Высокочистый пентамицин

Высокочистый пентамицин

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение касается высокочистого пентамицина, некоторых полиморфов и сольватов пентамицина, способов их производства и способа уменьшения скорости деградации пентамицина с чистотой более 95%.

Уровень техники изобретения

Пентамицин, также как амфотерицин B и нистатин A1, принадлежит к классу полиеновых макролидных антибиотиков, обладающих противогрибковой активностью. Пентамицин можно получить из природных источников, например его можно выделить из некоторых штаммов Streptomyces, например, из мицелия актиномицетов Streptomyces penticus, как описано в статье S. Umezawa and Y. Tanaka, J. Antibiotics, Ser.A, vol.XI, no.1, pages 26-29 (1958), или из Streptomyces roseo luteus (NRRL 2776, NCIB 8984), как описано в британском патенте 884711 от Glaxo. Упомянутый патент касается производства антибиотика лагозина, который, как было показано в упомянутой ниже статье Pandey и др. в J. Antibiotics vol.XXXV no.8, pages 988-996 (1982), идентичен фунгихромину и когомицину. В указанном британском патенте, стр.2, правая колонка, строки 48-49, лагозин описан как чувствительный к свету и в твердом виде, и в растворе.

Абсолютная конфигурация пентамицина (= фунгихромин) была определена спектральным сравнением продуктов деградации и частичным синтезом, что описано в статье T. Oishi, Pure & Appl. Chem., vol.61, no.3, pp.427-430 (1989). Согласно рентгеноструктурному анализу, опубликованному в статье Y. Igarashi и др. в J. Antibiot. vol.58, no. 8, pp.523-525 (2005), пентамицин имеет следующую формулу:

Как указано, например, на странице 478, левая колонка, в статье David R. Worthen et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, vol. 27(4), 277-286 (2001), ″производство и очистка полиеновых противогрибковых средств затруднены присущей им химической неустойчивостью. Полиены обычно имеют в своей структуре одну или несколько потенциально неустойчивых функциональных групп, включая способные к гидролизу сложноэфирные группы, ацетали и полуацетали, а также легко поддающиеся окислению сопряженные полиеновые системы (19). Таким образом, все полиеновые противогрибковые средства в определенной степени подвержены дезактивированию или выраженной деградации в условиях, обычно применяемых при их производстве и выделении из культур. Наиболее значительные из потенциально деструктивных факторов включают влажность, повышенную температуру, атмосферный кислород, поливалентные металлы и воздействие света (19, 20)″. Упомянутые в указанной статье ссылки 19 и 20 относятся к следующим источникам: (19) I.M. Teresin, Polyene Antibiotics - Present and Future; University of Tokyo Press: Tokyo, 1976; 122-123, и (20) K. Thoma and N. Kubler, Photostability of antifungal agents. 2. Photostability of polyene antibiotics. Pharmazie vol.52, 294-302 (1997).

В упомянутой выше статье Worthen на странице 478, левая колонка, сообщается, что ″дополнительно усложняющим очистку полиенов является тот факт, что практически все неочищенные полиены, выделенные из Streptomyces, содержат несколько различных изоформ, обладающих сходными физико-химическими свойствами, из которых только одна может быть необходима для клинического применения″.

В свете описанного выше не является сюрпризом то, что пентамицину было также дано три других названия, т.е. лагозин, фунгихромин и когомицин, поскольку изначально считали, что это разные вещества. Как указано в реферате статьи R.С. Pandey et al., J. Antibiotics vol.XXXV no.8, pages 988-996 (1982): ″Для трех полиеновых макролидных антибиотиков, фунгихромина, лагозина и когомицина, ранее описанных как имеющие некоторые стереохимические отличия по одному или более центрам, доказана … идентичность во всех отношениях, включая стереохимические аспекты. Ранее наблюдавшиеся различия в их свойствах в настоящий момент приписываются различающемуся содержанию примесей, которые можно отделить высокоэффективной жидкостной хроматографией. Все три антибиотика содержат один основной и несколько минорных компонентов″ (добавлено выделение). В Таблице I на странице 988 указанной статьи Pandey, температуры плавления, описанные в литературе для фунгихромина, лагозина и когомицина, находятся в диапазоне от 190 до 240°C.

В The Merck Index (12th edition) в статье 4312 на странице 727 указана температура плавления фунгихромина 157-162°C (с разложением).

