Варианты изопренсинтазы, применяемые для улучшения продуцирования изопрена микроорганизмами

Варианты изопренсинтазы, применяемые для улучшения продуцирования изопрена микроорганизмами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 61/125336, поданной 23 апреля 2008, которая во всей своей полноте включена в настоящее описание посредством ссылки.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, содержащим по меньшей мере один фермент изопренсинтазу, обладающую повышенной каталитической активностью и/или растворимостью. В частности, настоящее изобретение относится к вариантам растительных изопренсинтаз, способствующих повышению уровня продуцирования изопрена в клетках микроорганизмов-хозяев. Биосинтетически продуцируемый изопрен согласно изобретению может найти свое применение в изготовлении каучука и эластомеров.

Предшествующий уровень техники

Изопреноиды представляют собой изопреновые полимеры, которые используются для получения фармацевтических средств, натуральных пищевых продуктов, флаворантов, косметики и резиновых изделий. Однако получение природных изопреноидов ограничено требованиями к охране окружающей среды. По этим причинам, в целях получения изопреноидных композиций, имеющих небольшое количество примесей и высокую степень однородности, изопреноиды, такие как каучук, часто синтезируют искусственно.

Изопрен (2-метил-1,3-бутадиен) представляет собой летучий углеводород, который не растворяется в воде и растворяется в спирте. В промышленном объеме, изопрен может быть получен путем прямого выделения из нефтяных крекинг-C5-фракций или путем дегидратации C5-изоалканов или изоалкенов (Weissermel and Arpe, Industrial Organic Chemistry, 4th ed., Wiley-VCH, pp. 117-122, 2003). C5-остов может быть также синтезирован из менее крупных субъединиц. Однако желательно разработать способ крупномасштабного продуцирования изопрена, который не будет зависеть от состояния природных ресурсов.

Биосинтетическое продуцирование изопрена происходит по двум различным путям метаболизма (Julsing et al., Appl Microbiol Biotechnol, 75:1377-1384, 2007). В эукариотах и архебактериях, изопрен образуется по мевалонатному пути (MVA), а некоторые эубактерии и высшие растения продуцируют изопрен по метилэритритолфосфатному (MEP) пути. Выделение изопрена из растений зависит от количества света и температуры, и уровень его выделения повышается по мере развития листьев. Изопрен-продуцирующий фермент, изопренсинтаза, был идентифицирован в деревьях осины (Silver and Fall, Plant Physiol, 97:1588-1591, 1991; и Silver and Fall, J Biol Chem, 270:13010-13016, 1995), и очевидно, что такой фермент ответственен за in vivo продуцирование изопрена в целых листьях. Было также описано продуцирование изопрена бактериями (Kuzma et al, Curr Microbiol, 30:97-103, 1995; и Wilkins, Chemosphere, 32:1427-1434, 1996), и количество продуцируемого изопрена в бактериях варьируется в зависимости от стадии их роста и содержания питательных веществ в культуральной среде (патент США 5849970, Fall et al.; и публикация Wagner et al., J Bacteriol, 181:4700-4703, 1999, которые во всей своей полноте включены в настоящее описание посредством ссылки). Однако уровни изопрена, продуцируемые бактериальными системами, описанными в литературе, являются недостаточными для их применения в промышленных целях.

Таким образом, в настоящее время необходимо разработать эффективный и крупномасштабный способ продуцирования изопрена в бактериях, который будет служить в качестве основы для промышленного производства изопреноидов.

Все приведенные в данном описании патенты, патентные заявки, статьи и публикации во всей своей полноте включены в настоящее описание посредством ссылки.

Описание сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и композициям, содержащим по меньшей мере один фермент изопренсинтазу, обладающую повышенной каталитической активностью и/или растворимостью. В частности, настоящее изобретение относится к вариантам растительных изопренсинтаз, способствующих повышению уровня продуцирования изопрена в клетках микроорганизмов-хозяев. Биосинтетически продуцируемый изопрен согласно изобретению может найти применение в производстве каучука и эластомеров.

