку на сердце происходит меньше чем через двенадцать часов после введения ингибиторов.

В некоторых вариантах осуществления ингибиторы miR-208 (например, miR-208а и/или miR-208b) и miR-499 могут представлять собой антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на последовательности зрелой miR-499 и/или miR-208а или miR-208b. Антисмысловые олигонуклеотиды могут представлять собой рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Предпочтительно, чтобы антисмысловые олигонуклеотиды имели по меньшей мере одну химическую модификацию. Например, подходящие антисмысловые олигонуклеотиды могут содержать одну или несколько «конформационно вынужденных» или бициклических модификаций сахара нуклеозида, например «замкнутые нуклеиновые кислоты». «Замкнутые нуклеиновые кислоты» (LNA) представляют собой модифицированные рибонуклеотиды, которые содержат внешний мостик между 2' и 4' углеродами фрагмента сахара рибозы, получая «замкнутую» конформацию, которая придает олигонуклеотидам, содержащим LNA, повышенную температурную стабильность. Антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на miR-208а/miR-208b и miR-499, могут содержать комбинации LNA или иначе модифицированных нуклеотидов и рибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов. Альтернативно антисмысловые олигонуклеотиды могут содержать пептидные нуклеиновые кислоты (PNA), которые вместо сахаро-фосфатного остова содержат пептидный остов. К другим химическим модификациям, которые могут содержать антисмысловые олигонуклеотиды, относятся, но ими не ограничиваясь, модификации сахара, такие как модификации 2'-О-алкил (например, 2'-О-метил, 2'-О-метоксиэтил), 2'-фтор и 4'-тио, и модификации остова, такие как одна или несколько фосфоротиоатных, морфолино или фосфонокарбоксилатных связей (см., например, патенты США 6693187 и 7067641, которые приводятся в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме). Например, антисмысловые олигонуклеотиды, в частности более короткие, (например, меньше чем 15 нуклеотидов) могут содержать одну или несколько модификаций, усиливающих сродство, таких как, но ими не ограничиваясь, LNA, бициклические нуклеозиды, фосфоноформаты, 2'-О-алкил и подобное. В некоторых вариантах осуществления подходящие антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой 2'-О-метоксиэтильные «олигомеры с пропусками», которые содержат 2'-О-метоксиэтил-модифицированные рибонуклеотиды как на 5', так и на 3'-концах по меньшей мере с десятью дезоксирибонуклеотидами в центре. Эти «олигомеры с пропусками» способны запускать РНКаза Н-зависимые механизмы деградации РНК-мишеней. В данной области известны и подходят для применения в способах по изобретению и другие модификации антисмысловых олигонуклеотидов для усиления стабильности и повышения эффективности, такие как описанные в патенте США 6838283, который приводится в настоящем документе в качестве ссылки в полном объеме. Предпочтительные антисмысловые олигонуклеотиды, используемые для ингибирования активности miRNA, имеют от около 5 до около 50 нуклеотидов в длину, от около 10 до около 30 нуклеотидов в длину или от около 20 до около 25 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах осуществления антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на miR-208а/miR-208b и miR-499, составляют от около 8 до около 18 нуклеотидов в длину и в других вариантах от около 12 до около 16 нуклеотидов в длину. В частности, может быть использован любой 8-мер или более длинный олигонуклеотид, который комплементарен miR208a или miR-208b, т.е. любая последовательность anti-mir, которая комплементарна любой непрерывной последовательности в miR208a или miR-208b, начиная с 5'-конца miR до 3'-конца зрелой последовательности. Антисмысловые олигонуклеотиды в некоторых случаях могут содержать последовательность, которая по меньшей мере частично комплементарна последовательности зрелой miRNA, например, по меньшей мере на около 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% комплементарна последовательности зрелой miRNA. В некоторых вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид может быть по существу комплементарен последовательности зрелой miRNA, то есть по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98% или 99% комплементарен последовательности полинуклеотида-мишени. В одном из вариантов осуществления антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность, которая на 100% комплементарна последовательности зрелой miRNA.