Предметом статьи Pandey является физико-химическое и биологическое сравнение трех указанных макролидных антибиотиков, а не получение пентамицина с чистотой выше 95%. Как утверждается на странице 995 указанной статьи в начале раздела ″Discussion″, не представлялось возможным удалить все минорные компоненты даже после очистки методом многократного CCD (противоточное распределение). Температуры плавления очищенного таким образом фунгихромина, лагозина и когомицина приведены в Таблице 2 на странице 990 и находятся в диапазоне 157-165°C. В статье Pandey нигде не указано, что пентамицин выделяли или кристаллизовали. Единственными температурами плавления (находящимися в интервале от 157 до 240°C!), приведенными в статье Pandey, являются значения из литературных источников, перечисленные в Таблице 1, и значения, вытекающие из противоточного распределения в Таблице 2. Поэтому в статье Pandey нет признаков того, что был получен пентамицин, имеющий чистоту выше 95%.

Следует отметить, что пентамицин представляет собой сравнительно большую и структурно сложную молекулу, содержащую 12 асимметрических центров, и, таким образом, имеющую 2¹² (=4096) стереоизомеров. Кроме того, пентамицин содержит 5 двойных связей, для которых возможна цис-транс-изомерия. Тотальный химический синтез нужного из возможных 4096 стереоизомеров занял бы годы, сам по себе был бы изобретением, и с экономической точки зрения был бы намного дороже по сравнению с биосинтезом упомянутыми выше штаммами Streptomyces, при этом необходимо помнить, что устойчивость пентамицина очень невысокая.

О невысокой устойчивости пентамицина можно судить, например, по статье R.W. Rickards и др., J. Antibiotics vol.XXIII, no.12, pages 603-611, описывающей автоокисление лагозина воздухом в растворе метанола в процессе радикального присоединения, который можно ингибировать антиоксидантами. Согласно Rickards и др., главными первичными продуктами автоокисления лагозина являются определенные эпоксиды, в то время как продолжительное автоокисление дает высшие продукты окисления и, в конечном счете, полимерные вещества. В полном соответствии с положениями из указанной выше статьи Worthen, Rickards и др. на стр. 603 утверждают, что представители полиеновой подгруппы макролидных антибиотиков ″в целом неустойчивы, и воздействие кислот, щелочей, тепла, воздуха или света сопровождается декомпозицией и потерей биологической активности. В частности, такая чувствительность к воздуху и свету, которая главным образом связана с полиеновым хромофором, создает проблемы при хранении перед клиническим применением.″

В упомянутом выше британском патенте 884711, в Примере 1 на странице 8, строка 41, утверждается, что был получен ″чистый лагозин″. В указанном Примере 1 описывается выделение лагозина из ферментативного бульона, включающее стадии экстракции фракций ферментативного бульона бутанолом, концентрирования экстракта, добавления воды, промывки диэтиловым эфиром, фильтрования, экстрагирования метанолом в экстракторе Сокслета и фильтрования, после чего, согласно стр.8, строка 33 и 35 в указанном британском патенте, был получен лагозин с чистотой ″примерно 75%″. Как утверждается на стр. 8, строки 34-42, для удаления примесей лагозин с чистотой 75% экстрагировали в экстракторе Сокслета хлороформом, сушили на воздухе, экстрагировали диэтиловым эфиром, сушили на воздухе и снова экстрагировали метанолом. Как утверждается, при охлаждении метанола в течение ночи получали ″чистый лагозин″, но температура плавления не приводится.

Для квалифицированного специалиста в данной области, при прочтении приведенных выше пассажей из британского патента весьма сомнительно, что по описанным выше методикам можно далее очистить лагозин, имеющий чистоту 75%. Сомнения возникают потому, что обработку диэтиловым эфиром и метанолом уже осуществляли ранее без повышения чистоты лагозина выше 75%. Таким образом, почему повторение данной обработки должно заметно повысить чистоту? Кроме того, следовало бы ожидать, что стадии сушки лагозина на воздухе приведут к окислению, как описано Rickards и др. (см. выше). Наконец, кристаллизация неочищенного пентамицина из метанола не дает пентамицина, имеющего чистоту выше 95% (даже три последовательные кристаллизации), как доказано в Примере 8 в настоящей заявке. Это происходит вследствие того, что, как было обнаружено авторами настоящего изобретения, некоторые примеси кристаллизуются совместно с пентамицином и поэтому не могут быть удалены кристаллизацией, и избавиться от них можно только другими способами, описанными в настоящем изобретении. Следует помнить, что пентамицин это сравнительно большая молекула, так что примеси и пентамицин могут иметь очень небольшие различия, например эпоксидирование одной из пяти двойных связей. Разумеется, разделение соединений, столь близких по своему строению, создает огромные проблемы. Хотя уже вследствие сказанного выше можно ожидать, что по методике Примера 1 из британского патента 884711 невозможно получить ″чистый″ лагозин, авторы настоящего изобретения заказали сторонней организации максимально точный повтор способа, описанного в указанном Примере. Полученный результат описан в Примере 10 настоящей заявки. Как и ожидалось, хотя чистота ″примерно 75%″ для промежуточного вещества была грубо подтверждена (найдено: 67.3%), дальнейшие стадии очистки не дали ″чистого″ пентамицина, а привели к получению пентамицина, имеющего чистоту лишь 70.1%.