В частности, настоящее изобретение относится к выделенным вариантам изопренсинтазы, где указанный вариант содержит замену в положении, соответствующем положению одного или нескольких (одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти) остатков изопренсинтазы пуэрарии волосистой, включающей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления изобретения вариантом изопренсинтазы является вариант изопренсинтазы пуэрарии волосистой (Pueraria sp.) или вариант изопренсинтазы тополя (Populus sp.). В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько остатков выбраны, но без ограничений, из группы, состоящей из L26, E30, F31, Q33, L35, E36, N37, L39, K40, V41, K43, L44, R61, V62, D63, Q65, K87, E94, N95, L99, D100, N105, K137, E138, G143, E144, N182, L184, K185, G187, N189, T190, P225, H226, K247, T257, E258, M259, D266, N334, D353, S357, 1358I, E361, N389, I392, I393, K398, E401, C421, Q423, Q424, E425, D426, H430, L432, R433, S434, D437, R443, L462, E463, H476, N478, D479, Q485, D508, P513, A515, Q532, Y533, L537, G538, R539, Y542, A543 и P557. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько остатков выбраны, но без ограничений, из группы, состоящей из P24, N25, Y309, D310, L377, F381, E384, Y399, N402, A403, S406, S407, G409, A411, L413, F449, A456, T457, S458, A459, A460, E461, L462, E463, R464, G465, E466, T467, T468, N469, M523, S527 и Y531. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько остатков выбраны, но без ограничений, из группы, состоящей из A20, N21, Y22, Q23, R271, W278, F299, V302 и S408. Настоящее изобретение также относится к выделенному варианту изопренсинтазы, а именно, изопренсинтазы пуэрарии волосистой, которая содержит замену A20G и имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. В субсерии таких вариантов осуществления изобретения указанный вариант содержит по меньшей мере две (две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять) замены, где одной из указанных замен является замена A20G в изопренсинтазе пуэрарии волосистой, имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. Настоящее изобретение также относится к выделенному варианту изопренсинтазы, а именно, изопренсинтазы пуэрарии, содержащей замену S408D и имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. В подсерии таких вариантов осуществления изобретения указанный вариант содержит по меньшей мере две (две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять) замены, где одной из замен является замена S408D в изопренсинтазе пуэрарии волосистой, имеющей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения вариант изопренсинтазы обладает по меньшей мере одним улучшенным свойством по сравнению с изопренсинтазой дикого типа. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно улучшенное свойство выбрано, но без ограничений, из группы, состоящей из удельной активности (способности продуцировать изопрен из диметилаллилдифосфата) и растворимости.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к полинуклеотидной последовательности, кодирующей вариант изопренсинтазы. Настоящее изобретение также относится к экспрессионному вектору, содержащему полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант изопренсинтазы, функционально присоединенную к промотору. В других своих вариантах осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей экспрессионный вектор. Настоящее изобретение также относится к лизату клетки-хозяина, где указанный лизат также содержит лизоцим. В некоторых вариантах осуществления изобретения лизат имеет нейтральный pH (6,5-7,5), а в других вариантах осуществления лизат имеет основный pH (выше 7,5 и ниже 9,5). Настоящее изобретение также относится к способам получения изопрена, включающим: (a) получение клеток-хозяев, содержащих экспрессионный вектор, и (b) культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для продуцирования изопрена. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные способы дополнительно включают (с) выделение изопрена. В других вариантах осуществления указанные способы дополнительно включают (d) полимеризацию изопрена. Настоящее изобретение также относится к способам детектирования изопренсинтазной активности, включающим: (a) культивирование клеток-хозяев, содержащих экспрессионный вектор, в условиях, подходящих для продуцирования варианта изопренсинтазы; (b) лизис клеток-хозяев с использованием буфера для лизиса, содержащего лизоцим, с получением клеточного лизата; и (c) детектирование изопренсинтазной активности в клеточном лизате путем измерения уровня продуцирования изопрена из диметилаллилдифосфата (DMAPP). В некоторых вариантах осуществления изобретения хозяина выбирают, но без ограничений, из группы, состоящей из грамположительных бактериальных клеток, грамотрицательных бактериальных клеток, клеток нитчатых грибов и дрожжевых клеток. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения хозяина выбирают, но без ограничений, из группы, состоящей из Escherichia sp. (E. coli), Panteoa sp. (P. citrea), Bacillus sp. (B. subtilis), Yarrowia sp. (Y. lipolytica) и Trichoderma (T. reesei). В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки-хозяева культивируют в среде, включающей источник углерода, выбранный, но без ограничений, из группы, состоящей из глюкозы, глицерола, глицерина, дигидроксиацетона, дрожжевого экстракта, биомассы, мелассы, сахарозы и масла.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам детектирования изопрена во множестве образцов (крупномасштабный скрининг), где указанные способы включают: (a) получение: i) множества образцов, каждый из которых содержит изопренсинтазу; ii) стеклянного планшета, содержащего множество лунок; и iii) герметика для заклеивания стеклянных планшетов; (b) внесение множества образцов во множество лунок указанного стеклянного планшета; (c) заклеивание стеклянного планшета герметиком, с получением герметично закрытого стеклянного планшета, имеющего множество лунок, в верхней части (зоне «хэдспейс») которых присутствует образец; (d) инкубирование указанного стеклянного планшета в условиях, при которых изопренсинтаза является активной, и (e) детектирование изопрена в зоне «хэдспейс» планшета. В некоторых вариантах осуществления изобретения изопрен детектируют с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС). В некоторых вариантах осуществления множество образцов содержат клетки-хозяева, включающие экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант изопренсинтазы, функционально присоединенную к промотору. В некоторых вариантах осуществления множество образцов включает лизат клеток-хозяев, лизоцим и диметилаллилдифосфат (DMAPP). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения стеклянным планшетом является стеклянный блок с глубокими лунками. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения планшет с множеством лунок включает по меньшей мере 24 лунки (предпочтительно, по меньшей мере 48 лунок, более предпочтительно, по меньшей мере 96 лунок, еще более предпочтительно, по меньшей мере 192 лунки, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 384 лунки). В особенно предпочтительных вариантах осуществления каждая из множества лунок имеет объем 2 мл или менее (предпочтительно, 2 мл-0,2 мл).

Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим гетерологичную полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант изопренсинтазы, функционально присоединенную к промотору, где указанный вариант изопренсинтазы содержит замену в положении, соответствующем положению одного или нескольких (одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти) остатков изопренсинтазы пуэрарии волосистой, включающей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько остатков выбраны, но без ограничений, из группы, состоящей из L26, E30, F31, Q33, L35, E36, N37, L39, K40, V41, K43, L44, R61, V62, D63, Q65, K87, E94, N95, L99, D100, N105, K137, E138, G143, E144, N182, L184, K185, G187, N189, T190, P225, H226, K247, T257, E258, M259, D266, N334, D353, S357, I358I, E361, N389, I392, I393, K398, E401, C421, Q423, Q424, E425, D426, H430, L432, R433, S434, D437, R443, L462, E463, H476, N478, D479, Q485, D508, P513, A515, Q532, Y533, L537, G538, R539, Y542, A543 и P557. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько остатков выбраны, но без ограничений, из группы, состоящей из P24, N25, Y309, D310, L377, F381, E384, Y399, N402, A403, S406, S407, G409, A411, L413, F449, A456, T457, S458, A459, A460, E461, L462, E463, R464, G465, E466, T467, T468, N469, M523, S527 и Y531. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько остатков выбраны, но без ограничений, из группы, состоящей из A20, N21, Y22, Q23, R271, W278, F299, V302 и S408. Настоящее изобретение также относится к выделенному варианту изопренсинтазы, а именно, к изопренсинтазе пуэрарии волосистой, которая содержит замену A20G и/или S408D и имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения вариант изопренсинтазы обладает по меньшей мере одним улучшенным свойством по сравнению с изопренсинтазой дикого типа. В некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно улучшенное свойство выбрано, но без ограничений, из группы, состоящей из удельной активности (способности продуцировать изопрен из диметилаллилдифосфата) и растворимости. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения полинуклеотидная последовательность содержится в плазмиде. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения полинуклеотидная последовательность интегрирована в хромосому клетки-хозяина. В некоторых вариантах осуществления изобретения хозяина выбирают, но без ограничений, из группы, состоящей из грамположительных бактериальных клеток, грамотрицательных бактериальных клеток, клеток нитчатых грибов и дрожжевых клеток. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения хозяина выбирают, но без ограничений, из группы, состоящей из Escherichia sp. (E. coli), Panteoa sp. (P. citrea), Bacillus sp. (B. subtilis), Yarrowia sp. (Y. lipolytica) и Trichoderma (T. reesei). В некоторых вариантах осуществления изобретения клетки-хозяева культивируют в среде, включающей источник углерода, выбранный, но без ограничений, из группы, состоящей из глюкозы, глицерола, глицерина, дигидроксиацетона, дрожжевого экстракта, биомассы, мелассы, сахарозы и масла. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин дополнительно включает гетерологичную или природную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид IDI и/или гетерологичную или природную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид DXS, иногда в комбинации с нативным полипептидом пути DXP (например, в результате экспрессии dxs и idi в E. coli в комбинации с нативным полипептидом пути DXP). Альтернативно, весь путь экспрессии DXP (фиг.15) может осуществляться на плазмиде, либо этот полинуклеотид может интегрироваться на хромосоме в качестве оперона под контролем одного промотора, регулирующего экспрессию, или нескольких промоторов различной длины (например, GI 1.20, GI 1.5 или GI 1.6), регулирующими экспрессию одного или нескольких отдельных генов. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин дополнительно содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид IDI и полипептид DXS, и в некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения один вектор кодирует вариант изопренсинтазы, полипептид IDI и полипептид DXS. В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид пути MVA (например, полипептид пути MVA в Saccharomyces cerevisia или Enterococcus faecalis). В некоторых вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин дополнительно включает одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид пути MVA и полипептид DXS, и в некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения один вектор кодирует вариант изопренсинтазы, полипептид пути MVA и полипептид DXS. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения клетка-хозяин дополнительно включает одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид DXS, полипептид IDI или один или несколько остальных полипептидов пути DXP, и полипептид пути MVA. В некоторых вариантах осуществления изобретения вектор дополнительно включает селективный маркер (например, резистентную к антибиотику нуклеиновую кислоту). Настоящее изобретение также относится к способам продуцирования изопрена, включающим: (a) культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для продуцирования изопрена, и (b) продуцирование изопрена. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные способы дополнительно включают (с) выделение изопрена. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанные способы дополнительно включают (d) полимеризацию изопрена. Настоящее изобретение также относится к способам продуцирования изопренсинтазы, включающим: (а) получение: (i) клеток-хозяев и (ii) нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант изопренсинтазы, функционально присоединенной к промотору, где указанный вариант изопренсинтазы содержит замену в положении, соответствующем положению одного или нескольких (одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти) остатков изопренсинтазы пуэрарии волосистой, включающей аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2; (b) контактирование клеток-хозяев с нуклеиновой кислотой с продуцированием трансформированной клетки-хозяина; и (c) культивирование трансформированных клеток-хозяев в условиях, подходящих для продуцирования изопренсинтазы.