В других вариантах осуществления антисмысловые олигонуклеотиды являются антагомирами. «Антагомиры» представляют собой одноцепочечные химически модифицированные рибонуклеотиды, которые по меньшей мере частично комплементарны последовательности miRNA. Антагомиры могут содержать один или несколько модифицированных нуклеотидов, таких как нуклеотиды с модификациями сахара 2'-О-метил. В некоторых вариантах осуществления антагомиры содержат лишь модифицированные нуклеотиды. Антагомиры также могут содержать одну или несколько фосфоротиоатных связей, что приводит к получению частично или полностью фосфоротиоатного остова. Для содействия in vivo доставке и стабильности антагомир может быть связан на своем 3'-конце со стероидом, таким как холестерин, жирная кислота, витамин, углевод, пептид или другой низкомолекулярный лиганд. Антагомиры, подходящие для ингибирования miRNA, могут иметь от около 15 до около 50 нуклеотидов в длину, более предпочтительно, от около 18 до около 30 нуклеотидов в длину и, наиболее предпочтительно, от около 20 до около 25 нуклеотидов в длину. Под «частично комплементарной» понимают последовательность, которая по меньшей мере на около 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% комплементарна последовательности полинуклеотида-мишени. Антагомиры могут быть по меньшей мере на около 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% комплементарны последовательности зрелой miRNA. В некоторых вариантах осуществления антагомир может быть по существу комплементарен последовательности зрелой miRNA, то есть по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98% или 99% комплементарен последовательности полинуклеотида-мишени. В других вариантах осуществления антагомиры на 100% комплементарны последовательности зрелой miRNA.

В некоторых вариантах осуществления ингибиторы miR-499 и miR-208а/miR-208b представляют собой антагомиры, содержащие последовательность, которая полностью комплементарна последовательности зрелой miR-499 и зрелой miR-208а или miR-208b. В одном из вариантов осуществления ингибитор miR-499 представляет собой антагомир, имеющий последовательность, которая частично или полностью комплементарна 5'-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' (SEQ ID NO:14). В другом варианте осуществления ингибитор miR-208а представляет собой антагомир, имеющий последовательность, которая частично или полностью комплементарна 5'-AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU-3' (SEQ ID NO:5). В другом варианте осуществления ингибитор miR-208а представляет собой антагомир, имеющий последовательность 5'-ACAAGCUUUUUGCUCGUCUUAU-3' (SEQ ID NO:15). В еще одном варианте осуществления ингибитор miR-208а представляет собой антагомир, имеющий последовательность SEQ ID NO:16. В другом варианте осуществления ингибитор miR-208b представляет собой антагомир, имеющий последовательность, которая частично или полностью комплементарна 5'-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU-3' (SEQ ID NO:19).

В некоторых вариантах осуществления ингибиторы miR-499 и miR-208а или miR-208b представляют собой химически модифицированные антисмысловые олигонуклеотиды. В одном из вариантов осуществления ингибитор miR-499 представляет собой химически модифицированный антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность, по существу комплементарную 5'-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3' (SEQ ID NO:14). В другом варианте осуществления ингибитор miR-208а представляет собой химически модифицированный антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность, по существу комплементарную 5'-AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU-3' (SEQ ID NO:5). В еще одном варианте осуществления ингибитор miR-208b представляет собой химически модифицированный антисмысловой олигонуклеотид, содержащий последовательность, по существу комплементарную 5'-AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU-3' (SEQ ID NO:19). Под используемым в настоящем документе выражением «по существу комплементарная» понимают последовательность, которая по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарна последовательности полинуклеотида-мишени (например, последовательности зрелой miRNA или miRNA-предшественника).

Антисмысловые олигонуклеотиды могут содержать последовательность, которая по существу комплементарна последовательности miRNA-предшественника (pre-miRNA) для miR-499 или miR-208а/miR-208b. В некоторых вариантах осуществления антисмысловой олигонуклеотид содержит последовательность, которая по существу комплементарна последовательности, локализованной вне региона стебель-петля последовательности pre-miR-499 или pre-miR-208а/miR-208b. В одном из вариантов осуществления ингибитор функции miR-499 представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, имеющий последовательность, которая по существу комплементарна последовательности pre-miR-499, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 и SEQ ID NO:12. В другом варианте осуществления ингибитор функции miR-208а представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, имеющий последовательность, которая по существу комплементарна последовательности pre-miR-208а, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4. В еще одном варианте осуществления ингибитор функции miR-208b представляет собой антисмысловой