Пентамицин был действующим веществом в лекарственных препаратах, зарегистрированных в 1980-х годах под торговым наименованием Pentacin® в Швейцарии, но из-за проблем с соответствием спецификациям по чистоте и устойчивости для зарегистрированного продукта (даже несмотря на то, что продажная готовая форма содержала антиоксидант) был выведен с рынка. Согласно спецификации в швейцарских регистрационных документах, чистота пентамицина составляла 95%. Однако при использовании доступных в настоящее время методов анализа было установлено, что не было определено число примесей, имевшихся в зарегистрированном в прошлом пентамицине, и что поэтому фактическая чистота пентамицина в прошлом была намного ниже 95%.

Сам пентамицин содержит липофильную и очень гидрофильную часть и поэтому ведет себя аналогично поверхностно-активному веществу. Кроме того, он относительно нерастворим в воде и склонен образовывать гели, практически не поддающиеся фильтрованию.

Несмотря на напряженные усилия, авторам настоящего изобретения долгое время не удавалось повысить чистоту пентамицина до уровня выше 93%. На самом деле, планка чистоты 93% вплоть до настоящего изобретения казалась непреодолимой.

Задачей настоящего изобретения было повысить чистоту пентамицина до уровня выше 93%, особенно выше 95%, и перевести пентамицин в форму, достаточно устойчивую для того, чтобы сделать возможным его повторное выведение на фармацевтический рынок Швейцарии и его регистрацию в качестве лекарственного средства в других странах.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Фотография игловидного сольвата пентамицин-морфолин (1:1).

Фиг.2. Фотография хлопьевидного сольвата пентамицин-морфолин (1:1).

Фиг.3. Диаграмма рентгеновской дифракции на порошке для игловидного сольвата пентамицин-морфолин (1:1).

Фиг.4. Диаграмма рентгеновской дифракции на порошке для хлопьевидного сольвата пентамицин-морфолин (1:1).

Фиг.5. Диаграмма рентгеновской дифракции на порошке полиморфа А пентамицина.

Фиг.6. Фотография полиморфа A пентамицина.

Фиг.7. Диаграмма дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для полиморфа A пентамицина.

Фиг.8. Диаграмма (ДСК) для аморфного пентамицина.

Фиг.9. Диаграмма рентгеновской дифракции на порошке аморфного пентамицина.

Фиг.10. Диаграмма ДСК (вверху) и рентгеновской дифракции (внизу) для полиморфа C пентамицина.

Фиг.11. Диаграмма рентгеновской дифракции на порошке (вверху) и ДСК для неочищенного пентамицина.

Фиг.12. ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) хроматограмма неочищенного пентамицина.

Фиг.13. Диаграмма ДСК (вверху) и рентгеновской дифракции на порошке (внизу) для пентамицина, зарегистрированные после трех кристаллизации из метанола, как описано в J. Antibiotics, ser.A, vol.XI, no.1, Jan. 1958, pp.26-29.

Фиг.14. ВЭЖХ хроматограмма пентамицина, зарегистрированная после трех кристаллизации из метанола, как описано в J. Antibiotics, ser. A, vol.XI, no.1, Jan. 1958, pp.26-29.

Описание изобретения

После длительных и первоначально бесплодных усилий, авторами настоящей патентной заявки было неожиданно обнаружено, как пентамицин можно производить с чистотой выше 93%, в особенности выше 95%, и успешно придавать ему стабильность в отношении деградации.

Авторы настоящего изобретения открыли, что определенные примеси кристаллизуются совместно с пентамицином в той же кристаллической решетке, поэтому дальнейшая очистка путем кристаллизации невозможна. Как показано в Примере 8, даже после трех последовательных кристаллизации сырого пентамицина из метанола, полученный продукт все еще содержит около 10% примесей. Указанные примеси включают соединения, которые структурно очень близки с пентамицином, поэтому они не могут быть удалены простыми общепринятыми способами, например различные эпоксиды пентамицина, производные пентамицина, в которых гидроксигруппа замещена на оксогруппу или метилирована до метоксигруппы, производные пентамицина, в которых двойная связь восстановлена до простой связи, производные пентамицина, содержащие тетрагидропираноновое кольцо, и/или, потенциально, стереоизомеры пентамицина.