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к выделенным вариантам изопренсинтазы тополя. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный вариант усечен у N-концевой части изопренсинтазы. В другом варианте осуществления изобретения указанный вариант изопренсинтазы, по сравнению с полноразмерной изопренсинтазой, обладает повышенной удельной активностью. В другом варианте осуществления изобретения изопренсинтазой является изопренсинтаза P. alba с последовательностью SEQ ID NO:120. В другом варианте осуществления изобретения указанный вариант выбран из группы, состоящей из: варианта MEA (SEQ ID NO:122), варианта MSV (SEQ ID NO:124), варианта MVS (SEQ ID NO:126), варианта MTE (SEQ ID NO:128), варианта MNV (SEQ ID NO:130). В другом варианте осуществления изобретения указанным вариантом является вариант MEA (SEQ ID NO:122). В другом варианте осуществления изобретения указанный вариант выбран из группы, состоящей из: варианта TRC (-3) (SEQ ID NO:136), варианта TRC (-4) (SEQ ID NO:138), варианта TRC (-5) (SEQ ID NO:140), варианта TRC (-6) (SEQ ID NO:142) и варианта TRC (-7) (SEQ ID NO:144). В другом варианте осуществления изобретения указанным вариантом является вариант MET изопренсинтазы P. tremuloides (SEQ ID NO:146). В другом варианте осуществления изобретения указанным вариантом является вариант MET изопренсинтазы P. trichocharpa (SEQ ID NO:148).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к выделенным вариантам изопренсинтазы тополя, где указанный вариант содержит замену одного или нескольких аминокислотных остатков, присутствующих в изопренсинтазе дикого типа, и где указанный вариант изопренсинтазы обладает повышенной изопренсинтазной активностью по сравнению с активностью изопренсинтазы дикого типа. В одном из вариантов осуществления изобретения повышенная изопренсинтазная активность характеризуется более быстрым ростом клеток-хозяев, содержащих изопреновый вариант, в присутствии диметилаллилпирофосфата (DMAPP), по сравнению с ростом клетки-хозяина, содержащей родительскую изопренсинтазу. В другом варианте осуществления изобретения изопренсинтазой является изопренсинтаза P. alba SEQ ID NO:120. В другом варианте осуществления изобретения указанный вариант содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из V10M, F12S, T15A, E18G, V58I, V58F, L70Q, L70V, L70T, T71P, V79L, E89D, G94A, S119F, F120L, G127R, E175V, T212I, S257A, R262G, A266G, F280L, N297K, F305L, L319M, E323K, A328T, D342E, A359T, K366N, E368D, L374M, S396T, V418S, K438N, H440R, T442I, T442A, I449V, A469S, K500R, K505Q, G507S, S509N, F511Y и N532K. В другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере одной аминокислотной заменой является замена L70R. В другом варианте осуществления изобретения указанный вариант содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из G127R/F511Y, L70Q/G94A/R262G/F305L, F12S/T15A/E18G/N297K, S396T/T442I, V10M/E323K, F120L/A266G, K438N/K500R, V79L/S509N, E175V/S257A/E368D/A469S, T71P/L374M, F280L/H440R, E89D/H440R, V58F/A328T/N532K, S119F/D342E/I449V и K366N/G507S.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к кристаллической форме полипептида, содержащего аминокислотные остатки SEQ ID NO:120 (фиг.19).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам продуцирования изопрена, включающим: (a) получение клеток-хозяев, содержащих экспрессионный вектор, который включает полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант изопренсинтазы, и (b) культивирование клеток-хозяев в условиях, подходящих для продуцирования изопрена. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ дополнительно включает (с) выделение изопрена. В другом варианте осуществления изобретения указанный способ дополнительно включает (d) полимеризацию изопрена.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам детектирования изопренсинтазной активности, включающим: (a) культивирование клеток-хозяев, содержащих экспрессионный вектор, в условиях, подходящих для продуцирования варианта изопренсинтазы; (b) лизис клеток-хозяев с использованием буфера для лизиса, содержащего лизоцим, с получением клеточного лизата; и (c) детектирование изопренсинтазной активности в клеточном лизате путем измерения уровня продуцирования изопрена из диметилаллилдифосфата (DMAPP). В одном из вариантов осуществления изобретения клетку-хозяина выбирают из группы, состоящей из грамположительных бактериальных клеток, грамотрицательных бактериальных клеток, клеток нитчатых грибов и дрожжевых клеток. В другом варианте осуществления изобретения клетку-хозяина выбирают из группы, состоящей из Escherichia sp. (E. coli), Panteoa sp. (P. citrea), Bacillus sp. (B. subtilis), Yarrowia sp. (Y. lipolytica) и Trichoderma (T. reesei). В другом варианте осуществления изобретения клетку-хозяина культивируют в среде, включающей источник углерода, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, глицерола, глицерина, дигидроксиацетона, дрожжевого экстракта, биомассы, мелассы, сахарозы и масла.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим гетерологичную полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант изопренсинтазы, функционально присоединенную к промотору, где указанный вариант изопренсинтазы содержит замену в положении, соответствующем положениям одного или нескольких (одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти) остатков изопренсинтазы тополя. В одном из вариантов осуществления изобретения изопренсинтазой является изопренсинтаза P. alba с последовательностью SEQ ID NO:120. В другом варианте осуществления изобретения указанный вариант выбран из группы, состоящей из: варианта MEA (SEQ ID NO:122), варианта MSV (SEQ ID NO:124), варианта MVS (SEQ ID NO:126), варианта MTE (SEQ ID NO:128), варианта MNV (SEQ ID NO:130). В другом варианте осуществления изобретения указанный вариант выбран из группы, состоящей из: варианта TRC (-3) (SEQ ID NO:136), варианта TRC (-4) (SEQ ID NO:138), варианта TRC (-5) (SEQ ID NO:140), варианта TRC (-6) (SEQ ID NO:142) и варианта TRC (-7) (SEQ ID NO:144). В другом варианте осуществления изобретения указанным вариантом является вариант MET изопренсинтазы P. tremuloides (SEQ ID NO:146). В другом варианте осуществления изобретения указанным вариантом является вариант MET изопренсинтазы P. trichocharpa (SEQ ID NO:148). В другом варианте осуществления изобретения указанный вариант содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из V10M, F12S, T15A, E18G, V58I, V58F, L70Q, L70V, L70T, T71P, V79L, E89D, G94A, S119F, F120L, G127R, E175V, T212I, S257A, R262G, A266G, F280L, N297K, F305L, L319M, E323K, A328T, D342E, A359T, K366N, E368D, L374M, S396T, V418S, K438N, H440R, T442I, T442A, I449V, A469S, K500R, K505Q, G507S, S509N, F511Y и N532K. В другом варианте осуществления изобретения по меньшей мере одной аминокислотной заменой является замена L70R. В другом варианте осуществления изобретения указанный вариант содержит одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из G127R/F511Y, L70Q/G94A/R262G/F305L, F12S/T15A/E18G/N297K, S396T/T442I, V10M/E323K, F120L/A266G, K438N/K500R, V79L/S509N, E175V/S257A/E368D/A469S, T71P/L374M, F280L/H440R, E89D/H440R, V58F/A328T/N532K, S119F/D342E/I449V и K366N/G507S. В другом варианте осуществления изобретения полинуклеотидная последовательность содержится в плазмиде. В другом варианте осуществления изобретения полинуклеотидная последовательность интегрирована в хромосому клетки-хозяина. В другом варианте осуществления изобретения