Было обнаружено, что пентамицин формирует определенные сольваты с небольшими полярными гетероциклами, такими как морфолин (молярное соотношение 1:1), N-метилпирролидоном (NMP, молярное соотношение 1:1), N-этилпирролидоном (NEP) или тетрагидрофураном (ТГФ), предпочтительно в спиртовых растворителях, таких как метанол или этанол, и что некоторые из таких сольватов, например сольваты с NMP и особенно морфолином, имеют полезные свойства, т.е. неожиданно было обнаружено, что они могут использоваться для очистки пентамицина до уровня выше 93% при их производстве в метаноле или этаноле, но, согласно имеющимся сведениям, не в неполярных растворителях, таких как метилтретбутиловый эфир (МТВЕ) или толуол. В контексте настоящей заявки термин «сольват» следует понимать как охватывающий также сокристалл, поскольку различие между сольватом и сокристаллом состоит лишь в том, является ли упомянутый выше небольшой полярный гетероцикл жидким или твердым при комнатной температуре.

Следовательно, настоящее изобретение касается способа производства пентамицина с химической чистотой выше 93%, предпочтительно 95%, более предпочтительно 96%, и наиболее предпочтительно 97% по весу, и некоторых сольватов и полиморфов пентамицина, и их применения для очистки или стабилизации пентамицина.

Авторы настоящего изобретения провели большое число экспериментов по кристаллизации, в которых пентамицин был растворен, например, в диметилсульфоксиде (ДМСО), диметилформамиде (ДМФА) и N-метилпирролидоне (NMP). К полученным таким образом растворам добавляли антирастворители до наступления кристаллизации, при этом антирастворители означают растворители, в которых пентамицин значительно менее растворим, такие как метанол, этанол, изопропанол, ацетон, этилацетат или ацетонитрил. Также исследовалась кристаллизация пентамицина, растворенного в большом объеме антирастворителей, таких как метанол.

В ходе указанных экспериментов по кристаллизации было открыто, что пентамицин формирует сольваты с морфолином и N-метилпирролидоном, но не с ДМСО, и что указанные сольваты, неожиданно, могут использоваться для снижения содержания примесей, совместно кристаллизующихся с пентамицином, путем повторной перекристаллизации указанных сольватов.

Одним способом удаления примесей, совместно кристаллизующихся с пентамицином, является последовательное получение и кристаллизация сольвата пентамицина с морфолином, который сначала кристаллизуется в форме игл (см. Фиг.1), затем превращение игловидного полиморфного морфолинового сольвата в морфолиновый сольват, который кристаллизуется в форме хлопьев (см. Фиг.2), и затем удаление морфолина. По сравнению с хлопьевидным морфолиновым сольватом пентамицина, игловидный сольват меньше подходит для очистки. Согласно (все еще ограниченным) экспериментальным данным, полученных к настоящему моменту, его нельзя очистить до уровня заметно выше 93% путем перекристаллизации. Поэтому игловидный сольват превращают как можно быстрее в хлопьевидный сольват, например добавлением затравочных кристаллов хлопьевидного сольвата. Последовательное получение игловидного и хлопьевидного морфолиновых сольватов можно осуществлять в одном реакционном сосуде. Получение морфолиновых сольватов предпочтительно осуществляют в атмосфере защитного газа, такого как азот, при защите от свет, и в присутствии антиоксиданта, такого как бутилированный гидроксианизол (ВНА) или, предпочтительно, бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), т.е. 2,6-ди-трет-бутил-4-метил фенол. Кристаллизацию предпочтительно осуществляют в подходящих полярных растворителях, таких как подходящий спирт, например подходящий алканол, например этанол или, наиболее предпочтительно, метанол. Со спиртами, имеющими более длинную цепь, и неполярными растворителями, например толуолом, МТБЭ и т.д., не достигается практически никакого эффекта очистки. Морфолин как единственный растворитель также не обеспечивает преимущества, поскольку растворимость пентамицина в морфолине слишком велика. Очистку путем формирования хлопьевидного морфолинового сольвата повторяют столько раз, сколько необходимо для достижения желаемой чистоты.

Увеличение количества морфолина по отношению к пентамицину в системе растворителей ускоряет превращение игловидного полиморфа в хлопьевидный полиморф. Как описано выше, указанное превращение можно также ускорить добавлением затравочных кристаллов хлопьевидного полиморфа.

Настоящее изобретение касается способа очистки сырого пентамицина через формирование его хлопьевидного морфолинового сольвата (1:1 молярное соотношение пентамицина и морфолина) путем перемешивания смеси сырого пентамицина, подходящего спирта, особенно такого, как низший алканол, такой как этанол или, предпочтительно, метанол, морфолина и подходящего антиоксиданта, такого как ВНТ, при температуре, предпочтительно, от около 5 до 50°C, предпочтительно при комнатной температуре, преимущественно в атмосфере защитного газа, такого как азот, до кристаллизации хлопьевидного пентамицин-морфолинового сольвата, его выделение, например фильтрованием, и промывка низшим алканолом, таким как метанол, и, при желании, дальнейшая очистка полученного хлопьевидного пентамицин-морфолинового сольвата путем повтора описанной выше методики один или более раз с применением полученного хлопьевидного пентамицин-морфолинового сольвата вместо сырого пентамицина.

Настоящее изобретение касается также способа очистки сырого пентамицина через формирование его сольвата с NMP путем перемешивания смеси сырого пентамицина, подходящего спирта, особенно такого, как низший алканол, такой как этанол или, предпочтительно, метанол, N-метилпирролидона (NMP) и подходящего антиоксиданта, такого как ВНТ, при температуре, предпочтительно, от около 5 до 50°C, предпочтительно при комнатной температуре, преимущественно в атмосфере защитного газа, такого как азот, до кристаллизации сольвата с NMP, его выделение, например фильтрованием, и промывка низшим алканолом, таким как метанол, и, при желании, дальнейшая очистка полученного сольвата с NMP путем повтора описанной выше методики.

Описанным выше способом с применением сольвата с NMP можно удалить одну или две примеси, совместно кристаллизующиеся с пентамицином, т.е. примесь, имеющую относительное время удерживания 1.54 (в системе ВЭЖХ, описанной в настоящем тексте), в то время как содержание другой примеси, имеющей относительное время удерживания 0.83, можно лишь понизить до уровня 3.3%.

Морфолин и NMP удаляют из соответствующих сольватов пентамицина путем перемешивания указанных сольватов в течение нескольких часов в метаноле или, предпочтительно, этаноле, например при температуре между 0°C и +50°C, предпочтительно при комнатной температуре, отфильтровывания полученных кристаллов, промывки их метанолом или, предпочтительно, этанолом, и, при желании, повторения данной методики до получения продукта, содержащего менее 0.1% морфолина или NMP.

Остаточный морфолин или NMP можно удалить кристаллизацией из смеси ДМСО/этанол или ДМСО/метанол, в результате чего получают полиморф A пентамицина.

Было обнаружено, что пентамицин существует в виде аморфной формы (см. Фиг.8 и Фиг.9) и нескольких других полиморфных форм помимо формы A, далее по тексту называемых полиморфами от B до E. По сравнению с другими полиморфами, полиморф A отличается в спектре рентгеновской дифракции на порошке линиями при следующих углах 2тета (± около 0.2°): 2.28, 7.38 и 20.16, полиморф B дает линии при 9.54, 21.28 и 22.32, полиморф C имеет характеристичную линию при 7.04, полиморф D имеет характеристичную линию при 2.58, полиморф E имеет характеристичную, хотя и не очень интенсивную, линию при 3.32, и сырой пентамицин (см. Фиг.11 и Фиг.12) дает характеристичные линии при 8.84 и 13.14. При сравнении указанных выше углов 2тета (± около 0.2°): 2.28, 7.38 и 20.16 для полиморфа A с соответствующими значениями в Примере 7, т.е. 2.22, 7.29 и 20.17, очевидно наблюдается небольшое расхождение. Это является следствием того факта, что соответствующие фигуры получены при разных измерениях. Однако различия находятся в границах международной принятой экспериментальной ошибки для углов 2тета, составляющей ±0.2°.

Полиморф A кристаллизуется, например, из раствора пентамицина в диметилсульфоксиде (ДМСО) после добавления этилацетата.

Аморфный пентамицин получают, например, из раствора пентамицина в диметилсульфоксиде (ДМСО) после добавления ацетонитрила.

Полиморф B кристаллизуется из смеси метанол/хлороформ.

Полиморф C (см. Фиг.10) получают при добавлении метанола к раствору пентамицина в диметилформамиде при 60°C, добавляя метанол и охлаждая до 0°C.

Полиморф E кристаллизуется из смеси диметилсульфоксид/ацетонитрил.

Полиморф A проявляет себя в качестве наиболее термодинамически стабильного полиморфа. Диаграмма его дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) (изображена на Фиг.7) демонстрирует один единственный сигнал. В отличие от него, ДСК-диаграмммы других кристаллических полиморфов содержат более одного сигнала (см, например, ДСК полиморфа C на Фиг.10), тем самым показывая переходы в другие полиморфные формы при плавном повышении температуры. Наиболее неожиданным и совершенно непредвиденным качеством чистого полиморфа A является его устойчивость на воздухе (см. Пример 9), что сильно отличает его от всех известных к настоящему моменту форм чистого пентамицина.