клетку-хозяина выбирают из группы, состоящей из грамположительных бактериальных клеток, грамотрицательных бактериальных клеток, клеток нитчатых грибов и дрожжевых клеток. В другом варианте осуществления изобретения хозяина выбирают из группы, состоящей из Escherichia sp. (E. coli), Panteoa sp. (P. citrea), Bacillus sp. (B. subtilis), Yarrowia sp. (Y. lipolytica) и Trichoderma (T. reesei). В другом варианте осуществления изобретения клетки-хозяева культивируют в среде, включающей источник углерода, выбранный из группы, состоящей из глюкозы, глицерола, глицерина, дигидроксиацетона, дрожжевого экстракта, биомассы, мелассы, сахарозы и масла. В другом варианте осуществления изобретения клетка-хозяин дополнительно включает гетерологичную или природную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид IDI и/или гетерологичную или природную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид DXS, необязательно в комбинации с природным полипептидом пути DXP. В другом варианте осуществления изобретения клетка-хозяин дополнительно содержит одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид IDI и полипептид DXS. В другом варианте осуществления изобретения клетка-хозяин содержит один вектор, кодирующий вариант изопренсинтазы, полипептид IDI и полипептид DXS. В другом варианте осуществления изобретения клетка-хозяин дополнительно содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид пути MVA, выбранный из группы, состоящей из полипептида пути MVA в Saccharomyces cerevisia и Enterococcus faecalis. В другом варианте осуществления изобретения клетка-хозяин дополнительно включает одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид пути MVA и полипептид DXS, где один вектор кодирует вариант изопренсинтазы, полипептид пути MVA и полипептид DXS. В другом варианте осуществления изобретения клетка-хозяин дополнительно включает одну или несколько нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид DXS, полипептид IDI или один или несколько остальных полипептидов пути DXP, и полипептид пути MVA.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам продуцирования изопрена, включающим: (a) культивирование клеток-хозяев, содержащих гетерологичную полинуклеотидную последовательность, кодирующую вариант изопренсинтазы, функционально присоединенную к промотору, где указанный вариант изопренсинтазы содержит замену в положении, соответствующем положению одного или нескольких (одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти) остатков изопренсинтазы тополя в условиях, подходящих для продуцирования изопрена, и (b) продуцирование изопрена. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ дополнительно включает (с) выделение изопрена. В другом варианте осуществления изобретения указанный способ дополнительно включает (d) полимеризацию изопрена.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способам продуцирования изопренсинтазы, включающим: (а) получение: (i) клеток-хозяев и (ii) нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант изопренсинтазы, функционально присоединенной к промотору, где указанный вариант изопренсинтазы содержит замену в положении, соответствующем положению одного или нескольких (одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти) остатков изопренсинтазы P. alba SEQ ID NO:120; (b) контактирование клеток-хозяев с нуклеиновой кислотой с продуцированием трансформированной клетки-хозяина; и (c) культивирование трансформированных клеток-хозяев в условиях, подходящих для продуцирования изопренсинтазы.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена кодирующая последовательность (SEQ ID NO:1) изопренсинтазы пуэрарии волосистой (Pueraria montana), оптимизированной по кодонам для экспрессии в Escherichia coli.