Высокочистые формы пентамицина по настоящему изобретению, особенно такие, как полиморф A пентамицина с химической чистотой выше 95%, могут применяться в способе лечения теплокровных животных, включая предпочтительно млекопитающих и особенно человека, например в виде фармацевтических готовых форм для местного применения, например вагинальных суппозиториев, для лечения вагинальных инфекций и инфекций слизистой, вызываемых Candida, особенно Candida albicans, и Trichomonas vaginalis.

Указанные фармацевтические готовые формы для местного применения, например, вагинальные суппозитории, содержат, например, пентамицин в концентрации от 0.1 до 5% по весу, вместе с подходящими фармацевтическими наполнителями, и содержат от 3 мг до 150 мг пентамицина в одной дозе, т.е. в суппозитории. Вагинальные суппозитории вводятся, например, женщине весом 60 кг 1-2 раза в день.

Суммируя вышесказанное, настоящее изобретение касается пентамицина с химической чистотой выше 95%, предпочтительно с химической чистотой выше 97%, особенно в форме полиморфа A, более конкретно в форме полиморфа A с химической чистотой выше 95%, предпочтительно 97%, отличающегося следующими значениями 2тета, ± около 0.2°, наиболее интенсивных линий в спектре рентгеновской дифракции на порошке, относительные интенсивности представлены исключительно в качестве грубой оценки:

Угол 2тета	Относительная интенсивность	Угол 2тета	Относительная интенсивность	Угол 2тета	Относительная интенсивность	Угол 2тета	Относительная интенсивность
2.22	100	7.29	33	9.25	15	19.78	51
20.17	52	20.62	25	21.24	17

Настоящее изобретение также касается пентамицина в форме сольвата, особенно в форме сольвата, пригодного для очистки пентамицина, такого как сольваты с гетероциклическим соединением, предпочтительно с низкомолекулярным гетероциклическим соединением, например N-метилпирролидоном или, предпочтительно, морфолином, такие как игловидный морфолиновый сольват или, предпочтительно, хлопьевидный морфолиновый сольват, особенно таких сольватов с химической чистотой выше 95%, 96% или, предпочтительно, 97%, особенно хлопьевидного морфолинового сольвата, имеющего следующие значения 2тета, ± около 0.2°, наиболее интенсивных линий в спектре рентгеновской дифракции на порошке, относительные интенсивности представлены исключительно в качестве грубой оценки:

Угол 2тета	Относительная интенсивность	Угол 2тета	Относительная интенсивность	Угол 2тета	Относительная интенсивность
9.73	41.5	21.49	68.5	28.95	12.0
10.29	17.1	22.08	16.5	29.33	12.2

12.99	14.0	22.47	26.9	30.32	10.8
15.04	24.7	23.02	24.5	34.02	10.1
16.01	15.1	24.06	13.4	35.24	12.1
17.29	19.3	25.21	10.7	35.81	11.5
18.29	18.2	25.91	16.0	36.37	10.7
19.26	28.0	26.55	18.5	37.42	13.1
20.03	92.3	27.79	12.7	37.91	12.6
20.67	100.00	28.09	12.7	39.39	14.1

Настоящее изобретение также касается использования упомянутых выше сольватов пентамицина для химической очистки пентамицина.

Настоящее изобретение также касается способа очистки пентамицина путем превращения пентамицина с химической чистотой ниже 93% в подходящий сольват, особенно в один из упомянутых выше сольватов, очистки указанного сольвата кристаллизацией и высвобождения пентамицина из сольвата, например длительным перемешиванием в 1-5-алканоле, при этом описанный способ очистки осуществляется, при желании, в присутствии подходящего антиоксиданта, такого как, предпочтительно, 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол.

Настоящее изобретение также касается способа значительного уменьшения скорости деградации пентамицина, имеющего химическую чистоту выше 95%, путем его превращения в его полиморф A, особенно такого способа, в котором превращение в полиморф A осуществляется путем его кристаллизации из раствора пентамицина, имеющего чистоту выше 95%, в диметилсульфоксиде после добавления этилацетата.

Подробное описание экспериментов

Спектры рентгеновской дифракции на порошке регистрировали на дифрактометре Rigaku Miniflex (Cu Ka излучение, интервал регистрации 2-40° [2Тета], ширина шага 0.02° [2Тета], регистрируемый интервал 0.0083° [2Тета], контейнер для пробы; кремний). Экспериментальная ошибка для зарегистрированных углов 2тета составляла около ±0.2°. Экспериментальная ошибка в определении относительных интенсивностей высокая. Поэтому значения относительных интенсивностей следует расценивать исключительно как приблизительную оценку.

Представленные далее примеры иллюстрируют настоящее изобретение. Аббревиатура ″rrt″ означает ″относительное время удерживания″ (″relative retention time″), т.е. соотношение между эффективным временем удерживания примеси и эффективным временем удерживания пентамицина в ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Термин ″imp rrt″, используемый в примерах, означает время удерживания примеси относительно пентамицина, т.е. rrt пентамицина принимается за 1.00. Относительное время удерживания ниже 1.00 означает, что примесь элюируется раньше пентамицина, относительное время удерживания выше 1.00 означает, что примесь элюируется после пентамицина. Например, ″imp rrt = 0.83: 8.0%″ означает, что имеется примесь в количестве 8% с относительным временем удерживания 0.83. Как принято в ВЭЖХ, процентные содержания детектированных соединений выражены в процентах площади, отражая площадь соответствующего сигнала, т.е. в приведенном выше примере 8% это проценты площади. Описанную в настоящем тексте ВЭЖХ хроматографию проводили с применением системы Agilent (торговая марка) 1100 или ее эквивалента. Подвижная фаза содержит растворы A и B, при этом раствор A представляет собой смесь вода-ацетонитрил-трифторуксусная кислота в соотношении 650:350:0.01 (об:об:об), раствор В представляет собой смесь ацетонитрил-пропанол-трифторуксусная кислота в соотношении 750:250:0.01 (об:об:об). Образец для анализа растворяют в смеси ацетонитрил-вода-тетрагидрофуран в соотношении 1:1:2 (об:об:об), к которому добавляют 0.1% (об:об) ВНТ в смеси ацетонитрил-вода-тетрагидрофуран в соотношении 1:1:2 (об:об:об) и анализируют при конечной концентрации 0.6 мг/мл.

ВЭЖХ анализ проводят на приборе Waters Atlantis (торговая марка) dC₁₈ RP 250×4.6 мм, 5 мкм колонка. Колонки Atlantis dC₁₈ относятся к линии силикагелевых дифункциональносвязанных обращеннофазных C₁₈ колонок. Применяются следующие параметры:

Градиент:

Время [мин]	Раствор A [об.%]	Раствор B [об.%]
0	100	0
6	100	0
10	77	23
16	77	23
17	40	60
22	40	60

23	100	0
30	100	0

Скорость потока: 1.0 мл/мин

Температура: 40°C

Детектирование: 320 нм

Вводимый объем: 5 мкл

Примеры

Пример 1: игловидный сольват пентамицин-морфолин

К смеси метанола (1.75 г) и морфолина (0.75 г) добавляют бутилированный гидрокситолуол (ВНТ; 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) (4 мг) и неочищенный пентамицин (500 мг; химическая чистота: 80.6%; содержание пентамицина: 80%; imp rrt = 0.83: 8.0%; imp rrt = 1.54: 7.0%). ВЭЖХ хроматограмма неочищенного пентамицина содержит 2 основных пика примесей. Первый из них имеет относительное время удерживания (rrt) 0.83. Данный пик состоит из (по меньшей мере) 2 различных примесей с одинаковым временем удерживания. Общее количество данных двух примесей вместе составляет 8%. Вторая основная примесь имеет rrt 1.54, и количество данной примеси в исходном материале составляет 7%.

Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 дней. Кристаллы отфильтровывают, промывают метанолом (два раза по 1 мл) и сушат при пониженном давлении, получая игловидный сольват пентамицин-морфолин (362 мг, химическая чистота: 86.2%; содержание пентамицина: 75%; содержание морфолина: 10%; imp rrt = 0.83:5.3%; imp rrt = 1.54: 6.5%).

Как следует из описанного выше, количество обеих примесей с rrt 0.83 и rrt 1.54 уменьшается в игловидном сольвате пентамицин-морфолин по сравнению с неочищенным пентамицином, используемым в качестве исходного материала.

Пример 2: хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (молярное соотношение 1:1)

К смеси метанола (1.5 г) и морфолина (1 г) добавляют ВНТ (4 мг) и неочищенный пентамицин (500 мг; химическая чистота: 80.6%; содержание пентамицина: 80%; imp rrt = 0.83: 8.0%; imp rrt = 1.54: 7.0%). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 дней. Кристаллы отфильтровывают, промывают метанолом (два раза по 1 мл) и сушат при пониженном давлении, получая хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (327 мг, химическая чистота: 90.9%; содержание пентамицина: 82%; imp rrt = 0.83: 4.3%; imp rrt = 1.54: 3.0%), содержащий пентамицин и морфолин в молярном соотношении 1:1.

Примечание: Через 30 мин перемешивания под микроскопом наблюдается главным образом игловидный полиморф. После 3 дней перемешивания форма кристаллов изменяется на «хлопьевидную».

Как следует из описанного выше, количество обеих примесей с rrt 0.83 и rrt 1.54 еще больше уменьшается в хлопьевидном сольвате пентамицин-морфолин по сравнению как с неочищенным пентамицином, используемым в качестве исходного материала, так и с игловидным полиморфом, описанным в Примере 1.