На фиг.2 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) изопренсинтазы пуэрарии.

На фиг.3 представлена кодирующая последовательность (SEQ ID NO:6) изопренсинтазы тополя (Populus alba x tremula), оптимизированной по кодонам для экспрессии в Escherichia coli.

На фиг.4 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:7) изопренсинтазы тополя (Populus alba x tremula).

На фиг.5 представлена модель гомологии изопренсинтазы пуэрарии волосистой, имеющей цистеиновые остатки, отмеченные как заштрихованные молекулы.

На фиг.6 представлена модель гомологии изопренсинтазы тополя, имеющей цистеиновые остатки, отмеченные как заштрихованные (темно-серым) молекулы. Кроме того, цистеиновые остатки модели изопренсинтазы пуэрарии, представленные на фиг.5, накладываются на модели изопренсинтазы тополя и отмечены как молекулы, заштрихованные (светло-серым).

На фиг.7 представлены кривые зависимости роста от времени для цистеиновых мутантов IspS пуэрарии волосистой, описанных в примере 5.

На фиг.8 проиллюстрирован ДСН-ПААГ-анализ цистеиновых мутантов IspS пуэрарии, выделенных из лизированных клеток. Клеточный осадок и фракции супернатанта получали путем центрифугирования.

На фиг.9 представлена карта плазмиды MCM93 (pCR2.1-Kudzu).

На фиг.10 представлена нуклеотидная последовательность плазмиды MCM93 (SEQ ID NO:22).

На фиг.11 представлена карта плазмиды pET24D-Kudzu.

На фиг.12 представлена нуклеотидная последовательность плазмиды pET24D-Kudzu (SEQ ID NO:23).

На фиг.13 проиллюстрирован ДСН-ПААГ-анализ телец включения, содержащих изопренсинтазу пуэрарии. Дорожка M содержит маркеры молекулярной массы, и другие дорожки содержат возрастающие количества очищенного препарата телец включения. Как было оценено, изопренсинтаза пуэрарии волосистой имеет чистоту >90%.

На фиг.14 представлены графики, иллюстрирующие изопренсинтазную активность членов библиотеки оценок сайтов пуэрарии волосистой (SEL) для положений Y22, A20 и S408. Большинство из этих членов обнаруживали в высокой степени низкую активность, тогда как члены с консервативными заменами обнаруживали меньшее снижение активности. На панели A представлены результаты анализа для членов библиотеки Y22 в сравнении с независимыми образцами дикого типа (обозначены WT в кружочках). На панели В представлены результаты анализа, проведенные для членов библиотеки A20 в сравнении с образцами дикого типа (обозначены WT в кружочках). На панели С представлены результаты анализа, проведенные для членов библиотеки S408, указывающие то, что член S408D имеет активность, которая в 1,5-2 раза превышает среднюю активность контрольных образцов дикого типа.

На фиг.15 представлены метаболические пути MVA и DXP для изопрена (на основе публикации F. Bouvier et al., Progress in Lipid Res. 44: 357-429, 2005). Нижеследующее описание включает альтернативные названия для каждого полипептида в путях метаболизма, и работы, в которых описан анализ для измерения активности указанного полипептида (каждая из указанных работ во всей своей полноте введена в настоящее описание посредством ссылки, в частности, такие их разделы, которые относятся к анализам на полипептидную активность полипептидов, участвующих в путях MVA и DXP). Мевалонатный путь: AACT; ацетил-CoA-ацетилтрансфераза, MvaE, EC 2.3.1.9. Анализ: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; HMGS; гидроксиметилглутарил-CoA-синтаза, MvaS, EC 2.3.3.10. Анализ: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-гидрокси-3-метилглутарил-CoA-редуктаза, MvaE, EC 1.1.1.34. Анализ: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; MVK; мевалонат-киназа, ERG12, EC 2.7.1.36. Анализ: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; фосфомевалонат-киназа, ERG8, EC 2.7.4.2, Анализ: MoI. Cell. Biol, 11:620-631, 1991; DPMDC; дифосфомевалонат-декарбоксилаза, MVD1, EC 4.1.1.33. Анализ: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI; изопентилдифосфат-дельта-изомераза, IDI1, EC 5.3.3.2. Анализ: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. Путь DXS: DXS; l-дезоксиксилулозо-5-фосфатсинтаза, dxs, EC 2.2.1.7. Анализ: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-дезокси-D-ксилулозо-5-фосфатредуктоизомераза, dxr, EC 2.2.1.7. Анализ: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4-дифосфоцитидил-2C-метил-D-эритритолсинтаза, IspD, EC 2.7.7.60. Анализ: PNAS, 97: 6451-6456, 2000; CMK; 4-дифосфоцитидил-2-C-метил-D-эритритолкиназа, IspE, EC 2.7.1.148. Анализ: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS; 2C-метил-D-эритритол-2,4-циклодифосфатсинтаза, IspF, EC 4.6.1.12. Анализ: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS; 1-гидрокси-2-метил-2-(E)-бутенил-4-дифосфатсинтаза, ispG, EC 1.17.4.3. Анализ: J. Org. Chem., 70:9168-9174, 2005; HDR; 1-гидрокси-2-метил-2-(E)-бутенил-4-дифосфатредуктаза, IspH, EC 1.17.1.2. Анализ: JACS, 126:12847-12855, 2004.