Спектр рентгеновской дифракции на порошке для игловидного полиморфа сольвата пентамицин-морфолин (молярное соотношение 1:1) изображен на Фиг.3.

Пример 3: получение хлопьевидного сольвата пентамицин-морфолин с применением затравочных кристаллов

К смеси метанола (11.52 г) и морфолина (7.68 г) добавляют ВНТ (10 мг) и неочищенный пентамицин (4.0 г; химическая чистота: 80.6%; содержание пентамицина: 80%; imp rrt = 0.83: 8.0%; imp rrt = 1.54: 7.0%). В смесь вносят затравочные кристаллы хлопьевидного сольвата пентамицин-морфолин (12 мг; хлопьевидный полиморф) и перемешивают при комнатной температуре 10 ч. Затем добавляют следующую порцию неочищенного пентамицина (2.4 г), и смесь перемешивают в течение ночи. Кристаллы отфильтровывают, промывают метанолом (3 раза по 3 мл) и сушат при пониженном давлении, получая пентамицин. (5.46 г; химическая чистота: 89.2%; содержание пентамицина: 82%; imp rrt = 0.83: 4.9%; imp rrt = 1.54: 4.0%; выход, скорректированный с учетом содержания: 78%; выход от теории: 87%).

Пример 4: очистка хлопьевидного сольвата пентамицин-морфолин

К смеси метанола (20.6 г) и морфолина (13.7 г) добавляют ВНТ (4 мг) и хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (4.75 г; химическая чистота: 89.2%; содержание пентамицина: 81%; imp rrt = 0.83: 4.9%; imp rrt = 1.54: 4.0%). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч. Кристаллы отфильтровывают, промывают метанолом (2 раза по 2 мл) и сушат при пониженном давлении, получая очищенный хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (3.45 г). Часть полученного вещества (3.39 г) добавляют к смеси метанола (10.8 г), морфолина (7.2 г) и ВНТ (4 мг).

Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч. Кристаллы отфильтровывают, промывают метанолом (2 раза по 1 мл) и сушат при пониженном давлении, получая еще более очищенный хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (2.27 г; химическая чистота: 93.7%; содержание пентамицина: 83%; imp rrt = 0.83: 3.2%; imp rrt = 1.54: 2.0%).

Пример 5: последовательные перекристаллизации хлопьевидного сольвата пентамицин-морфолин

К смеси метанола (1.5 г) и морфолина (1.0 г) добавляют ВНТ (5 мг) и хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (385 мг; химическая чистота: 87.7%; содержание пентамицина: 80%; imp rrt = 0.83: 5.4%; imp rrt = 1.54: 4.7%). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18ч. Кристаллы отфильтровывают, промывают метанолом (3 раза по 0.5 мл) и сушат при пониженном давлении, получая хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (230 мг; химическая чистота: 94.5%; imp rrt = 0.83:3.0%; imp rrt = 1.54: 1.5%).

К смеси метанола (0.84 г) и морфолина (0.56 г) добавляют ВНТ (3 мг) и хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (220 мг; химическая чистота: 94.5%; imp rrt = 0.83:3.0%; imp rrt = 1.54:1.5%). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18ч. Кристаллы отфильтровывают, промывают метанолом (3 раза по 0.5 мл) и сушат при пониженном давлении, получая хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (144 мг; химическая чистота: 96.2%; imp rrt = 0.83:2.3%; imp rrt = 1.54: 0.82%).

К смеси метанола (0.6 г) и морфолина (0.4 г) добавляют ВНТ (2 мг) и хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (244 мг; химическая чистота: 96%; imp rrt = 0.83: 2.3%; imp rrt = 1.54: 1.0%). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Кристаллы отфильтровывают, промывают метанолом (3 раза по 0.5 мл) и сушат при пониженном давлении, получая хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (162 мг; химическая чистота: 96.6%; imp rrt = 0.83: 1.9%; imp rrt = 1.54: 0.7%).

К смеси метанола (0.42 г) и морфолина (0.28 г) добавляют ВНТ (2 мг) и хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (140 мг; химическая чистота: 96.6%; imp rrt = 0.83: 1.9%; imp rrt = 1.54: 0.7%). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Кристаллы отфильтровывают, промывают метанолом (3 раза по 0.5 мл) и сушат при пониженном давлении, получая хлопьевидный сольват пентамицин-морфолин (89 мг; химическая чистота: 97.3%; imp rrt = 0.83: 1.6%; imp rrt = 1.54: 0.5%).

Спектр рентгеновской дифракции на порошке для полученного хлопьевидного полиморфа