На фиг.16 представлена карта pDu27.

На фиг.17 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:118) 6Xhis-меченной по N-концу IspS P. alba в pDu27.

На фиг.18 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:119) плазмиды pDu27.

На фиг.19 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:120) полноразмерной IspS P. alba в pET24a. Подчеркнутые остатки указывают на положения N-концевых усечений в IspS в плазмидах pDu39-pDu43.

На фиг.20 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:121) плазмиды pET24a P. alba.

На фиг.21 представлены изображения очищенных IspS, полученных в виде «дублета» с низкой молекулярной массой, как показал анализ, проводимый с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.

На фиг.22 показаны триптические пептиды, идентифицированные с помощью масс-спектрометрии.

На фиг.23 представлены карты pDu40, pDu41, pDu42 и pDu43, имеющих N-концевые усечения IspS P. alba.

На фиг.24 представлена карта Pdu39, которая представляет собой немеченый вариант MEA pET24a-P. alba (в штамме MD09-173).

На фиг.25 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:122) усеченного варианта «MEA» IspS P. alba в pDu39.

На фиг.26 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:123) плазмиды pDu39.

На фиг.27 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:124) усеченного варианта «MSV» IspS P. alba в pDu41.

На фиг.28 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:125) плазмиды pDu41 (pET24a-P.alba, немеченый вариант (MSV)).

На фиг.29 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:126) усеченного варианта «MSV» IspS P. alba в pDu43.

На фиг.30 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:127) плазмиды pDu43 (pET24a-P.alba, немеченый вариант (MVS)).

На фиг.31 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:128) усеченного варианта «MTE» IspS P. alba в pDu42.

На фиг.32 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:129) плазмиды pDu42 (pET24a-P.alba, немеченый вариант (MTE)).

На фиг.33 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:130) усеченного варианта «MNV» IspS P. alba в pDu40.

На фиг.34 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:131) плазмиды pDu40 (pET24a-P.alba, немеченый вариант (MNV)).

На фиг.35 представлены карты MD09-161 и MD09-163, C-концевых TEV, 6XHis-меченных вариантов IspS.

На фиг.36 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:132) MEA(+)TEV P. alba в MD09-163.

На фиг.37 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:133) плазмиды MD09-163 (pET24a-P.alba MEA(+)TEV. Область CDS подчеркнута, сайт протеазы TEV выделен жирным шрифтом.

На фиг.38 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:134) FL(+)TEV P. alba в MD09-161.

На фиг.39 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:135) плазмиды MD09-161 (pET24a-P.alba FL(+)TEV. Область CDS подчеркнута, сайт протеазы TEV выделен жирным шрифтом.

На фиг.40 представлен график, иллюстрирующий удельные активности MD09-167, полноразмерного варианта (FL), MD09-165 и усеченной изопренсинтазы (MD09-173). Реакции проводили при 30°С в течение 15 минут в растворе, содержащем 100 мМ триса, 100 мМ NaCl, 50 мМ MgCl₂, 5 мМ DMAPP и 2,5-4,5 мкг изопренсинтазы в супернатанте лизата целых клеток.

На фиг.41 представлены графики, иллюстрирующие скорость/[E] для [DMAPP]. «×» означают MD09-173, кружки означают MD09-167, ромбы означают MD09-165, и квадраты означают полноразмерную IspS.

На фиг.42 представлен график, иллюстрирующий изопренсинтазную активность для [DMAPP]. «×» означают данные, полученные с использованием усеченной изопренсинтазы MD09-173. Кружки означают данные, полученные с использованием изопренсинтазы MD09-167. Ромбы означают данные, полученные с использованием изопренсинтазы MD09-165. Квадраты означают данные, полученные с использованием полноразмерной изопренсинтазы. Каждый набор данных был получен с тремя повторами от независимо выращенных культур.

На фиг.43 представлены графики, иллюстрирующие влияние изменения k_cat и K_M и K_i на скорость реакции. На панели А дорожка 1 представляет кривую скорости реакции усеченной